마우스 작은 장의 면역 시스템에서 세포를 분리

이 프로토콜의 전반적인 목표는 Peyer's patches 및 장간막 림프절을 포함한 장 유도 부위와 lamina, propria 및 상피를 포함한 effector 부위에서 림프구를 분리하는 것입니다. 이 방법은 위장 감염, 암 및 염증성 질환에 대한 면역 반응을 이해하는 것과 같은 점막 면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 소장의 별개의 구획에서 고도로 정제되고 생존 가능한 림프구를 최소한의 교차 구획 오염으로 분리할 수 있다는 것입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 장간막 림프절과 Peyer's patch를 식별 및 분리하고 최적의 수율을 위해 속도와 정밀도의 균형을 맞추는 것이 어렵기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 프로토콜을 시작하려면 이전에 마취된 마우스를 등에 눕히고 70% 에탄올을 분사합니다. 가위를 사용하여 정중선을 절개하고 피부와 복벽을 열어 복막강을 노출시킵니다.

다음으로 맹장을 찾아 집게를 사용하여 맹장을 부드럽게 잡아당깁니다. 겸자를 사용하여 소장을 조심스럽게 오른쪽으로 움직여 결장과 정렬된 장간막 림프절 또는 MLN 사슬 전체를 노출시킵니다. 맹장에 가장 가까운 사슬의 맨 아래 마디를 식별합니다.

한 세트의 집게를 사용하여 주변의 장간막 지방을 잡고 다른 집게 세트로 림프절 주변의 지방을 핀셋하여 MLN 사슬을 아래에서 위로 부드럽게 움직입니다. 그런 다음 수건에 수확 매체를 적시고 종이 타월 위에 MLN 체인을 놓습니다. 종이 타월에 체인을 굴려 장간막 지방을 제거하고 두 세트의 집게로 지방을 제거합니다.

이후 분리 단계를 위해 MLN을 저온 수확 매체에 넣습니다. 가위로 유문 괄약근 아래와 맹장 위의 소장을 자릅니다. 한 세트의 집게를 사용하여 회장에서 십이지장까지 장을 천천히 당겨 빼내고 다른 집게 세트를 사용하여 부착된 장간막 지방을 제거합니다.

수확 배지를 적신 종이 타월 위에 장을 놓고 두 세트의 집게로 남아 있는 장간막 지방을 떼어냅니다. 이 단계 동안 수확 배지를 주기적으로 적용하여 장을 촉촉하게 유지하십시오. 구부러진 가위로 장에서 Peyer의 패치를 제거하여 수집합니다.

소장에서 5-11개의 Peyer's patch를 수집합니다. 나중에 분리 단계를 위해 Peyer's 패치를 저온 수확 매체에 넣습니다. 겸자의 평평한 면을 사용하고 십이지장에서 회장 쪽으로 부드럽게 미끄러져 대변 내용물과 점액을 배출합니다.

이 단계를 한 번 반복하여 대부분의 점액을 제거합니다. 끝이 뭉툭한 가위를 사용하여 한쪽 끝이 뭉툭한 부분을 장에 삽입하고 십이지장에서 회장까지 세로로 열린 장을 자릅니다. 열린 장을 옆으로 2cm 조각으로 자릅니다.

나중에 분리 단계를 위해 25ml의 저온 수확 매체가 있는 50ml 원뿔형 튜브에 장 조각을 넣습니다. 3밀리리터 주사기의 플런저를 사용하여 70마이크로미터 세포 여과기를 통해 림프구를 부드럽게 해리하여 MLN에서 림프구를 분리합니다. 세포 여과기를 5ml의 저온 수확 배지로 세척합니다.

MLN 세포를 섭씨 4도에서 5분 동안 중력의 400배로 원심분리하여 펠릿화합니다. 그런 다음 세포 펠릿을 1밀리리터의 냉간 수확 배지에 재현탁합니다. 튜브를 10회 뒤집어 25ml의 저온 수확 매체로 소장 조각을 세 번 세척합니다.

장 조각이 가라앉고 상층액을 쏟아낼 때까지 기다립니다. 다음으로, 장 조각이 들어 있는 50ml 원뿔형 튜브에 예열된 디티오에리스리톨 또는 DTE 용액 20ml를 넣고 내용물을 교반 막대가 있는 50ml 실리콘 삼각 플라스크에 옮깁니다. 플라스크 외부에 있는 큰 자석을 사용하여 교반 막대를 잡고 조직과 용액을 50ml 원추형 튜브로 다시 옮깁니다.

그런 다음 10초 동안 최대 설정으로 튜브를 소용돌이칩니다. 70마이크로미터 세포 여과기를 통해 상층액을 새로운 50ml 원뿔형 튜브로 옮기고 조직 조각이 원래 튜브에 보관되도록 주의하십시오. 세포를 펠렛으로 만듭니다.

