Name: 빠른 현장에서 하이브리드 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 학습하세요 패러포름알데히드 고정 뇌 조직에서 빠른 현장에서 하이브리드화 기법을 사용하여 htr2a 유전자 발현을 검출하는 방법을. 이 단순화된 프로토콜은 신경과학 연구에서 RNA 신호 정량 분석을 신속하게 수행할 수 있게 합니다.

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본 연구는 NIH 보조금 (R15DA029863)에 의해 지원되었다, 플로리다 애틀랜틱 대학의 학부 연구 보조금 (M30014) 및 동물 용 의약품의 연구 보조금의 로스 대학. 우리는이 일을 위해 (±) 3,4-methylenedioxymethamphetamine (± MDMA)를 제공하는 국립 약물 남용 연구소 (락빌, MD)에 감사의 말씀을 전합니다.

아래에 설명 된 동물 사용 절차는 동물 용 의약품의 로스 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)와 플로리다 애틀랜틱 대학에 의해 승인되었다. 멸균 기술과 장갑이 필요하지만이 프로토콜을 사용하는 동안의 RNase없는 환경이 필요하지 않습니다. 1. 준비 <ol><li> 조직 준비와 절편 <ol><li> 세 그룹으로 무작위로 쥐를 할당 :,, SAL / 접두사 및 / 3,4-methylenedioxymethamphetamine 접두사 신선한 / 식염수 (0.9 % NaCl을 SAL) (MDMA를 표 1에서 자세한 내용을 참조). </li><li> 2 시간 간격으로 SAL 및 MDMA 그룹, 복강, 각각 1 ㎖ / ㎏ SAL 및 10 ㎎ / ㎏ MDMA의 세 가지 용량을 관리합니다. 동물 6 일 동안 치료 살아남을 수 있습니다. </li><li> 7 일에, 5 mg의 조합에 100 ㎎ / ㎏ 케타민을 관리 / 복강 깊은 마취에 대한 쥐 (에 자일 라진을 kg 즉, 각막 깜짝 및 타 손실김정일이) 반사 신경을 꼬집어. </li><li> 신선한 / SAL 그룹의 경우, 신속하게 쥐 목을 벨과 (기준 5에서 세부 사항을 참조) 신선한 뇌 테스트 뇌를 제거합니다. </li><li> SAL / 접두사와 접두사 / MDMA 그룹의 경우, 흉골 약 10 -12 cm 따라 절단을 한 후 흉골의 끝을 노출. </li><li> 지혈제와 흉골의 끝을 잡고 날카로운 가위로 양쪽 측면 다이어프램을 절단 한 후 폐에 갈비와 병렬을 통해 위로 잘라. </li><li> 한 손으로, 작은 집게로 마음의 복부 끝을 잡고. 다른 한편으로, 18 G 주사기 바늘 좌심실 피어스 (빙냉 SAL과 파라 포름 알데히드 및 용기 연동 펌프에 Y 자형 실리콘 호스와 연결되어 바늘 어댑터 측에 유의 참조 기준 9). </li><li> 유량 (~ 5 ml / 분)의 중간 수준에서 SAL 펌프를 켜고 반환 CIRC의 탈출을 할 수 있도록 집게로 우심방에 구멍위험률. 30 분 동안 SAL 관류를 유지한다. </li><li> 중간 수준에서 파라 포름 알데히드 펌프를 켜고 얼음처럼 차가운 4 % 파라 포름 알데히드는 30 분 동안 동물을 관류 할 수 있습니다. </li><li> 관류 악기를 제거하고 동물의 목을 벨. 