다중 매개 변수 형광 활성화 된 셀 정렬하여 인간의 림프 내피 세포의 분리

이 프로토콜의 목표는 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS)를 사용하여 인간의 림프 기형 낭종 같은 선박과 포피 선을 긋고있는 림프 내피 세포를 분리하는 것입니다. 이후 세포 배양하고이 세포의 확장, 유전 단백체, 기능 및 세포 분화 연구를위한 실험적인 새로운 수준의 정교한을 허용합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 인간 림프 기형과 포피의 림프관을 감싸고 있는 고순도 림프 내피 세포를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 환자 조직 샘플을 효소로 분해하여 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 단일 세포 현탁액을 배양하여 림프 내피 세포의 수를 풍부하게 합니다.

샘플에서. 그런 다음 세포는 관심 세포 표면 마커에 대한 항체로 라벨링되고 다중 매개변수 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 분류됩니다. 궁극적으로, 포피와 림프 기형, 림프 내피 세포는 추가 다운스트림 분석을 위해 세포 배양에서 확장될 수 있습니다.

기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 형광 활성화 세포 분류 수율이 99% 이상의 세포를 수율하여 세포 오염에 의한 과잉 증식으로 인한 림프 내피 세포의 손실과 관련된 문제를 피할 수 있다는 것입니다. 10ml의 배지가 들어 있는 50ml 튜브의 무게를 측정하고 항생제 항진균 용액을 보충하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 림프 기형 또는 4개의 피부 샘플을 튜브로 옮기고 튜브의 무게를 다시 측정하여 조직의 무게를 측정합니다.

다음으로, 클래스 2 생물 안전 캐비닛에서 멸균 집게를 사용하여 멸균 가위를 사용하여 조직과 배지를 100mm 조직 배양 접시로 옮깁니다. 마지막으로 조직을 1입방밀리미터 조각으로 다집니다. 그런 다음 조각을 50ml 튜브에 새 항생제 항진균제 10ml가 들어 있습니다. 보통.

튜브를 몇 번 휘둘러 조직을 재현탁시킨 다음 샘플을 스핀다운합니다. 상층액을 제거한 후 다진 조직 100mg당 1ml의 예열 소화액을 첨가하고 섭씨 37도의 인큐베이터에서 200RPM으로 지속적으로 흔들어 조직을 배양하여 림프 내피 세포의 성공적인 농축을 위해 조직을 배양합니다. 세포가 콜라겐 분해 효소 및 dys 공간 반응에 충분히 노출되어 분리에서 살아남

이것은 조직 소화 과정을 주의 깊게 모니터링하고 대부분의 조직이 미세한 조각으로 소화되었을 때 반응을 중지함으로써 달성됩니다. 배양이 끝나면 거의 모든 조직이 작은 조각으로 소화되었는지 확인하고 70미크론 스트레이너를 통해 조직 슬러리를 멸균 50ml 튜브로 여과합니다. 이제 고무 플런저가 있는 3밀리리터 주사기 피스톤을 사용하여 세포외 기질의 작은 흔적만 관찰될 때까지 나머지 조직을 갈아냅니다.

그런 다음 세포 스트레이너를 해리 효소 배지의 부피와 동일한 부피의 내피 세포 배지로 세척하고 세포를 스핀 다운합니다. 표본 크기에 따라 최대 20ml의 내피 세포 배지에 펠릿을 현탁시킵니다. 그런 다음 종자를 계수한 후 하룻밤 배양을 위해 20ml의 내피 세포 배지의 최종 부피에 피브로넥틴이 사전 코딩된 150제곱센티미터 플라스크의 6개 세포에 10을 두 번 계산합니다.

다음 날 아침, 항생제 항진균 용액을 보충한 PBS를 세 번 헹구어 결합되지 않은 세포를 씻어냅니다. 그런 다음 림프 내피 세포의 수를 늘리기 위해 세포에 새로운 내피 세포 배지를 추가하고 배양액이 약 80% 융합될 때까지 5-7일 동안 배양물을 배양합니다. multi-parameter fluorescence activated cell sorting에 의한 분류를 위해 세포를 염색하기 위해.

먼저 세포 매체를 제거하고 PBS에서 세포를 세 번 씻습니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 5-7분 배양 후 7ml의 분리 용액을 추가합니다. 해리된 세포를 수확하고, 3가지 부피의 내피 세포 배지로 효소를 비활성화하고, 세포 현탁액을 멸균 튜브로 옮깁니다.

세포를 세 번 원심분리하여 펠릿을 5ml의 PBS로 세척하여 마지막 세척 후 두 번째 및 세 번째 탈수 합니다. 펠릿을 5ml의 신선한 PBS에 재현탁시키고 trian blue exclusion에 의해 생존 가능한 세포의 수를 계산합니다. 세포 계수 후.

세포를 유세포 분석 염색 튜브로 무균 방식으로 전달하고 세포를 스핀다운하여 비특이적 결합을 차단합니다. 세포를 5%F-B-S-P-B-S에 재현탁시키고 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다. 원심분리기를 차단한 후 세포는 상층액을 제거하고 소생시킵니다.

펠릿을 CD 34, CD 31 포타닌 및 VEGF 수용체 3 항체 칵테일에 현탁시킵니다. 얼음 위에서 20분 동안 사용한 후 2ml의 F-B-S-P-B-S로 세포를 세 번 세척하여 결합되지 않은 항체와 소생술을 제거합니다. 얼음 위에 F-B-S-P-B-S 용액에 300마이크로리터의 프로피듐 요오드화물에 펠릿을 현탁시킵니다.

마지막으로, 정제된 인간 림프 내피 세포를 다중 파라미터 형광 활성화 세포 분류 기기에서 분류합니다. 그런 다음 분류된 세포를 스핀다운하고 세포 배양 파스딩을 위해 적절한 배지에 펠릿을 현탁시킵니다. 여기서, 냄비 탈평면에 대한 항체로 표시된 정상적인 인간 림프 및 림프 기형 혈관은 인간 림프 기형 혈관 내에서 현저한 팽창과 상당한 내강 크기 변화에 주목합니다.

실제로, 대부분의 림프 기형은 초기 조직 소화 후 또는 미분획 샘플에서 24시간 배양 후 작거나 미세낭성 및 거대낭성 비정상 낭성 구조를 모두 포함합니다. 분류 후 섬유아세포와 평활근 세포와 같은 세포 외에도 뚜렷한 내피 세포 집락을 관찰할 수 있으며 세포 배양에서 추가로 24시간을 더 관찰할 수 있습니다. 그러나, 배양 용기에 부착된 CD 34, 낮은 CD 31 양성 VEGF 수용체 및 양성 세포는 이들 이미지에서 관찰된 전형적인 조약돌 형태를 나타낸다.

이 동영상을 시청한 후에는 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 인간 림프 기형과 전체 피부 림프관을 내벽으로 하는 림프 내피 세포를 고순도로 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 일차 인체 조직으로 작업하는 것은 인체 건강에 해로운 감염원을 포함할 수 있으므로 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑, 보호 안경 및 실험 가운 착용과 같은 표준 예방 조치를 취해야 합니다.