Name: 마우스 작은 장의 면역 시스템에서 세포를 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: 배우세요 마우스 작은 장의 면역 시스템에서 림프구를 분리하는 방법을. Peyer's patches와 장간막 림프절, 점막층 및 상피에서 고순도 세포를 얻어 점막 면역학 연구에 활용하세요.

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B.S.S.는 NIH 그랜트 (R01 AI076457)와 스토 니 브 룩 대학에서 제공 하는 자금에 의해 지원 됩니다. Z.Q.는 NIH에 의해 지원 됩니다 (K12 GM102778) 부여.

모든 동물 실험 국립 건강 연구소의 지침에 따라 실시 하 고 스토 니 브 룩 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 했다.
주: 절차를 수행 하기 전에 모든 승인을 부여 됩니다 확인 하십시오.
1. 솔루션 준비
<ol><li>
HGPG (HEPES, L-글루타민, 페니실린/스, 그리고 gentamycin), 100 ×
	<ol>
<li>혼합 59.6 g HEPES (최종 500 mM) 14.6 g L-글루타민 (200 m m 최종), 1 × 106 U 페니실린 (2000 U/mL 최종), 1 g 스 (2 mg/mL 최종), 그리고 2.5 mg gentamicin (5 µ g/mL 최종). 추가 RPMI 1640 ~ 500 mL. 7.5 NaOH를 사용 하 여 pH를 조정 (조정, 전에 버퍼가 노란색/주황색 약 6.0 ph). 필터는 0.45 μ m 필터를 사용 하 여 소독. 약 수 그리고 저장소 또는 1 달까지 4 ° C에서 최대 1 년 동안-20 ° C에서.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
HEPES-중 탄산염 버퍼, 10 배
	<ol>
<li>
혼합 23.8 g HEPES (최종 100 mM) 21 g NaHCO3 (최종 250 m m) 및 1000 mL에 물을 추가. HCl. 여과기와 pH 7.2 조정 0.45 μ m 필터를 사용 하 여 소독. 실내 온도에 상점. 산도 시간이 지남에 변경 됩니다. 다시 정기적으로 pH를 조정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
미디어를 수확 (~ 1 병/2 마우스)
	<ol>
<li>500 ml RPMI 1640, 25 mL 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (5% 최종), 그리고 5 mL 100 × HGPG 추가 합니다. 4 ° c.에서 최대 6 개월까지 저장</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dithioerythritol (DTE) 솔루션 (40 mL/작은 내장)
	<ol>
<li>믹스 50 mL 10 × 행 크 스 균형된 소금 솔루션, Ca2+-Mg2+-무료, 50 mL 10 × HEPES-중 탄산염 버퍼, 그리고 50 mL 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (최종 10%). 350ml H2O와 15.4 mg dithioerythritol/100 mL (최종 1 m m)를 추가 합니다. 사용 하기 전에이 신선한 준비.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 솔루션 (50 mL/작은 내장)
	<ol>
<li>믹스 50 mL 10 × 행 크 스 균형된 소금 솔루션, Ca2+-Mg2+-5 mL 100 × HGPG 무료. 445 mL H2o. 추가 260 µ L 0.5 M EDTA를 추가/100 mL (최종 1.3 m m). 사용 하기 전에이 신선한 준비.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
콜라 솔루션 (30 mL/LP)
	<ol>
<li>500 mL RPMI, 50 mL FBS 추가 (10 %FBS 최종) 5 mL 100 × HPGP, 1 mL 0.5 M MgCl2 (최종 1 mM) 및 1 mL 0.5 M CaCl2 (최종 1 m m). 콜라를 추가 내가 (최종 100 U/mL)을 입력 합니다. 사용 하기 전에이 신선한 준비.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
밀도 그라데이션 (DG) 솔루션
	<ol>
<li>90 mL DG 재고 솔루션을 혼합 하 여 1 × DG 재고 솔루션을 준비 ( 테이블의 자료를 참조) 10 × PBS의 10 mL와 함께. 4 ° c.에 살 균 유지</li>
		<li>1 × DG 재고 솔루션 및 56 mL RPMI 1640 44 mL를 혼합 하 여 44 %DG 솔루션 (8 mL/IEL, 8 mL/LP)를 준비 합니다. 사용 하기 전에이 신선한 준비.</li>
		<li>1 × DG 재고 솔루션 및 33 mL RPMI 1640 67 mL를 혼합 하 여 67 %DG 솔루션 (5 mL/IEL, 5 mL/LP)를 준비 합니다. 사용 하기 전에이 신선한 준비.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Mesenteric 림프절, 내장, 절연 및 파이어의 패치
<ol><li>마 취 법 이산화 탄소와 2 차 자 궁 경부 전위를 사용 하 여 마우스를 안락사 그것의 뒤에 마우스를 놓고 70% 에탄올 스프레이 합니다. 중간 절 개를가 위를 사용 하 여 하 고 복 벽 복 막 구멍을 노출 하 고 피부를 엽니다.</li>
	<li>caecum 찾아서를 부드럽게는 caecum 집게를 사용 하 여. 집게를 사용 하 여 신중 하 게 소장 결 맞춰집니다 전체 MLN 체인 노출 오른쪽으로 이동. 참고: 내장의 체인 및 임 파 액 배수 장치는 이전 mesenteric 림프절의 지도13을그려져 있습니다.</li>
	<li>체인, 맹에 가까운 있는 하단 노드를 식별 합니다. 집게의 한 세트를 사용 하 여 mesentery/지방 주위를 파악 하 고 부드럽게 제거 MLN 체인 하단에서 상단에 tweezing 집게의 또 다른 세트로 림프절 주위에서 지방으로.</li>
