Name: 다공성 막 삽입물과 RTddPCR을 이용한 축삭 mRNA의 분리 및 정량 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: 학습하세요 다공성 막 삽입물을 이용한 축삭 mRNA 분리 및 RT-ddPCR 정량 방법을. 이 기술은 신경 세포체와 신경돌기를 분리하여 저발현 mRNA를 고감도로 검출하고 국소 단백질 합성 연구에 활용됩니다.

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<table><tbody><tr><td>6웰 플레이트용 세포 배양 삽입물, 1.0&nbsp; &mu; m 모공 크기, 불임</td><td>코닝</td><td>353102</td><td>소모품</td></tr><tr><td>6-웰 플레이트용 세포 배양 삽입물, 3.0&nbsp; &mu; m 모공 크기, 불임</td><td>셀트리트</td><td>230603</td><td>소모품</td></tr><tr><td>좁은 칼날의 셀 리프터</td><td>VWR</td><td>76036-006</td><td>소모품</td></tr><tr><td>CELLSTAR 6-웰 조직 배양 플레이트</td><td>VWR</td><td>82050-842</td><td>소모품</td></tr><tr><td>ddPCR 96-웰 플레이트 &nbsp;</td><td>바이오 라디</td><td>12001925</td><td>소모품</td></tr><tr><td>ddPCR 드롭렛 리더 오일 &nbsp;</td><td>바이오 라디</td><td>1863004</td><td>시약</td></tr><tr><td>QX200/QX100 드롭렛 제너레이터용 DG8 카트리지</td><td>바이오 라디</td><td>1864008</td><td>소모품</td></tr><tr><td>라미닌</td><td>깁코/피셔 사이언티브</td><td>23017-015</td><td>시약</td></tr><tr><td>루나스크립트 RT 슈퍼믹스 키트</td><td>NEB</td><td>E3010L</td><td>시약</td></tr><tr><td>형광 기반, 96웰, 검은색용 마이크로플레이트</td><td>써모피셔</td><td>M33089</td><td>소모품</td></tr><tr><td>PCR 플레이트 히트 씰, 호일, 피어싱 가능</td><td>바이오 라디</td><td>1814040</td><td>소모품</td></tr><tr><td>폴리-라이신</td><td>시그마</td><td>P1274</td><td>시약</td></tr><tr><td>PTC 템포 96 열 사이클러</td><td>바이오 라디</td><td>12015382</td><td>장비</td></tr><tr><td>QuantaSoft 소프트웨어</td><td>바이오-래드</td><td></td><td>PCR 데이터 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>Quant-it 리보그린 시약 및 RNA 분석 키트</td><td>써모피셔</td><td>R11490</td><td>시약</td></tr><tr><td>QX200 ddPCR 에바그린 슈퍼믹스</td><td>바이오 라디</td><td>1864034</td><td>시약</td></tr><tr><td>에바그린용 QX200 방울 생성 오일</td><td>바이오 라디</td><td>1864005</td><td>시약</td></tr><tr><td>QX200 액적 발생기</td><td>바이오 라디</td><td>17005227</td><td>장비</td></tr><tr><td>QX200 드롭렛 리더</td><td>바이오 라디</td><td>17005228</td><td>장비</td></tr><tr><td>트리졸 시약</td><td>인비트로젠</td><td>15-596-026</td><td>시약</td></tr></tbody></table>

다공성 막 삽입물과 rtddpcr을 이용한 축삭 mrna의 분리 및 정량

Isolation and Quantification of Axonal mRNAs Using Porous Membrane Inserts and RTddPCR