두개골의 정중선을 통해 절단 후 전방을 확인하고 두개골 캐비티 (10)를 노출하는 두개골 플랩. </li><li> 두개골 캐비티에서 주걱으로 뇌를 제거하고 25 ml를 4 % 파라 포름 알데히드를 포함하는 50 ML의 원심 분리기 튜브에 두뇌를 놓습니다. 24 시간 동안 4 ºC 냉장고에서 파라 포름 알데히드 함유 튜브 내 뇌를 유지합니다. </li><li> 3 일 4 ºC에서 30 % 자당 용액 25 ㎖를 함유하는 50 ㎖ 원심 분리 튜브로 이동 뇌. 마지막으로, 사용까지 -80 ° C에서 비닐 봉지 내 뇌를 저장합니다. </li><li> 내장 미디어 척에 두뇌를 탑재하고 -26 ºC의 온도에서 저온 유지 장치에 뇌가 포함 된 내장 미디어를 동결. 신선한 동결을 잘라n 개의 20 μm의 섹션으로 뇌와 10 μm의 섹션으로 뇌를 파라 포름 알데히드는-접두사. 섹션에 슬라이드를 터치하여 RT 현미경 슬라이드에 섹션을 전송합니다. </li><li> 공기 건조 4 시간 동안 실온에서. 사용까지 -80 ° C에서 꽉 밀봉 된 봉투에 섹션 슬라이드를 저장합니다. </li></ol></li><li> 탈수 <ol><li> -80 ° C의 냉동고에서 슬라이드를 타고 1 ~ 3의 시험에 섹션을 할당합니다 HT2A, ppiB (양성 대조군) 또는 dapB (음성 대조군); 마크와 공 펜 라벨 섹션 (연필을 사용하지 마십시오). 5 분 동안 실온에서 100 % 알코올에 슬라이드를 담근다. 흄 후드에서 5 분 동안 슬라이드를 건조. </li></ol></li><li> 전처리 <ol><li> 피펫 슬라이드 부분에 전처리-1 시약 20 μL (알칼리 포스 파타 아제의 불 활성화). 수분 트레이 선반 레일에 슬라이드를 배치 (트레이 반응 solutio로부터 증발을 방지하기위한 높은 습도를 유지하는 덮개로 덮여 있음에 유의N). </li><li> 조심스럽게 10 분 동안 저속으로 수평 통에 습기 트레이를 흔들. 2 분 동안 두 번 증류수 (DDH 2 O)로 두 번 슬라이드를 씻으십시오. (파라 포름 알데히드 고정에 의한 가교 결합의 파괴) -2- 전처리 시약을 150 ㎖을 함유하는 200 ml의 비이커에 슬라이드를 담근다. 100 ºC (RNA 구조 (11)의 열 - 유도 복원)에서 5 분의 총 슬라이드를 끓인다. </li><li> 2 분 동안 DDH 2 O로 두 번 슬라이드를 씻으십시오. 5 분 동안 100 % 알코올에 슬라이드를 놓습니다. 흄 후드에서 5 분 동안 슬라이드를 건조. 조직 섹션에서 선택된 영역 주위에 원을 그릴 소수성 펜을 사용하여 (예를 들어, 그림 2에 설명 된대로 시상과 시상 하부를 포함한 비 대뇌 피질의 구조). </li><li> 피펫 전처리-3 시약 선택한 각 영역 (프로브 침투의 증가)의 10 μL, 그리고 뚜껑 수분 트레이 커버. 하이브리드 오븐에서 트레이를 배치수평 교반기 장착 40 ºC 오븐 온도를 설정; 부드럽게 30 분 동안 트레이를 흔들. 2 분 동안 DDH 2 O로 두 번 슬라이드를 씻으십시오. </li></ol></li></ol> 2. 하이브리드 및 증폭 <ol><li> 피펫 선택된 영역에 각각 htr2a, ppiB 및 dapB 프로브 시약 10 μL,,. 시약의 증발을 방지하기 위해 뚜껑 수분 트레이 커버. 부드럽게 저속으로 설정 수평 진탕 기에서 흔들어. 2 시간 동안 오븐에서 40 ºC에서 슬라이드를 배양한다. </li><li> 2 분 동안 세척 버퍼로 두 번 슬라이드를 씻으십시오. 