	<li>베스트 미디어를 적신 종이 타월에 MLN 체인을 하다. 종이 타워에 체인을 압 연 하 고 집게의 두 세트와 지방을 미루어 여 mesentery/지방을 제거 합니다. 장소 나중 격리 단계에 대 한 차가운 수확 미디어 MLN. 참고: 노드 (i) 직접 처리 실망입니다. 대신, 그들의 주위 mesentery/지방 파악. (ii) 세포 생존 능력을 개선 하기 위해 가능한 많은 mesentery/지방 제거에 중요 하다.</li>
	<li>소장 pyloric 괄약근 아래와 위를 사용 하 여 맹 위를 잘라. 당겨 내장 천천히는 회장에서 십이지 집게의 1 세트를 사용 하 여 연결 된 mesentery/집게의 또 다른 세트를 사용 하 여 지방을 제거 하는 동안에.</li>
	<li>베스트 미디어를 적신 종이 타월에 소장을 놓고 집게의 두 세트와 함께 모든 나머지 mesentery/지방에서 애타게 합니다. 참고: (i) 가능한 최적의 셀 생산량 및 생존 능력에 대 한 많은 mesentery/지방 질을 제거 해야 합니다. (ii) 소장이 다음 단계에 걸쳐 주기적으로 수확 미디어를 적용 하 여 습 유지.</li>
	<li>Peyer의 패치 곡선가 위 소장에서 그들을 제거 하 여 수집 합니다. 해 범위 또는 (초보자); 필요한 경우 돋보기를 사용 하 여 대부분 Peyer의 패치는 훈련 된 눈에 표시 되어야 합니다. 작은 창 자에서 5-11 (일반) Peyer의 패치를 수집 합니다. 나중 격리 단계에 대 한 차가운 수확 미디어에 장소 파이어 패치. 참고: 파이어의 패치는 작은, 주로 mesentery 첨부 파일의 라인 반대 장 외벽에 bulges 라운드.</li>
	<li>회장으로 십이지에서 집게와 부드럽게 슬라이드의 편평한 측을 사용 하 여 지저분한 콘텐츠 및 점액을 추방. 대부분 점액의 제거를 한 번 반복 합니다. 참고: 점액의 불완전 한 제거 세포 생존 능력을 감소 하 고 얻을 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 부드럽게 villi 스트립 또는 지하실 멤브레인의 손상을 방지 하려면 소장 슬라이드를 해야 합니다.</li>
	<li>좋은 위를 사용 하 여 한 지점에 무딘 엔드와, 소장에 무뚝뚝한 끝을 삽입 하 고 자르면 소장 십이지에서 경도 회장에. 옆으로 ~ 2 cm 조각으로 열린된 소장을 잘라. 25 mL 찬 수확 미디어 나중 격리 단계 50 mL 원뿔 튜브에 장 조각을 놓으십시오. 참고: 미디어를 적신가 위 유지 소장을 통해 여유롭게 슬라이드 그들 도움이 됩니다.</li>
</ol>3. 절연 유도 사이트에서 세포의
<ol><li>부드럽게 3 mL 주사기의 플런저를 사용 하 여 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 해리 여 MLN에서 세포를 분리. 셀 스 트레이너 찬 수확 미디어의 5 mL로 씻는 다.</li>
	<li>펠 릿 MLN-4 ° c.에서 5 분 동안 400 × g에서 centrifuging 셀 1 mL 찬 수확 미디어에 셀 펠 릿을 resuspend. Trypan 블루 제외를 사용 하 여 가능한 셀을 계산 합니다. 참고: 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 버퍼 제거 중에 발생 한 출혈 하는 경우 적혈구를 제거 하려면 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>37 ° C와 30 분 동안 220 rpm에서 5 mL prewarmed 콜라 솔루션을 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에 Peyer의 패치를 배양 하 여 Peyer의 헝겊 조각에서 세포를 분리.</li>
	<li>15 대 한 소용돌이에서 최대 설정 및 필터 s 소화 조직과 상쾌한 50 mL 원뿔 튜브로 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해. 부드럽게 3 mL 주사기의 플런저를 사용 하 여 나머지 조직 조각을 해리 하 고 차가운 수확 미디어의 5 mL와 함께 셀 여과기를 세척.</li>
	<li>Peyer의 패치 셀 4 ° C에서 5 분 동안 400 × g에서 centrifuging 여 작은 고 1 mL 찬 수확 미디어에 셀 펠 릿 resuspend. Trypan 블루 제외를 사용 하 여 가능한 셀을 계산 합니다. 참고: 파이어 패치 절연의 일부 오염 lamina propria 세포, intraepithelial 세포를 할 수 있습니다.</li>
</ol>4. 소장에서 Intraepithelial 세포의 고립
<ol><li>반전 튜브 10 배, 정착, 장 조각 하 고는 상쾌한을 붓는 하 여 조각을 소장의 세 번 찬 수확 미디어의 25 mL 씻으십시오. 참고: 조직 조각 쉽게 튜브의 바닥에 침전 해야 한다. 그들이 경우에, 그것은 너무 많은 mesentery/지방 계속 연결 되어 또는 그들은 공기 방울이와 관련 된 표시.</li>
	<li>포함 된 내장 조각 50 mL 원뿔 튜브에 prewarmed DTE 솔루션의 20 mL를 추가 하 고 볶음 bar가 포함 된 50 mL 시 삼각 flask에 전송. 37 ° C에서 약동 하 고 20 분에 대 한 자력에 220 rpm를 사용 하 여 큰 자석 플라스 크의 외부에 저 어 바 보유 조직과 솔루션 50 mL 원뿔 튜브 다시 전송.</li>
	<li>최대 설정 10 미 전송는 상쾌한 새로운 50 mL 원뿔 관으로 원래 관에서 조직 조각을 계속 주의 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 튜브 소용돌이. 상쾌한; 버리지 마십시오 상쾌한 intraepithelial 세포를 포함 되어 있습니다. 4 ° c.에서 5 분 동안 400 × g에서 centrifuging 펠 릿 셀 10 mL 찬 수확 미디어에 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 얼음에 저장 합니다.</li>
