다중 모드 비선형 광학 현미경을 사용한 나노 입자의 세포 흡수의 생체 분자 이미징

당사의 프로토콜은 다중 모드, 비선형, 광학 현미경을 제시하고 이를 적용하여 암세포에서 금 나노입자의 화학적으로 특이적인 이미징을 수행합니다. 우리 이미징 시스템의 주요 장점은 세포 구조와 금 나노 입자의 생체 분자 대비를 다중 모드 방식으로 검토하는 데 사용할 수 있다는 것입니다. 시작하려면 리모컨 상자를 제외한 모든 장비의 플러그를 켜십시오.

그런 다음 상자 뒷면을 켜고 컨트롤 박스의 리모컨 표시등이 파란색으로 켜진 후 작동 시작을 누릅니다. 그런 다음 레이저 스캐닝 현미경의 PC를 켜고 컨포칼 현미경 소프트웨어를 실행합니다. 그런 다음 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 현미경의 광 경로를 확인하고 터치 스크린이나 리모컨 노브 또는 컴퓨터 소프트웨어를 통해 초점을 제어합니다.

소프트웨어에서 확대/축소, 픽셀 단위의 이미지 크기 및 픽셀 체류 시간을 포함하여 원하는 이미지 설정을 선택하고 픽셀 체류 시간이 통합 시간보다 큰지 확인합니다. 레이저 빔을 샘플에 집중시키는 물 침지 대물렌즈 위와 이미징을 위해 응축기와 샘플 사이에 증류수 방울을 놓습니다. 그런 다음 응축기의 높이를 샘플 위 약 1mm로 조정하여 최대 광량을 수집하고 이동식 마운트에 놓인 SRS 감지기를 빔 경로 밖으로 이동하여 백색광을 사용하여 샘플에 초점을 맞춥니다.

소프트웨어 설정을 사용하여 펌프 빔을 선택하고 레이저 파장을 CH 진동의 경우 802나노미터, 아미드 I 피크의 경우 898나노미터로 변경하여 라만 시프트의 큰 변화를 설명합니다. 라만 시프트에서 작은 조정을 달성하려면 원고에 설명된 대로 SFTRU 장치의 지연 단계를 스캔합니다. 하이퍼스펙트럼 데이터 세트의 경우 트리거 탭을 선택하고 ttl 트리거로 시작을 클릭한 다음 모든 프레임 트리거를 선택합니다.

그런 다음 계열 탭에서 시계열을 켜고 Z 계열을 해제합니다. 또한 ATM 소프트웨어의 단계 수와 일치하도록 시계열의 프레임 수를 설정합니다. 다음으로 ATM 소프트웨어의 실행 탭으로 이동하여 CH의 지연 단계 위치를 90.25 및 92.25로 설정하는 반면, 89 및 91의 아미드 I 영역의 경우 초 분광 스캔의 시작 및 중지 위치에 해당하는 밀리미터 단위로 단계 수가 컴퓨터 소프트웨어의 프레임 수와 일치하는지 확인합니다.

올바른 설정을 확인한 후 먼저 Acquire 으로 이동 한 다음 스캔 시작을 클릭하여 컴퓨터 소프트웨어에서 하이퍼 스펙트럼 스택을 시작하십시오. 그런 다음 ATM 소프트웨어에서 시작을 클릭하면 선택한 시작 위치와 중지 위치 사이의 지연 단계 위치가 점진적으로 증가하여 일련의 이미지 수집이 시작됩니다. 그런 다음 서로 다른 지연 단계 위치에서 이미지의 시계열을 가져와 초분광 스캔을 생성합니다.

아날로그 장치를 사용하여 SFTRU 시스템과 ttl 신호를 송수신하여 이미지 획득 및 지연 단계의 이동을 동기화합니다. CH 진동 영역의 이미징을 amide I 진동 영역으로 전환하려면 레이저 소프트웨어의 펌프 파장을 802나노미터에서 898나노미터로 변경합니다. 또한 ATM 소프트웨어의 Stokes 분산 설정을 30mm에서 5mm로 변경합니다.

미러 마운트의 하단 손잡이를 조정하여 미러 각도를 증분량으로 변경하여 SFTRU 상자 내부의 펌프 빔 분산 경로에서 미러를 약간 조정합니다. 폴리스티렌 마이크로스피어의 화학적 선택성을 검증하기 위해, 초분광 자극 라만 산란 및 자발적인 라만 스펙트럼을 기록하였다. 스펙트럼은 상대적 강도에서 관찰된 차이를 제외하고는 동일하였다.

4T1 암세포의 자극 된 라만 산란 이미징은 지질, 단백질 및 DNA 생체 분자의 탄소 - 수소 스트레칭 진동 밴드에 해당하는 2, 852, 2, 930 및 2, 968 파수에서 수행되었다. 암세포에서 나노 입자 분포를 조사하기 위해 금 나노 입자가 투여 된 4T1 암세포의 다중 모드 이미징을 수행했습니다. 획득된 자극된 라만 산란 이미지는 CH2 및 CH3 채널, LysoTracker 형광 프로브 및 오프-공명 자극된 라만 산란 채널에 대해 획득되었습니다.

기억해야 할 가장 중요한 것은 레이저 소프트웨어에서 진동 영역, 펌프 기준 및 프로토콜 중 Stokes 분산 설정을 변경하는 것입니다. 이 시스템은 광학 정렬에 영향을 주지 않고 펨토초에서 피코초 영역으로 쉽게 전환할 수 있습니다. 이 기능을 통해 다광자 코히어런트 라만 산란 및 펌프 프로브 분광법과 그 응용을 수행할 수 있습니다.

이 다중 모드 이미징 플랫폼은 나노 의학에 대한 새로운 통찰력을 제공하고 세포, 조직 및 금 나노 입자의 분자 이미징을위한 길을 열어줍니다.