PLL 코팅된 1 μm 삽입물에 부착된 1차 설치류 설치류 피질 신경세포, 해마 신경세포, BFCN은 강하게 부착되어 5-7 일 동안 뇌돌을 시험관 내에서 5-7일 동안 막을 가로질러 확장됩니다. 11 DIV가 되면 배양 체계는 밀집된 네트워크를 보입니다. 성체 쥐 DRG의 경우, PLL 코팅된 3 μm 인서트에 라미닌 코팅을 추가하면 5 DIV 정도의 유사한 축삭 신장을 달성할 수 있습니다. 이러한 관찰은 삽입물이 장기적인 신경 성장을 지원하고 하류 RNA 추출을 위한 충분한 축삭 물질을 제공할 수 있음을 확인시켜 줍니다. 확장이 필요할 경우, 여러 인서트를 조합해 충분한 재료를 확보합니다.
개별 삽입물에서 추출한 TRIzol은 역전사와 이후 ddPCR에 충분한 RNA를 생성합니다. RiboGreen 정량 분석 결과, 전체 신경세포 분획에서는 RNA 수율이 일관되게 유지되고(212.85 ng/삽입물), 신경돌기 분획에서는 낮은 수율(42.75 ng/삽입물)이 나타났음을 확인했습니다(그림 2). 일반적으로 신경 세포 분획에서 약 5-7배 RNA를 얻는 반면, 신경돌 농축 분획에서는 그렇지 않습니다.
모든 프라이머는 RTddPCR 실험 전에 검증됩니다. 각 표적 전사체에 대해 최소 두 개의 프라이머 세트를 주문하여 동일한 신경 샘플에서 생성된 cDNA에 대한 기존 PCR을 사용해 검사합니다. 가장 강하고 특이적인 밴드를 생성하는 프라이머 쌍이 RTddPCR에 선택됩니다(그림 3A). 예를 들어, Gap43의 프라이머 세트 1을 선택했습니다. Actγ와 같이 모호한 결과가 있는 경우, 어닐링 온도를 최적화하기 위해 구배 PCR을 수행합니다(그림 3B). 이로 인해 절대 정량화에는 잘 검증된 프라이머만 사용되어 액적 분리 시 아티팩트 발생 가능성을 줄입니다.
긁고 면봉 채취 시술을 통해 체성 구획과 신경성 구획을 신뢰성 있게 분리합니다. 전체 신경 세포에서 분리된 RNA는 Actγ 46,47,48,49와 같은 전사체의 풍부함을 보인다(그림 4). 반면, 축삭/신경돌기 분획은 제한된 부피와 일치하여 총 RNA 수치가 현저히 낮지만, Gap43과 같은 원거리 돌기로 국소화되는 전사체의 풍부화를 보입니다(그림 4). 소모 제한 전사체의 최소한의 교차 검출은 삽입물을 신중하게 다루고 최적의 밀도로 플레이트를 부착할 때 구획 순도가 높음을 나타냅니다.
긍정적인 결과는 다음과 같은 점이 특징입니다: (1) 명확한 축삭 연장을 가진 온전한 신경 형태, (2) 막 파열 없이 구획의 깔끔한 분리, (3) 양과 음의 비말 간 뚜렷한 분리를 만드는 검증된 프라이머, (4) 축삭 전사체에 대한 강한 RTddPCR 신호. 최적의 실험은 낮은 RNA 수율, 신경돌기 분획 내 소마 마커로 나타나는 교차 오염, 또는 프라이머 이합체화로 인한 방울 '비' 증가와 같은 RTddPCR 인공물을 초래합니다. 이러한 문제들은 주로 삽입막 손상, 과도한 긁힘, 또는 프라이머 어닐링 온도 최적화 부족과 관련이 있습니다.
<img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig1.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
그림 1: 막 삽입물을 이용한 구획 특이적 RNA 분리 개요. 설치류 뉴런은 1-3 μm 크기의 반투과성 삽입물에서 배양되었으며, 이는 신경돌 확장을 허용하면서 소모를 제한합니다. 전체 신경세포 준비를 위해 상부 구획의 세포를 멸균 세포 스크레이퍼로 긁어내어 펠릿으로 제거한 후 TRIzol에 용해하여 RNA 분리, cDNA 합성, RTddPCR을 진행했습니다. 잔여 세포 찌질은 멸균 면봉으로 삽입막에서 제거되었습니다. 신경돌 준비를 위해 신경돌기만 포함된 삽입막을 뒤집어 메스로 절단한 후 TRIzol에 직접 담근 후 RNA 분리, cDNA 합성, RTddPCR을 시행했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 확대판을 보려면 여기를 클릭해 주세요.</a>
<img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