	<li>포함 된 내장 조각 50 mL 원뿔 튜브에 prewarmed DTE 솔루션의 20 mL를 추가 하 고 다시 50 mL 시 삼각 플라스 크 볶음 bar가 포함 된 전송. 37 ° C에서 약동 하 고 20 분에 대 한 자력에 220 rpm를 사용 하 여 큰 자석 플라스 크의 외부에 저 어 바 보유 조직과 솔루션 50 mL 원뿔 튜브 다시 전송. 참고: DTE는 풍요롭게 하는 intraepithelial 세포는 감소 시키는 대리인.</li>
	<li>소용돌이에 최대 설정 10 미 전송은 상쾌한 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 포함 하는 셀 (4.3 단계)에서 첫 번째 DTE 치료의 상쾌한에서 이전 관으로 관. 참고: 나머지 장 조각은 lamina propria에서 세포를 분리 하는 데 사용 됩니다. 품질 관리: 조직의 조각은 제거 고 확인 조직학 상피 세포 존재 하 고 지하실 막이 손상 될 수 있습니다.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 400 × g에서 상쾌한 centrifuging 펠 릿 셀 실 온 (RT)에서 44 %DG 솔루션의 8 ml에서 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>17 mm ø x 100으로 전송 8 mL 44 %DG 솔루션/세포 현 탁 액은 mm 14 mL 폴 리 프로필 렌 라운드 하단 튜브 스타일. RT 67 %DG 솔루션의 5 mL와 언더레이. 브레이크를 사용 하지 않고 20 분 RT에서 1600 × g에서 원심. 참고: 튜브 튜브 벽에 튀어나와에서 세포를 방지 하기 위해 소 혈 청으로 pretreated 될 수 있습니다.</li>
	<li>Note는 44% ~ 67% 인터페이스에서 밴드 (버 피 코트)를 형성 하는 실행 가능한 세포, 죽은 세포와 상피 세포 일부에 그라데이션, 상단의 mucoid 영화 있고 붉은 혈액 세포 펠 릿에. 진공 포부에 의해 인터페이스의 ~ 2 cm 내에서 그라데이션 상위 레이어를 제거 합니다. 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 인터페이스에 버 피 코트를 수확 하 고 40 mL 찬 수확 미디어를 포함 하는 50 mL 원뿔 튜브에 그들을 전송.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 400 × g에서 centrifuging 펠 릿 셀 1 mL 찬 수확 미디어에 셀 펠 릿을 resuspend. Trypan 블루 제외를 사용 하 여 가능한 셀을 계산 합니다.</li>
</ol>5. 소장에서 Lamina Propria 세포의 고립
<ol><li>남은 장 조각을 포함 하는 플라스 크에 prewarmed EDTA 솔루션의 25 mL를 추가 하 여 장 조직 조각에서 상피 세포를 제거 합니다. 37 ° C와 30 분 대 한 자력에 220 rpm에서 플라스 크 저 어 저 어 바 그리고 신중 하 게 플라스 크 내의 장 조각을 유지 하면서는 상쾌한 삭제 플라스 크의 외부에 큰 자석을 사용 합니다. 참고: (i) EDTA 칼슘 chelator 칼슘 종속 연결 대상 장 상피 세포의 분리를 촉진 하는. (ii) 상쾌한 흐린 이어야 하며 그들의 컬렉션을 원하는 경우 IEC를 격리 하는 데 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>5.1 단계를 반복 합니다. 참고:는 상쾌한 덜 흐린이 부 화에 따라 이어야 한다. 품질 관리: 조직의 조각 제거 고 확인 조직학 장 상피 세포를 제거 하 고 지하실 막이 손상 될 수 있습니다. Cytometry 확인 하는 상쾌한에서 샘플 평가할 수도 있습니다 그 백혈구 (CD45+ 세포) 결 석.</li>
	<li>플라스 크를 RT 수확 미디어의 50 mL를 추가 합니다. 자석으로 간단히 저 어 줍니다. 장 조각 정착 하 고 신중 하 게는 상쾌한을 삭제 하자. 참고:이 단계는 EDTA은 콜라 콜라 함수에 대 한 중요 한 칼슘 킬레이트 화 여 서 콜라 소화 전에 EDTA의 제거를 보장 합니다.</li>
	<li>Prewarmed 콜라 솔루션의 30 mL 플라스 크에 추가 하 고 45 분 자력에 37 ° C 그리고 220 rpm에서 장 조각 저 어.</li>
	<li>전송 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 필터링 하 여 조직 및 50 mL 원뿔 튜브에 상쾌한 소화. 부드럽게 필터를 통해 매 시에 3 mL 주사기의 플런저를 사용 하 여 나머지 조직 조각 해리. 찬 수확 미디어의 10 mL와 함께 필터를 세척.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 400 × g에서 centrifuging 펠 릿 셀 주위 온도 44 %DG 솔루션의 8 ml에서 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>17 mm ø x 100으로 전송 8 mL 44 %DG 솔루션/세포 현 탁 액은 mm 14 mL 폴 리 프로필 렌 라운드 하단 튜브 스타일. 주위 온도 67 %DG 솔루션의 5 mL와 언더레이. 실내 온도 아무 브레이크 20 분 동안 1600 × g에서 그라디언트 원심</li>
	<li>진공 포부에 의해 위에 지방 층을 제거 합니다. 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 인터페이스와 40 mL 찬 수확 미디어를 포함 하는 50 mL 원뿔 튜브에 버 피 코트를 수확.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 400 × g에서 centrifuging 펠 릿 셀 1 mL 찬 수확 미디어에 셀 펠 릿을 resuspend. Trypan 블루 제외를 사용 하 여 가능한 셀을 계산 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

