고해상도를 사용하여 뇌 섹션에서 Axonally 지역화 된 mRNA를 검출 현장에서 하이브리드

다음 실험의 전반적인 목표는 성인 뇌 샘플에서 우연히 국소화된 mRNA를 검출하는 것입니다. 이것은 전처리를 통해 달성됩니다. 두 번째 단계인 혼성화(Hybridization)로 mRNA 분자의 가면을 벗기기 위해 끓이고 프로테아제 분해를 통해 샘플을 추출한 다음, 관심 mRNA를 시각화할 수 있는 증폭 및 검출 단계를 수행합니다.

다음으로, 관심 mRNA가 축삭돌기에 국한되어 있는지 확인하기 위해 축삭돌기를 항체 또는 염료로 염색합니다. 결과는 현미경 분석을 기반으로 한 다양한 마스킹 해제 절차 및 카운터, 염색 방법을 사용하여 뇌 샘플에 TF 4 mRNA가 존재함을 보여줍니다. 이 방법은 어떤 mRNA가 엑손 없이 국소화되고 번역되는지와 같은 신경 과학의 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 방법은 intracon 단백질 합성에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 mRNA 국소화가 발생하는 수상돌기 및 비신경 세포 및 조직과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 뇌 절편을 고정한 후 서면 프로토콜의 지침에 따라 60ml의 항원 회수 용액이 들어 있는 코핀 항아리를 준비하고 슬라이드를 용액에 담그십시오. 다음으로 1리터 비커에 증류수를 채우고 전자레인지에 넣어 열을 완충합니다.

마스킹 해제를 수행할 때 슬라이드와 회수 용액이 들어 있는 코플랜 용기를 전자레인지에 넣습니다. 슬라이드를 고출력으로 5분 동안 끓입니다. 용액이 끓는 것을 멈춘 직후 슬라이드를 다시 고출력으로 5분 더 가열합니다.

슬라이드를 실온에서 식히십시오 냉각 후 PBS가 들어있는 접시에 슬라이드를 담그고 세척 한 다음 세척을 두 번 더 반복하십시오 세척 후 슬라이드를 평평한 표면에 놓고 2-3 방울 또는 100 마이크로 리터의 DAP B.Probe를 2 개 또는 3 개의 뇌 절편에 대조군으로 추가합니다. 배경 염색을 평가하기 위해, 관심 있는 RNA를 검출하기 위해, 마우스 TF 4 RNA의 잔기 20 내지 1381을 표적으로 하는 프로브를 실험 섹션에 2-3방울 추가합니다. 프로브 증발을 방지하기 위해 집게를 사용하여 슬라이드 위에 매개변수를 배치합니다.

그런 다음 하이브리드화 오븐 내부의 가습 슬라이드 상자에 슬라이드를 놓고 섭씨 40도에서 2시간 동안 배양합니다. 배양 시간이 경과한 후 실온에서 2분 동안 1개의 세척 버퍼가 있는 접시에 담긴 슬라이드를 세척합니다. 다음으로, 각 뇌 절편에 MP 1fl 증폭 시약 2-3방울을 추가합니다.

그런 다음 새로운 파라 필름으로 덮고 슬라이드 상자에 넣고 혼성화 오븐에서 섭씨 40도에서 15분 동안 배양합니다. 이전과 같이 슬라이드를 세척한 후 각 뇌 절편에 증폭 시약 A MP 4 fl 2-3방울을 넣고 퍼필로 덮습니다. 슬라이드 박스의 슬라이드를 섭씨 40도에서 혼성화 오븐에서 15분 동안 배양합니다.

실온에서 각각 2분씩 1개의 세척 버퍼로 슬라이드를 두 번 세척합니다. 이전과 같이, 마지막 세척 후 각 슬라이스를 100-200 마이크로 리터의 차단 용액으로 덮고, 밀리리터 당 3 밀리 그램, BSA 100 밀리 몰 글리신 및 0.25 % 트리톤 X 100 PBS를 함유하고, 각 슬라이드를 파라 폼으로 덮고, 30 분 동안 배양하고, 배양 후 실온에서 차단 용액에 희석 된 항체 100-200 마이크로 리터를 슬라이드에 첨가합니다. 항콜린 아세틸 전이효소 항체는 섭씨 4도에서 2일 동안 퍼필 배양물로 슬라이드를 덮은 후 여기에 사용됩니다.

필요한 경우 뇌 절편이 건조하지 않은지 확인하고, 배양 후 24시간 후에 뇌 절편에 항 CHATT 항체 용액을 다시 바르십시오. 슬라이드를 한 번의 XPBS에서 5분 동안 세 번 세척한 후. 실온에서 100-200마이크로리터의 적절한 Alexa 접합 2차 항체를 슬라이드에 추가합니다.

파라메라로 덮고 실온에서 1시간 동안 배양한 후 한 시간이 지나면 빛으로부터 보호하십시오. 이전과 같이 한 번의 XPBS에서 슬라이드를 각각 5분씩 세 번 세척한 다음 증류수로 한 번 세척합니다. DPI가 포함된 장착 매체로 슬라이드를 장착한 다음 형광 현미경으로 뇌 절편을 시각화합니다.

