다중 매개 변수 형광 활성화 된 셀 정렬하여 인간의 림프 내피 세포의 분리

본 절차의 전체적인 목표는 형광 활성 세포 분류법(fluorescence activated cell sorting)을 사용하여 인간 림프관 기형 및 포피의 림프관을 구성하는 고순도의 림프 내피 세포를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 환자의 조직 샘플을 효소로 분해함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 단일 세포 현탁액을 배양하여 림프 내피 세포의 수를 증식시킵니다.

샘플 내에서 세포들을 관심 있는 세포 표면 마커에 대한 항체로 라벨링한 후, 다중 파라미터 형광 활성 세포 분별법(fluorescence activated cell sorting)을 사용하여 분리합니다. 최종적으로, 포피 및 림프관 기형 유래 림프 내피 세포는 이후의 하위 분석을 위해 세포 배양을 통해 증식시킬 수 있습니다.

기존 방법 대비 이 기술의 주요 장점은 형광 활성 세포 분별법(fluorescence activated cell sorting)을 통해 99% 이상의 순도로 세포를 얻을 수 있어, 오염된 세포의 과성장으로 인해 림프관 내피세포가 소실되는 문제를 방지할 수 있다는 점입니다. 우선 항생제 및 항진균제 용액이 첨가된 배지 10 mL가 들어 있는 50 mL 튜브의 무게를 잽니다. 그다지 림프관 기형 조직이나 피부 샘플을 튜브에 옮긴 후, 튜브의 무게를 다시 측정하여 조직의 무게를 결정합니다.

다음으로, 2등급 생물안전작업대 내에서 멸균 핀셋을 사용하여 조직과 배지를 100 mm 조직 배양 접시로 옮기고 멸균 가위를 사용하십시오. 마지막으로, 조직을 1 mm³ 크기의 조각으로 잘게 다집니다. 그런 다음 이 조각들을 10 mL의 신선한 항생제-항진균제 배지가 들어 있는 50 mL 튜브로 옮깁니다.

튜브를 몇 번 돌려 조직을 재현탁한 후, 샘플을 원심 분리합니다. 상층액을 제거한 다음, 잘게 다진 조직 100 mg당 미리 데워둔 소화액 1 mL를 첨가하고, 림프관 내피세포의 성공적인 농축을 위해 37 °C 인큐베이터에서 200 RPM으로 지속적으로 흔들어주며 배양합니다. 세포가 분리 과정에서 생존할 수 있도록 콜라게나제 및 DNase 반응에 충분히 노출된 시점을 정확히 파악하는 것이 매우 중요합니다.

이는 조직 소화 과정을 세심하게 모니터링하고, 대부분의 조직이 미세한 파편으로 소화되었을 때 반응을 중단함으로써 달성됩니다. 배양이 끝나면 거의 모든 조직이 작은 파편으로 소화되었는지 확인하고, 조직 슬러리를 70 micron 체로 걸러 멸균된 50 milliliter 튜브에 담습니다. 이제 고무 플런저가 달린 3 milliliter 주사기 피스톤을 사용하여 세포외 기질의 흔적만 남을 때까지 남은 조직을 갈아줍니다.

그런 다음 해리 효소 배지와 동일한 부피의 혈관 내피 세포 배지로 세포 스트레이너를 세척하고, 세포를 다시 원심 분리합니다. 검체 크기에 따라 최대 20 milliliters의 혈관 내피 세포 배지로 펠렛을 현탁합니다. 그 후 세포 수를 측정하여, 피브로넥틴이 미리 코팅된 150 square centimeter 플라스크에 2*10⁶개의 세포를 혈관 내피 세포 배지 최종 부피 20 milliliters로 분주하여 하룻밤 동안 배양합니다.

다음 날 아침, 항생제-항진균제 용액이 첨가된 PBS로 세 번 헹구어 결합되지 않은 세포들을 씻어냅니다. 그 후 림프관 내피세포의 수를 늘리기 위해 신선한 내피세포 배지를 세포에 추가하고, 배양액이 약 80%confluent가 될 때까지 5~7일 동안 배양합니다. 다중 파라미터 유세포 분석기(fluorescence activated cell sorting)를 이용한 분리를 위해 세포를 염색합니다.

먼저, 세포 배지를 제거하고 PBS로 세포를 3회 세척합니다. 그다음 37°C에서 5~7분간 배양한 후 박리 용액 7 mL를 첨가합니다. 해리된 세포를 회수하고, 내피세포 배지 3배 부피를 사용하여 효소를 불활성화한 다음 세포 현탁액을 멸균 튜브로 옮깁니다.

세포를 세 번 원심분리하며, 두 번째와 세 번째 원심분리 후에는 펠렛을 5 mL의 PBS로 세척합니다. 펠렛을 5 mL의 신선한 PBS에 재현탁하고, trypan blue 배제법을 통해 생존 세포 수를 측정합니다. 세포 수 측정 후,

세포를 무균적으로 유세포 분석 염색 튜브로 옮기고, 원심 분리하여 비특이적 결합을 차단합니다. 세포를 5%F-B-S-P-B-S에 재현탁하고 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다. 차단 원심 분리 후, 세포의 상층액을 제거하고 다시 현탁합니다.

펠릿을 CD 34, CD 31 potanin 및 VEGF receptor three 항체 칵테일에 현탁합니다. 얼음 위에서 20분간 반응시킨 후, 2 mL의 F-B-S-P-B-S로 세포를 3회 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하고 다시 현탁합니다. 펠릿을 얼음 위에서 F-B-S-P-B-S 용액에 희석된 300 µL의 propidium iodide에 현탁합니다.

마지막으로, 정제된 인간 림프관 내피세포를 다매개변수 형광 활성 세포 분류 장치로 분류합니다. 그 다음, 분류된 세포를 원심 분리하고 펠렛을 세포 배양 접종에 적합한 배지로 재현탁합니다. 여기에서는 podoplanin 항체로 표지된 정상 인간 림프관과 림프관 기형 혈관이 나타나 있으며, 인간 림프관 기형 혈관 내에서 뚜렷한 확장과 상당한 내강 크기 변화가 관찰됨에 유의하십시오.

실제로, 분획하지 않은 시료를 대상으로 초기 조직 소화 후 24시간 동안 배양하면 대부분의 림프관 기형에서 작은 크기의 미세낭성(microcystic) 구조와 큰 크기의 거대낭성(macrocystic) 비정상 낭성 구조가 모두 나타납니다. 세포 분리 후 추가로 24시간 동안 세포 배양을 진행하면 섬유아세포 유사 세포 및 평활근 세포 외에도 뚜렷한 내피세포 군집이 관찰될 수 있습니다. 또한, CD 34 저발현, CD 31 양성, VEGF receptor three 양성, podo plane 양성 세포들이 배양 용기에 부착되어 있으며, 이 이미지들에서 관찰되는 것과 같은 전형적인 cobblestone 형태를 보입니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 형광 활성 세포 분리법(fluorescence activated cell sorting)을 사용하여 인간 림프관 기형 및 피부 림프관을 구성하는 림프관 내피세포를 고순도로 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 일차 인간 조직을 다루는 작업은 인체 건강에 해로운 감염원 등이 포함되어 있을 수 있어 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 장갑, 보호 안경 및 실험복 착용과 같은 표준 예방 조치를 준수해야 합니다.