자세한 프로토콜 유도 (MLN와 PP) 점 막 세포는 창 자에서 격리에 대 한 제시와 이펙터 (LP 및 IEL 구획) 사이트. 프로토콜 균형 입력 (시간) 및 출력 (생존 및 수율) 결과 및 생산성을 극대화 하기 위해 개발 되었습니다. 프로토콜은 또한 LP와 IEL 구획 사이 최소 상호 compartmental 오염을 보장합니다.
마우스 소장에서 면역 세포의 고립에 대 한 여러 가지 프로토콜 되었습니다 게시3,,45,,67. 이러한 프로토콜의 대부분 LP에서 면역 세포를 고립 시키기에 초점. 장 상피 LP 외부 환경에 직접 노출 되 고 세포의 독특한 구성의 구성에서 뚜렷한 구획 이다. 이러한...

위장 (GI)는 많은 주름 돌출 외부 환경과 내부 신체 분리 큰 인터페이스를 나타내는 있다. 장의 면역 시스템 기 관의 장벽 기능 유지에 필수적인 역할을 한다. 그것은 끊임없이 식이 항, 공생 박테리아 및 병원 성 미생물에 노출 됩니다. 이와 같이, 음식 항 원 및 공생 박테리아 관용 있어야 합니다 빠르게 enteropathogenic 미생물1에 대 한 효과적인 면역 응답을 생성 하는 능력을 유지 하면서. 장의 면역 시스템 해부학 어디 순진한 림프 톨 항 원 장 점 막에서 항 원을 운반 하는 세포에 의해 활성화 됩니다, 유도 사이트 및 이펙터 사이트, 활성화 된 림프 톨 특정 발휘로 분할 될 수 있다 이펙터 기능2. 유도 사이트 구성 조직된 림프 구조에 Peyer의 패치 (PP)의 전문된 M 세포와 지역 배수 mesenteric 림프절 (MLN)의 행동을 통해 직접 창 자 루멘을 조사. 이펙터 사이트 lamina propria (LP), 지하실 멤브레인와 장 상피 세포, intraepithelial 세포 (IEL)를 포함 하는 지하실 멤브레인 위에 있는 단일 셀 레이어 아래 결합 조직으로 구성 됩니다. 세포는 적응 면역의 주요 플레이어는 감염 및 암에 대 한 보호를 중재 하 고 염증 성 질병에 immunopathology에도 기여할 수 있습니다. 그것은 중요 한 고이 고유에 세포를 공부 하는 관련성이 높은 해 부 점 막 구획을 더 나은 이해 그들의 유도 및 이펙터 기능.
소장에 발생 하는 면역 이벤트를 탐험 하는 수 사관의 수는 가속으로 비교적 간단 하 고 통합 프로토콜 이러한 구획에서 세포의 고립에 대 한 필요 합니다. 여러 연구 그룹 출판 마우스 작은 창 자 구획3,,45,6,7에서에서 면역 세포를 분리 하는 데 몇 가지 유사한 프로세스를 공유 하는 프로토콜 . 그러나, 개별 프로토콜의 초점에 따라 그들 가운데 몇 가지 기술적 차이가 있습니다. 예를 들어 LP에서 면역 세포를 분리 하는에 초점을 맞추고, 한 프로토콜 세포 생존 능력, 세포 표면 마커 식, 그리고 고립 된 면역 세포5의 구성에 다양 한 효소 소화에 미치는 영향을 검사 합니다. 다른 프로토콜 밀도 원심 분리6없이 세포의 고립에 대 한 신속 하 고 재현성 방법을 강조 한다. 마지막으로, 특정 프로토콜 또한 작은 창7의 다른 조직 층에서 단 식 세포를 고립 시키기 위해 존재 한다. 여기, 소장의 MLN, PP, LP, 및 IEL 구획에서 림프 구 인구의 순차적 격리를 허용 하는 높은 재현 프로토콜 제공 됩니다.
우리는 크게 다른 장의 구획에서 오염 물질의 무료 LP 및 IEL 구획에서 높게 순화 된 인구를 고립 시키기에 초점. 이 널리 사용 프로토콜 생산 허용 시간 제약4,8,9,10,,1112에서 극대로 순수 하 고 실행 가능한 세포의 높은 수확량. 이 프로토콜 또한 타고 난 기회가 뚜렷한 구획에 세포 공부를 수 있도록 최소한의 크로스 compartmental 오염 LP 및 IEL 구획에서 림프 톨의 격리를 보장 합니다. 고립 된 세포 흐름 cytometric 분석 또는 기능 분석 같은 추가 조작 대상이 될 수 있습니다. 이 프로토콜 성공적으로 적용 된 세포의 고립에 마우스 작은 창 자와 콜론에서 Listeria monocytogenes, 살 모 넬 라 typhimurium, 페스트 pseudotuberculosis 등 세균 감염 시 감염 그리고 화학 및 병원 체 유발 장 염 등 염증 성 조건. 이 프로토콜은 수지상 세포, 대 식 세포, 호 중구, 및 monocytes 마우스 작은 창 자와 콜론에서 같은 타고 난 면역 세포를 분리 하도 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민&nbsp;</td><td>Sigma-aldrich</td><td>G3126-100G</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>생명 과학</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>겐타마이신</td><td>생명 기술</td><td>15710-072</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>생명 기술</td><td>21870-076</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Life Technologies</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>10x 행크스 균형 소금 용액</td><td>Sigma-aldrich</td><td>H4641-500ML</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dithioerythritol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D9680-5G</td><td></td></tr><tr><td>0.5M EDTA, pH 8.0</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 육수화물</td><td>Sigma-aldrich</td><td>21108-500G</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘 육수화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>M2670-100G</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해효소, 유형 I</td><td>Life Technologies</td><td>17100-017</td><td></td></tr><tr><td>DG 그라디언트 스톡 용액(Percoll)&nbsp;</td><td>GE 헬스케어</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>적혈구 용해 버퍼</td><td>바이오레전</td>드 <td>420301</td><td></td></tr><tr><td>70-&마이크로; M 세포 스트레이너&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>14 mL 폴리프로필렌 라운드 바닥 튜브</td><td>Corning</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer 플라스크&nbsp;</td><td>Kimble</td><td>26500R-50mL</td><td></td></tr><tr><td>자기 교반기</td><td>Thermo Fisher</td><td>50094596</td><td></td></tr><tr><td>교반 막대</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-512-148</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 작은 장의 면역 시스템에서 세포를 분리