피펫 선택한 각 지역의 증폭-1 시약 10 μL, 흔들어 30 분간 40 ºC에서 슬라이드를 품어. </li><li> 2 분 동안 세척 버퍼로 두 번 슬라이드를 씻으십시오. 피펫 선택한 각 지역의 증폭-2 시약 10 μL, 흔들어 15 분 40 ºC에서 슬라이드를 품어. </li><li> 두 번 W 슬라이드를 씻으2 분 동안 세척 버퍼 번째. 피펫 선택한 각 지역의 증폭-3 시약 10 μL, 흔들어 30 분간 40 ºC에서 슬라이드를 품어. </li><li> 2 분 동안 세척 버퍼로 두 번 슬라이드를 씻으십시오. 피펫 선택한 각 지역의 증폭-4 시약 10 μL, 흔들어 15 분 40 ºC에서 슬라이드를 품어. </li><li> 2 분 동안 세척 버퍼로 두 번 슬라이드를 씻으십시오. 피펫은 각각의 선택된 영역 상에 증폭 -5- 시약 10 μL, 진탕​​하고, 30 분간 RT에서 슬라이드를 배양한다. </li><li> 2 분 동안 세척 버퍼로 두 번 슬라이드를 씻으십시오. 피펫 선택한 각 지역의 증폭-6 시약 10 μL, 흔들 실온에서 15 분 동안 슬라이드를 품어. 2 분 동안 세척 버퍼로 두 번 슬라이드를 씻으십시오. </li></ol> 3. 신호 감지 <ol><li> 각 선택 영역에 레드 시약의 피펫 10 μL은 (시약 레드-B와 레드의 혼합물이 1:60 비율로 내가 사용되어야합니다mmediately). 실온에서 수평 통에 습기 트레이에 슬라이드를 삽입하고 10 분 동안 저속으로 부드럽게 흔들어. </li><li> 10 분 동안 (DDH 2 O)로 두 번 슬라이드를 씻으십시오. 15 분 동안 오븐에서 60 ºC에서 슬라이드를 건조. 5 분 흄 후드에서 크실렌의 슬라이드를 놓습니다. 피펫 (20) 선택한 각 지역에 크실렌 기반 설치 미디어의 μL 및 커버 슬립 커버. </li></ol> 4. 이미지 캡처 <ol><li> 4 × 20 × 대물 렌즈의 배율 선택 영역 (예, 시상 하부는, 1과 3도)의 디지털 현미경 사진을 가져 가라. 이미지 파일을 저장합니다. </li></ol> 5. 이미지의 입자 분석 <ol><li> 드래그하여 주 ImageJ에 창에 이미지 파일을 놓습니다. 메뉴 표시 줄로 이동하여 &#39;이미지&#39;를 선택, 다음 드롭 다운 메뉴에서 &#39;형식&#39;을 선택하고 &#39;8 비트&#39;를 선택합니다. </li><li> 선택한 다음 &#39;의 Thr를 선택,&#39;조정 &#39;eshold은 &#39;대화 상자를 엽니 다. 원치 않는 배경이 제거되도록 대화 상자에서 낮은 바 값을 조정합니다. 다음 두 번째 대화 상자를 엽니 다 &#39;입자 분석&#39;을 선택, 메뉴 표시 줄로 이동하여 &#39;분석&#39;을 선택합니다. </li><li> (10)에서 입자 크기를 설정, 다음 &#39;쇼 개요&#39;를 선택하고 &#39;결과 표시&#39;와 &#39;요약한다&#39;상자를 선택합니다. 마지막으로, 대화 상자에 입자 데이터를 볼 수있는 &#39;확인&#39;을 클릭합니다. </li></ol> 6. 스프레드 시트 계산 <ol><li> 엑셀 시트에 데이터를 입력하고 기준으로 SAL 그룹에 입자의 수​​를 평균. 각 섹션의 백분율 레벨을 계산하고 그에 따라 그래프 (도 4)를 만든다. </li></ol>