세포 펠릿을 10ml의 차가운 수확 매체에 재현탁하고 얼음 위에 보관하십시오. 장 조각이 들어 있는 20ml 원뿔형 튜브에 예열된 DTE 용액 20ml를 넣고 교반 막대가 들어 있는 50ml 실리콘 삼각 플라스크로 다시 옮깁니다. 플라스크 외부에 있는 큰 자석을 사용하여 교반 막대를 잡고 조직과 용액을 50ml 원추형 튜브로 다시 옮깁니다.

10초 동안 최대 설정으로 튜브를 소용돌이칩니다. 70마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 상층액을 첫 번째 DTE 처리의 상등액에서 세포가 들어 있는 튜브로 옮기고 세포를 원심분리합니다. 세포 펠릿을 8ml의 44% 밀도 구배 또는 DG 용액에 실온에서 재현탁합니다.

8밀리리터 44%DG 용액과 셀 현탁액을 17mm x 100밀리미터 14밀리리터 폴리프로필렌 원형 바닥 튜브로 옮깁니다. 5ml의 RT 67%DG 용액으로 셀을 깔아줍니다. 브레이크를 사용하지 않고 RT에서 25분 동안 1, 600배 중력에서 원심분리기.

생존 가능한 세포는 44% 및 67% 계면에서 담황색 코팅을 형성합니다. 진공 흡인으로 상단의 지방층을 제거합니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 계면에서 버피 코트를 수확하고 40 밀리리터의 저온 수확 매체가 들어있는 50 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다.

섭씨 4도에서 5분 동안 중력의 400배로 원심분리하여 세포를 펠릿화하고 세포 펠릿을 1밀리리터의 냉간 수확 배지에 재현탁시킵니다. 남은 장 조각에 25ml의 예열된 EDTA 용액을 첨가하여 장 조직 조각에서 상피 세포를 제거하고 내용물을 교반 막대가 있는 50ml 실리콘 삼각 플라스크에 넣고 저어줍니다. 교반 막대를 잡고 장 조각을 플라스크에 유지하면서 상층액을 조심스럽게 버립니다.

상피 세포 제거 단계를 한 번 더 반복합니다. 다음으로 실온 수확 매체 50ml를 넣고 자석으로 내용물을 짧게 저어줍니다. 그런 다음 장 조각을 가라앉히고 상층액을 조심스럽게 버립니다.

예열된 콜라겐분해효소 용액 30ml를 넣고 장 조각을 저어줍니다. 교반 후 소화된 조직과 상층액을 70마이크로미터 세포 여과기를 통해 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 3ml 주사기의 플런저를 사용하여 필터를 으깨서 나머지 조직 조각을 부드럽게 분리합니다.

10ml의 저온 수확 매체로 필터를 세척하고 세포를 펠릿화합니다. 회전 후 8ml의 주변 온도 44%DG 용액에 셀 펠릿을 재현탁합니다. 8밀리리터의 44% DG 용액 셀 현탁액을 새로운 70mm x 100mm 폴리프로필렌 원형 바닥 튜브로 옮깁니다.

5ml의 주변 온도 67%DG 용액을 밑에 깔고 구배를 원심분리합니다. 진공 흡인으로 상단의 지방층을 제거합니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 계면에서 버피 코트를 수확하고 40 밀리리터의 저온 수확 매체가 들어있는 50 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다.

마지막으로, 세포 펠릿을 1ml의 저온 수확 배지에 재현탁시킵니다. 각 장 면역 구획은 림프구 부분 집합의 고유한 구성으로 대표됩니다. MLN은 주로 알파 베타 T 세포로 구성되어 있는 반면 PP 림프구는 대부분 B 세포입니다.

LP 림프구 구성은 주로 알파 베타 T 세포와 B 세포로 구성됩니다. IEL은 주로 감마 델타 T 세포와 알파 베타 T 세포이며 기본적으로 B 세포가 없습니다. LP 및 IEL 구획 내의 CD8 알파 양성 알파 베타 T 세포는 CD8 알파 호모이머 또는 CD8 알파 베타 이종이량체를 발현한 반면, 유도 부위 CD8 알파 양성 알파 베타 T 세포는 주로 CD8 알파 베타 이종이량체를 발현했습니다.

IEL 구획에 있는 대부분의 감마 델타 T 세포는 CD8 알파를 발현하는 반면, MLN에서 발견되는 감마 델타 T 세포는 CD8 알파가 부족합니다. 이 절차를 시도하는 동안 장 구획 간의 오염을 제한하기 위해 조직 분리 단계에서 충분한 시간과 주의를 기울여야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 분리된 림프구는 생체 외 자극, 유세포 분석 및 추가 표현형 및 기능 분석을 위한 기타 기술을 적용할 수 있습니다.