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

장의 면역 시스템 enteropathogenic에 대 한 효과적인 면역 응답을 설치 하는 동안 식이 항 및 공생 박테리아 허용 응답을 생성 하 여 위장의 장벽 기능 유지에 중요 한 역 미생물입니다. 또한, 그것은 분명 지역 장 면역 먼 및 조직의 면역에 깊은 영향을가지고 되었다. 따라서, 그것은 장 면역 반응을 유도 하는 어떻게 무엇 이며 응답의 면역학 결과 공부 하는 것이 중요입니다. 여기, 상세한 프로토콜 창 자 연관 된 림프 조직 Peyer의 패치 및 배수 mesenteric 림프절 같은 소장 유도 사이트와 lamina propria 같은 이펙터 사이트에서 세포의 고립에 대 한 설명 및 장 상피입니다. 이 기술은 최적의 순도 및 생존 능력 허용 시간 범위 내에서 최소한의 상호 compartmental 오염 작은 창 자 조직에서 세포의 많은 수의 격리를 보장합니다. 세포 및 장 조직에서 다른 면역 세포 분리 기술 기능 위장 감염, 암, 염증 성 질환에 면역 반응의 이해를 수 있습니다.

프로토콜의 도식 표현 묘사 된다 (그림 1). 림프 톨 유도 장 점 막 및 이펙터 사이트 내에서 명백 하 게 구성 됩니다. 파이어의 패치 (PP) 및 mesenteric 림프절 (MLN) 포함에 잘 조직 된 T 세포 및 B 세포 모 낭, 림프 톨 장 상피 세포 더 만들어진다 배포 되는 포함. Lamina propria (LP)에 브러시가 분산된 세포와 세포 고립된 림프 낭 (ILF)과 cryptopatches 같은 조직된 림프 구조 내에 포함 된 포함 되어 있습니다. 각 장의 면역 구획은 또한 림프 톨 부분 집합 (그림 2)의 독특한 구성으로 대표. MLN 주로 PP 세포는 주로 B 세포 (~ 80%) αβ T 세포 (~ 70%)의 구성입니다. Lp로 림프 구 구성은 크게 긴장 의존 하지만 주로 αβ T 세포와 B 세포의 구성 이다. 다른 장의 구획 구분, 림프 톨...