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</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

in situ hybridization 테스트의 주요 관심사 중 하나는 RNase 효소로 인해 RNA 보존에 사용되는 적절한 기술을 선택하는 것입니다. 이러한 효소가 결과에 영향을 미칠 수 있는 세포와 환경에 널리 존재한다는 것은 잘 알려져 있습니다. 그러나 효소 활성은 조직을 드라이아이스/알코올 용액에 넣음으로써 빠르게 구별할 수 있습니다5,12. 리보프로브13를 사용한 혼성화에는 빠른 보존이 중요하지만 올리고뉴클레오티드 프로브의 실험 조건에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한 이 연구에서 우리는 얼음/알코올 용액에 빠르게 보존된 파라포름알데히드 접두사가 붙은 신선한 뇌와 사이에 차이가 없음을 발견했습니다. 이는 파라포름알데히드 접두사가 붙은 뇌 RNA가 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한 혼성화의 품질에 유의미한 영향을 미치지 않았음을 시사합니다. 접두사가 붙은 뇌는 신선한 뇌에 비해 쉽게 절편되기 때문에 이 프로토콜은 혼성화 테스트를 ...

세로토닌 (5-하이드록시트립타민; 5-HT) 증후군은 항우울제1와 같은 5-HT 촉진 약물에 의해 발생하는 급성 신경 질환이며, 레크리에이션 목적으로 MDMA를 사용하는 상황에서도 발생한다2. 급성 증후군과 관련하여 발생하는 기분 변화, 학습 및 기억력 결핍의 원인이 되는 분자 메커니즘은 잘 알려져 있지 않다3,4. In situ hybridization은 단일 세포 수준에서 잠재적으로 발현되는 특정 mRNA의 검출 및 정량화를 가능하게 하는 강력한 연구 도구입니다. in situ hybridization을 수행하는 일반적인 방법은 관심 유전자를 특이적으로 혼성화하는 방사성 표지 리보프로브를 사용하는 것입니다. 그러나 주요 단점은 이 방법이 복잡하고 시간이 많이 걸리는 프로브 준비 및 혼성화 단계뿐만 아니라 RNase가 없는 환경에서 유지되는 신선한 냉동 조직에 대한 접근이 필요하다는 것입니다5,6. 
올리고뉴클레오티드 프로브는 리보프로브에 필요한 것보다 더 짧은 RNA 단편을 혼성화하기 위해 최근에 개발되었습니다7. 또한 프로브는 특이성8을 희생하지 않고 낮은 백그라운드 신호를 생성합니다. 이 새로 개발된 프로브 기술은 면역세포화학 실험실에서 일반적으로 사용할 수 있는 파라포름알데히드 접두사가 있는 뇌 조직에서 in situ hybridization에 사용할 수 있습니다.
여기에서는 파라포름알데히드 접두사가 붙은 쥐의 뇌에서 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 현장 교잡을 위한 프로토콜을 설명하고 그 결과를 신선 냉동 뇌에서 언급된 것과 비교합니다5,6. 이 프로토콜은 MDMA 물질 남용이 뇌의 5-HT2A 수용체 유전자 htr2a mRNA의 변화를 일으킨다는 가설을 테스트하는 데 사용됩니다. MDMA 처리로 절차를 시작한 후 동물의 파라포름알데히드 조직 관류, thr2a 프로브의 현장 혼성화 및 데이터 분석이 이어졌습니다. dapB(디하이드로디피콜리네이트 환원효소를 암호화하는 박테리아 유전자)는 음성 대조군으로, ppiB(펩티딜프롤릴 이소머라제 B를 암호화하는 하우스키핑 유전자)는 양성 대조군으로 사용됩니다.