그림 2: RiboGreen 분석법을 이용한 표준 RNA 농도 곡선. (A) 희석 RNA 표준 연속에서 RiboGreen RNA 정량 분석법을 사용하여 형광 강도를 측정하였습니다. 선형 회귀 분석 결과, RNA 농도와 형광 신호 사이에 강한 상관관계가 있음이 밝혀졌습니다(R² = 0.9956). R² 값이 1에 가까운 것은 RiboGreen 분석법이 RNA 정량을 정확히 수행하는 데 있어 우수한 선형성과 신뢰성을 보여줍니다. (B) A에서 얻은 기울기의 방정식 (y=19.738x + 14.905)을 사용하여 각 분획에 대해 총 RNA를 계산했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.</a>
<img alt="그림 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
그림 3: PCR 및 아가로스 겔 전기영동을 이용한 프라이머 검증. (A) Actγ 와 Gap43 을 위한 cDNA를 이용한 PCR 증폭 산물을 2% 아가로스 겔에서 분리하여 프라이머 특이성을 평가하였다. 각 유전자에 대해 두 개의 독립적인 프라이머 세트(세트 1과 세트 2)가 검사되었습니다. DNA 크기 마커(사다리)는 분자량(10 kb, 0.5 kb, 0.1 kb)이 표시된 인접 레인에 표시됩니다. 예상 크기의 단일 밴드가 선택된 프라이머 세트의 성공적인 증폭과 특이성을 확인시켜 줍니다. (B) PCR 증폭은 온도 구배(55-65 °C)를 따라 Actγ 프라이머 세트 2를 사용하여 최적의 어닐링 온도를 결정하였습니다. 증폭된 산물은 DNA 사다리(레인 2, 크기 표시)와 함께 2% 아가로스 젤에서 분리되었습니다. 시험 범위 전역에서 예상 크기의 단일 밴드가 일관되게 관찰되었으며, 가장 강한 증폭은 55 °C에서 감지되어 이 프라이머 세트에 최적의 온도임을 시사합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig3v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.</a>
<img alt="그림 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
그림 4: 선택된 전사체의 RTddPCR 분석 및 mRNA 복사본의 정량화. (A,B) 액트γ와 (B) Gap43의 방울 분리를 보여주는 대표적인 1차원 진폭 플롯. 각 점은 단일 방울을 나타내며, 파란색 방울은 양의 증폭을, 회색 방울은 음의 증폭을 나타냅니다. Y축은 진폭을, X축은 ddPCR 플레이트의 웰 위치를 나타냅니다. 양성(파란색)과 음수(회색) 방울의 명확한 분리는 표시된 프라이머 세트로 표적 전사체의 견고한 검출을 확인시켜 줍니다. (C) 전체 뉴런 및 신경돌 분획에서 Actγ 및 Gap43 전사체의 총 RNA 복사본/μL 및 ng당 복사본 수를 요약한 표. 복제수 추정은 ddPCR 방울 수(패널 A, B에 표시됨)를 이용한 절대 정량화를 통해 얻어졌습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.</a>

다공성 막 삽입물과 RTddPCR을 이용한 축삭 mRNA의 분리 및 정량

The spatial dynamics of mRNA localization and translation within neurons are essential for various mechanisms of neuronal function, including neuronal ...

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이 동영상 기사에서 우리는의 분리 및 정제를위한 방법을...

의 분리 및 정제 Drosophila</em마그네틱 비드별로 정렬> 주변 뉴런

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학습하세요 다공성 막 삽입물을 이용한 축삭 mRNA 분리 및 RT-ddPCR 정량 방법을. 이 기술은 신경 세포체와 신경돌기를 분리하여 저발현 mRNA를 고감도로 검출하고 국소 단백질 합성 연구에 활용됩니다.

다공성 막 삽입물과 RTddPCR을 이용한 축삭 mRNA의 분리 및 정량

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