여기 창 자 연관 된 림프 조직 Peyer의 패치 및 배수 mesenteric 림프절을 포함 하 여 유도 사이트와 lamina propria 포함 이펙터 사이트에서 세포의 고립에 대 한 자세한 프로토콜 설명 및 작은 장 면역 시스템의 장 상피입니다.

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 Peyer's patches 및 장간막 림프절을 포함한 장 유도 부위와 lamina, propria 및 상피를 포함한 effector 부위에서 림프구를 분리하는 것입니다. 이 방법은 위장 감염, 암 및 염증성 질환에 대한 면역 반응을 이해하는 것과 같은 점막 면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 소장의 별개의 구획에서 고도로 정제되고 생존 가능한 림프구를 최소한의 교차 구획 오염으로 분리할 수 있다는 것입니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 장간막 림프절과 Peyer's patch를 식별 및 분리하고 최적의 수율을 위해 속도와 정밀도의 균형을 맞추는 것이 어렵기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 프로토콜을 시작하려면 이전에 마취된 마우스를 등에 눕히고 70% 에탄올을 분사합니다. 가위를 사용하여 정중선을 절개하고 피부와 복벽을 열어 복막강을 노출시킵니다.다음으로 맹장을 찾아 집게를 사용하여 맹장을 부드럽게 잡아당깁니다. 겸자를 사용하여 소장을 조심스럽게 오른쪽으로 움직여 결장과 정렬된 장간막 림프절 또는 MLN 사슬 전체를 노출시킵니다. 맹장에 가장 가까운 사슬의 맨 아래 마디를 식별합니다.한 세트의 집게를 사용하여 주변의 장간막 지방을 잡고 다른 집게 세트로 림프절 주변의 지방을 핀셋하여 MLN 사슬을 아래에서 위로 부드럽게 움직입니다. 그런 다음 수건에 수확 매체를 적시고 종이 타월 위에 MLN 체인을 놓습니다. 종이 타월에 체인을 굴려 장간막 지방을 제거하고 두 세트의 집게로 지방을 제거합니다.이후 분리 단계를 위해 MLN을 저온 수확 매체에 넣습니다. 가위로 유문 괄약근 아래와 맹장 위의 소장을 자릅니다. 한 세트의 집게를 사용하여 회장에서 십이지장까지 장을 천천히 당겨 빼내고 다른 집게 세트를 사용하여 부착된 장간막 지방을 제거합니다.수확 배지를 적신 종이 타월 위에 장을 놓고 두 세트의 집게로 남아 있는 장간막 지방을 떼어냅니다. 이 단계 동안 수확 배지를 주기적으로 적용하여 장을 촉촉하게 유지하십시오. 구부러진 가위로 장에서 Peyer의 패치를 제거하여 수집합니다.소장에서 5-11개의 Peyer's patch를 수집합니다. 나중에 분리 단계를 위해 Peyer's 패치를 저온 수확 매체에 넣습니다. 겸자의 평평한 면을 사용하고 십이지장에서 회장 쪽으로 부드럽게 미끄러져 대변 내용물과 점액을 배출합니다.이 단계를 한 번 반복하여 대부분의 점액을 제거합니다. 끝이 뭉툭한 가위를 사용하여 한쪽 끝이 뭉툭한 부분을 장에 삽입하고 십이지장에서 회장까지 세로로 열린 장을 자릅니다. 열린 장을 옆으로 2cm 조각으로 자릅니다.나중에 분리 단계를 위해 25ml의 저온 수확 매체가 있는 50ml 원뿔형 튜브에 장 조각을 넣습니다. 3밀리리터 주사기의 플런저를 사용하여 70마이크로미터 세포 여과기를 통해 림프구를 부드럽게 해리하여 MLN에서 림프구를 분리합니다. 세포 여과기를 5ml의 저온 수확 배지로 세척합니다.MLN 세포를 섭씨 4도에서 5분 동안 중력의 400배로 원심분리하여 펠릿화합니다. 그런 다음 세포 펠릿을 1밀리리터의 냉간 수확 배지에 재현탁합니다. 튜브를 10회 뒤집어 25ml의 저온 수확 매체로 소장 조각을 세 번 세척합니다.장 조각이 가라앉고 상층액을 쏟아낼 때까지 기다립니다. 다음으로, 장 조각이 들어 있는 50ml 원뿔형 튜브에 예열된 디티오에리스리톨 또는 DTE 용액 20ml를 넣고 내용물을 교반 막대가 있는 50ml 실리콘 삼각 플라스크에 옮깁니다. 플라스크 외부에 있는 큰 자석을 사용하여 교반 막대를 잡고 조직과 용액을 50ml 원추형 튜브로 다시 옮깁니다.그런 다음 10초 동안 최대 설정으로 튜브를 소용돌이칩니다. 70마이크로미터 세포 여과기를 통해 상층액을 새로운 50ml 원뿔형 튜브로 옮기고 조직 조각이 원래 튜브에 보관되도록 주의하십시오. 세포를 펠렛으로 만듭니다.세포 펠릿을 10ml의 차가운 수확 매체에 재현탁하고 얼음 위에 보관하십시오. 장 조각이 들어 있는 20ml 원뿔형 튜브에 예열된 DTE 용액 20ml를 넣고 교반 막대가 들어 있는 50ml 실리콘 삼각 플라스크로 다시 옮깁니다. 