<table><tbody><tr><td>RNAscope 음성 대조군 프로브-DapB</td><td>고급 세포 진단, INC</td><td>310098</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope 전처리 4</td><td>고급 세포 진단, INC</td><td>320046</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope 2.0 HD 시약 키트 - 빨간색</td><td>고급 세포 진단, INC</td><td>310036</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope 프로브 - Rn-Ppib</td><td>고급 세포 진단, INC</td><td>313921</td><td></td></tr><tr><td>쥐 Htr2a</td><td>고급 세포 진단, INC</td><td>300031</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM 1850</td><td></td></tr><tr><td>수평 셰이커</td><td>VWR</td><td>88032-088</td><td></td></tr><tr><td>하이브리드화 오븐</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>222000</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>소수성 펜</td><td>벡터</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Olympus</td><td>Provis AX70</td><td></td></tr></tbody></table>

빠른<em&gt; 현장에서</em세로토닌 증후군 쥐의 파라 포름 알데히드 - 접두사 뇌에 올리고 뉴클레오티드 프로브를 사용하여&gt; 하이브리드

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

3,4-Methylenedioxymethamphetamine(MDMA, 엑스터시) 독성은 급성 세로토닌(5-하이드록시트립타민, 5-HT) 증후군으로 인해 세로토닌 mRNA 발현에 부위 특이적 변화를 일으킬 수 있습니다. 이 가설은 세로토닌 5-HT2A 수용체 유전자 htr2a를 검출하기 위해 현장 혼성화를 사용하여 테스트할 수 있습니다. 과거에는 방사성 리보프로브를 사용하는 이러한 절차가 수행하는 데 며칠이 필요한 복잡한 작업 흐름과 RNase가 없는 환경에서 유지되는 신선한 냉동 조직을 사용해야 하는 추가 어려움으로 인해 어려웠습니다. 최근에는 짧은 올리고뉴클레오티드 프로브의 개발로 제자리 혼성화 절차가 단순화되고 실험실에서 더 널리 사용할 수 있는 파라포름알데히드 접두사가 붙은 뇌 절편을 사용할 수 있게 되었습니다. 여기에서는 접두사가 있는 뇌 조직에 비방사성 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 연구에 사용된 혼성화 프로브에는 dapB(디하이드로디피콜리네이트 환원효소를 암호화하는 박테리아 유전자), ppiB(펩티딜프롤릴 이소머라제 B를 암호화하는 하우스키핑 유전자) 및 htr2a(5-HT2A 수용체를 위한 세로토닌 유전자 암호화)가 포함됩니다. 이 방법은 비교적 간단하고 저렴하며 재현 가능하며 완료하는 데 2일도 채 걸리지 않습니다.

올리고 뉴클레오티드 RNA 프로브 (&lt;25 NT)를 사용하여, 하이브리드는 파라 포름 알데히드 - 접두사 및 냉동 뇌에서 준비 시상 하부 세포에서 빨간 점으로 검출 할 수있다. htr2a mRNA의 분자 (실선 화살표로 표시됨) 일부 셀에 존재하는, 그러나 기타 (개방 화살표). 우리는 파라 포름 알데히드 접두어 및 냉동 조직 (도 1) 사이에 차이가없는 것을 관찰했다. 성공적인 하이브리드는 육안 (그림 2)에 의해 처음으로 평가 될 수있다. 우리는 dapB 프로브와 하이브리드 (원 표시) 선택된 영역이 육안 (도 2A-B)에 보이는 신호를 표시하지 않은 것으로 나타났다. 대조적으로, ppiB 프로브와 하이브리드 영역은 균일하게 조사 영역 (도 2C-D)에 걸쳐 분산 신호를 보여 주었다. htr2a 테스트 중에, 신호는 화살표로 나타낸 특...

이 프로토콜은 파라포름알데히드 접두사가 붙은 뇌에 이상적인 빠르고 단순화된 현장 혼성화 방법을 설명하므로 신선한 냉동 조직을 사용하는 동안 장기간의 복잡한 단계의 필요성을 줄입니다. 이 방법은 쥐에서 세로토닌 5-HT2A 수용체 유전자 htr2a의 식별을 사용하여 검증되었습니다.