프로토콜의 서면 부분에 있는 지침에 따라 공식 및 고정 파라핀 내장 인간 뇌 샘플을 준비한 후 슬라이드를 뜨거운 전처리 2용액에 담그고 15분 동안 끓여서 열 유도 항원 마스킹 해제를 수행합니다. 증류수로 3-5회, 신선한 100% 에탄올로 3-5회 세척한 후 슬라이드를 실온에서 5분 동안 건조시켜 프로테아제 유도 항원 마스킹 해제를 수행합니다. 전처리 3 덮개의 4 방울을 추가하고 증류수에서 3-5 번 세척 한 후 교잡 오븐에서 섭씨 40 도에서 30 분 동안 배양합니다.

이전과 마찬가지로 배경 염색을 평가하기 위해 뇌 절편을 제어하기 위한 DAP B 프로브 세트 4방울을 추가하고 실험 섹션에 표적 프로브 세트 4방울을 추가합니다. 필름으로 덮인 한 쌍의 슬라이드를 슬라이드 상자에 넣고 혼성화 오븐에서 섭씨 40도에서 2시간 동안 배양합니다. 관심 mRNA에 대한 DAB 신호를 개발하기 위해 서면 프로토콜의 단계를 따른 후 명시야 현미경으로 신호가 있는지 확인합니다.

뇌 샘플에서 카운터 염색 절차 전반에 걸쳐 반점의 존재를 모니터링할 수 있는 참조 영역을 정의합니다. 얼룩을 막기 위해. 먼저 luxal fast blue의 슬라이드를 섭씨 60도로 예열하고 섭씨 60도에서 30분 동안 배양합니다.

배양 후 슬라이드를 증류수로 여러 번 헹구고 슬라이드를 0.05% 탄산리튬 용액에 여러 번 담궈 감별을 시작합니다. 다음으로, 슬라이드를 신선한 75% 에탄올에 두 번 담그고 증류수로 헹굽니다. 명시야 현미경으로 뇌 절편을 확인합니다.

회백질과 백질이 구별되기 시작하고 RNA 과립은 여전히 짙은 파란색, 검은색 반점으로 보여야 합니다. 연한 파란색 섬유가 luxal blue 염색 절차를 반복하고 10-20분 간격으로 luxal blue로 배양하고 최적의 염색이 달성되었을 때 카운터 염색과 RNA 과립의 존재를 주의 깊게 모니터링하면서 축삭돌기가 나타나기 시작하는지 확인합니다. 헹굼 슬라이드를 크레탈 바이올렛 용액에 넣고 배양 후 10분 동안 배양합니다.

슬라이드를 증류수로 헹굽니다. 슬라이드를 70% 에탄올에 5-10회 담근 다음 흄 후드에서 100% 에탄올을 세 번 빠르게 교체하여 탈수합니다. 자일렌에서 두 번 배양하여 뇌 조각을 청소합니다.

대체 청산소는 2분 동안, 세 번째는 5분 동안 사용합니다. 실온에서 자일렌 기반 영구 장착 매체에 뇌 절편을 장착하고 명시야 현미경으로 분석합니다. Fish는 프로테아제 유도 마스킹 해제를 사용하여 수행된 후 빨간색으로 표시된 콜린 아세틸 전이효소의 항체 검출을 수행했습니다.

항체는 프로테아제 치료가 수행되었을 때 채팅을 인식하지 못했습니다. 동일한 현미경 설정 및 이미지 조정을 사용하여 비표적 프로브와 TF 4 표적 프로브로 얻은 결과의 예가 표시됩니다. 불분명한 축삭 국소화를 가진 녹색 ATF 4개의 양성 과립은 물음표로 표시됩니다.

파란색 영역은 물고기가 열 유도 항원을 사용하여 수행되었을 때 깔끔하게 염색된 핵입니다. 채팅 면역형광 염색을 다시 빨간색으로 표시하여 마스크 해제하는 데 성공했습니다. 축삭돌기에 국한된 TF 4개의 양성 과립은 주황색으로 나타나고 ish의 축삭돌기가 룩살로 대조염색된 후 괜찮은 것으로 표시됩니다.

빠른 청색과 신경 세포 SOTA는 크레탈 바이올렛(crestal violet)이 최적이 아닌 룩스탈(luxal)로 카운터 염색되었습니다. 온도를 낮추면 빠른 파란색 염색이 발생할 수 있습니다. 여기서 샘플을 4 시간 동안 섭씨 40도에서 luxal fast blue로 염색했습니다.

불분명한 우발적 국소화가 있는 TF 4개의 positive granules는 물음표로 표시됩니다. 차선의 염색은 여기에서 볼 수 있듯이 짧은 배양 기간 후에 카운터 염색의 강도를 확인하지 않을 때도 발생합니다. 비-표적 프로브 또는 TF 4 표적 프로브를 사용하여 ish와 결합된 최적의 LFB 염색의 예가 여기에 나와 있습니다.

이미지 획득은 최상의 신호 대 잡음비를 위해 자동으로 조정되었습니다. Axon은 TF 4 개의 과립을 국소화하여 괜찮은 것으로 표시합니다. 일단 마스터하면.

이 기술은 개발 후 선택한 카운터 스테인 방법에 따라 1-3 일 안에 수행 할 수 있습니다. 이 기술은 신경과학자들이 mRNA 번역 및 미묘한 차이의 국소화를 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다.