플라스크 외부에 있는 큰 자석을 사용하여 교반 막대를 잡고 조직과 용액을 50ml 원추형 튜브로 다시 옮깁니다.10초 동안 최대 설정으로 튜브를 소용돌이칩니다. 70마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 상층액을 첫 번째 DTE 처리의 상등액에서 세포가 들어 있는 튜브로 옮기고 세포를 원심분리합니다. 세포 펠릿을 8ml의 44% 밀도 구배 또는 DG 용액에 실온에서 재현탁합니다.8밀리리터 44%DG 용액과 셀 현탁액을 17mm x 100밀리미터 14밀리리터 폴리프로필렌 원형 바닥 튜브로 옮깁니다. 5ml의 RT 67%DG 용액으로 셀을 깔아줍니다. 브레이크를 사용하지 않고 RT에서 25분 동안 1, 600배 중력에서 원심분리기.생존 가능한 세포는 44% 및 67% 계면에서 담황색 코팅을 형성합니다. 진공 흡인으로 상단의 지방층을 제거합니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 계면에서 버피 코트를 수확하고 40 밀리리터의 저온 수확 매체가 들어있는 50 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다.섭씨 4도에서 5분 동안 중력의 400배로 원심분리하여 세포를 펠릿화하고 세포 펠릿을 1밀리리터의 냉간 수확 배지에 재현탁시킵니다. 남은 장 조각에 25ml의 예열된 EDTA 용액을 첨가하여 장 조직 조각에서 상피 세포를 제거하고 내용물을 교반 막대가 있는 50ml 실리콘 삼각 플라스크에 넣고 저어줍니다. 교반 막대를 잡고 장 조각을 플라스크에 유지하면서 상층액을 조심스럽게 버립니다.상피 세포 제거 단계를 한 번 더 반복합니다. 다음으로 실온 수확 매체 50ml를 넣고 자석으로 내용물을 짧게 저어줍니다. 그런 다음 장 조각을 가라앉히고 상층액을 조심스럽게 버립니다.예열된 콜라겐분해효소 용액 30ml를 넣고 장 조각을 저어줍니다. 교반 후 소화된 조직과 상층액을 70마이크로미터 세포 여과기를 통해 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 3ml 주사기의 플런저를 사용하여 필터를 으깨서 나머지 조직 조각을 부드럽게 분리합니다.10ml의 저온 수확 매체로 필터를 세척하고 세포를 펠릿화합니다. 회전 후 8ml의 주변 온도 44%DG 용액에 셀 펠릿을 재현탁합니다. 8밀리리터의 44% DG 용액 셀 현탁액을 새로운 70mm x 100mm 폴리프로필렌 원형 바닥 튜브로 옮깁니다.5ml의 주변 온도 67%DG 용액을 밑에 깔고 구배를 원심분리합니다. 진공 흡인으로 상단의 지방층을 제거합니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 계면에서 버피 코트를 수확하고 40 밀리리터의 저온 수확 매체가 들어있는 50 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다.마지막으로, 세포 펠릿을 1ml의 저온 수확 배지에 재현탁시킵니다. 각 장 면역 구획은 림프구 부분 집합의 고유한 구성으로 대표됩니다. MLN은 주로 알파 베타 T 세포로 구성되어 있는 반면 PP 림프구는 대부분 B 세포입니다.LP 림프구 구성은 주로 알파 베타 T 세포와 B 세포로 구성됩니다. IEL은 주로 감마 델타 T 세포와 알파 베타 T 세포이며 기본적으로 B 세포가 없습니다. LP 및 IEL 구획 내의 CD8 알파 양성 알파 베타 T 세포는 CD8 알파 호모이머 또는 CD8 알파 베타 이종이량체를 발현한 반면, 유도 부위 CD8 알파 양성 알파 베타 T 세포는 주로 CD8 알파 베타 이종이량체를 발현했습니다.IEL 구획에 있는 대부분의 감마 델타 T 세포는 CD8 알파를 발현하는 반면, MLN에서 발견되는 감마 델타 T 세포는 CD8 알파가 부족합니다. 이 절차를 시도하는 동안 장 구획 간의 오염을 제한하기 위해 조직 분리 단계에서 충분한 시간과 주의를 기울여야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 분리된 림프구는 생체 외 자극, 유세포 분석 및 추가 표현형 및 기능 분석을 위한 기타 기술을 적용할 수 있습니다.

isolating-lymphocytes-from-the-mouse-small-intestinal-immune-system

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Miltenyi 맥스 키트를 사용 lymphocytes의 격리는 전체 림프 조직 homogenates에서 세포를 정화하는 안정적인 방법입니다. Miltenyi 시스템을 사용하여 정화 세포는 일반적으로 ≥ 96% 순수하고 있습니다. 여기, 우리는 CD4 + T 세포, Miltenyi에서 제공하는 많은 키트 중 하나를 분리하기 위해 취한 단계를 보여줍니다.

CD4의 분리 + Miltenyi 맥을 정제를 사용하여 마우스 림프절에서 T 세포

여기서는 자세하게 마우스 장 돌기 세포 (DC가)와 macrophages의 급속한 분리를위한 방법론. 창자 DCS 및 macrophages의 Phenotypic 특성은 세포 정렬 뒤에 자석 구슬 농축은 기능적 연구를위한 매우 순수 인구를 얻을하는 데 사용하는 동안 멀티 컬러 플로우에게 cytometric 분석을 사용하여 수행됩니다.

마우스 소장에서 돌기 세포 및 Macrophages의 분리 및 특성화

마우스 성기 기관에서 림프구를 분리 할 수​​있는 효과적인 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 효율적으로 분리 할 수​​ 있도록 효소 분해와 Percoll 기울기 분리에 활용합니다. 이 기술은 다른 종에 사용하기 위해도에 적용 할 수...

마우스 성기 요로 점막에서 림프구의 분리

이 비디오에서는 수확된 마우스 Peyer's patch에서 림프구를 분리하는 방법을 보여줍니다. 분리된 림프구는 추가 분석에 사용할 수 있습니다.

Isolation of Lymphocytes from a Mouse Peyer's Patch

Peyer의 패치에있는 셀의 특정 subpopulations (조달청), 창자 관련 림프의 조직의 주요 유도 사이트의 면역 기능을 이해 증가 관심이 있습니다. 여기 흐름 cytometric 분석 및 immunostaining을위한 PP cryosections위한 단일 셀 준비를 PP 준비 병렬 프로토콜을 설명합니다.

림프구와 손쥐 Peyer의 패치에서 수지상 세포를 분리하고 Immunostaining

다른 T 세포의 하위 집합에서 별개의 이펙터 기능으로, TH17 세포는 중앙 염증성자가 면역 질환에 연루되어있다. 이 체외 TH17 분화 프로토콜은 순진 CD4 + T 림프구는 TH17 세포로 분화 할 수 있고, 또한자가 면역 및 호스트 응답에서 자신의 역할을 조사할지 여부를 결정하는 방법을 제공합니다.

분리 및 나이브 CD4 T 림프구의 TH17 분화

장 림프구의 정량적 특성화에 대한 관심이 높아지고 있는데, 이는 이러한 세포가 다양한 장 및 전신 질환에서 중요한 역할을 한다는 인식이 높아짐에 따라 발생합니다. 이 프로토콜에서는 후속 유세포 분석 특성 분석을 위해 다른 소장 구획에서 단일 세포 집단을 분리하는 방법을 설명합니다.

쥐 소장 림프구의 분리 및 유세포 특성

림프구는 적응 면역 반응의 주요 플레이어입니다. 여기에서는 in vitro 및 in vivo에서 원하는 분자의 림프구 활성화의 생리학적 기능을 결정하기 위한 림프구 정제 프로토콜을 제시합니다. 설명된 실험 절차는 대조군 림프구와 유전자 변형 림프구 간의 기능적 능력을 비교하는 데 적합합니다.

분리 및 쥐 림프구의 활성화

이 연구에서는 선물이 고 림프 톨의 격리에 대 한 효율적인 프로토콜 Peyer의 패치 (PPs), 사용할 수 있습니다 이후 follicular T의 흐름 cytometric 학문 뿐만 아니라 vivo에서 그리고 생체 외에서 기능적 분석 실험에서 도우미 고 어린 싹 센터 B 세포입니다.

체액 성 면역의 해결 핵심 선수: 고급 및 Murine 파이어의 패치에서 림프 구 격리 프로토콜 최적화

이 프로토콜은 뮤린 소장 오가노이드를 확립하고, 뮤린 소장 라미나 프로프리아로부터 유형 1 선천성 림프성 세포를 분리하고, 장 상피 세포와 유형 1 선천성 림프 세포 간의 양방향 상호 작용을 연구하기 위해 두 세포 유형 간의 3 차원 (3D) 공동 배양을 수립하기위한 자세한 지침을 제공합니다.

뮤린 소장 상피 오가노이드와 선천적 림프성 세포의 공동 배양

IL-9 발현 T 및 ILC2 세포는 N. brasiliensis 감염 동안 유도되지만, 이들의 특성화는 낮은 빈도 및 차등 동역학으로 인해 감염된 장에서 크게 간과되었습니다. 이 프로토콜은 서로 다른 표적 기관에서 이러한 세포를 분리하고 서로 다른 감염 단계에서 유세포 분석을 통해 신원을 확인하는 방법을 설명합니다.

Nippostrongylus brasiliensis 감염 모델에서 IL-9 생성 림프 세포 연구를 위한 전략

배우세요 마우스 작은 장의 면역 시스템에서 림프구를 분리하는 방법을. Peyer's patches와 장간막 림프절, 점막층 및 상피에서 고순도 세포를 얻어 점막 면역학 연구에 활용하세요.

마우스 작은 장의 면역 시스템에서 세포를 분리

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