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

이 절차의 전반적인 목표는 파라포름알데히드로 고정된 뇌 조직에서 신속한 in C two 하이브리다이제이션을 수행하는 것입니다. 이는 먼저 뇌 조직 절편을 탈수하고 전처리 1, 2, 3 시약으로 처리함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 절편을 1차 올리고뉴클레오타이드 프로브와 하이브리다이제이션한 다음, 2차, 3차 및 4차 프로브를 처리하는 것입니다.다음으로, 표적 RNA를 검출하기 위해 fast red 기질을 첨가합니다. 마지막 단계는 Image J 소프트웨어를 사용하여 mRNA 신호 수준을 정량화하는 것입니다. 최종적으로, 실험군과 대조군을 비교함으로써 RNA 유전자 발현의 변화를 확인할 수 있습니다.기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 상대적으로 단순하고 저렴하며 재현성이 높고, 완료하는 데 이틀이 채 걸리지 않는다는 점입니다. 이 연구는 Ross University School of Veterinary Medicine의 저와 John Jay Lenan, 그리고 Florida Atlantic University 의과대학의 Jean Soza 및 RU Tao가 공동으로 개발하였습니다. 이 절차에서, 탈수를 위해 -80 °C 냉동고에 보관된 현미경 슬라이드 박스에서 슬라이드 4장을 꺼냅니다.P-P-I-B-D-A-P-B 및 HT 두 A 유전자의 테스트 구역을 지정하고 볼펜으로 표시 및 라벨링합니다. 다음으로, 슬라이드를 상온의 100% alcohol에 5분 동안 담급니다. 그 후 흄 후드 내에서 5분 동안 슬라이드를 건조시킵니다. 전처리를 위해 각 구역에 전처리 시약 1(pretreatment one reagent) 20 µL를 피펫으로 분주하고, 슬라이드를 습도 트레이의 랙 레일에 놓습니다.수평 셰이커에서 저속으로 10분 동안 습도 트레이를 부드럽게 흔들어 줍니다. 그다음 2중 증류수로 슬라이드를 2분 동안 두 번 세척합니다. 450 milliliters의 전처리 시약 2가 담긴 1000 milliliter 비커에 슬라이드를 침지시킵니다.다음으로, RNA 구조를 복원하기 위해 슬라이드를 100 °C에서 총 5분 동안 끓입니다. 그 후, 이중 증류수로 슬라이드를 2분씩 2회 세척합니다. 슬라이드를 100% 알코올에 5분 동안 담급니다.그 후 슬라이드를 5분 동안 건조합니다. 흄 후드 내에서 소수성 펜을 사용하여 조직 절편의 선택된 영역 주변에 원을 그립니다. 이어서, 프로브 침투력을 높이기 위해 각 선

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연구

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신경과학

이 프로토콜은 아닌 방사성을...

더블 형광 현장에서</em신선한 두뇌 섹션> 하이브 리다이 제이션

우리는 PTSD 환자의 특징 neuroendocrine 기능의 영구적 인 변경 및 지연, 장기, 과장된 공포 반응을 보여 후 외상 후 스트레스 장애 (PTSD)의 쥐 모델을 설명합니다. 동물 모델과 여기에 설명 된 방법은 기계론의이지만 주변 흰색 혈액 세포의 생체과 함께, 환자로 측정 할 수없는 뇌 핵에 생체, 수를 상호 연관 유용합니다.

PTSD의, 신경 Hematologic, 그리고 행동 상관 관계를 누설하는 행위에 대해서는 동물 모델에서 생체

이 비디오는 세로토닌 증후군의 영향을 받는 쥐의 뇌 조직에서 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 세로토닌 수용체 RNA 합성을 감지하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜에는 조직 전처리, 프로브 혼성화 및 효소 검출이 포함되어 현미경으로 세로토닌 수용체 RNA 발현을 시각화하고 정량화합니다.

쥐 뇌 절편에서 RNA 발현을 연구하기 위해 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한 현장 혼성화

출처: Jolly, S., et.al. 이중 형광 In situ hybridization과 면역 라벨링을 결합하여 마우스 뇌 섹션에서 3개의 유전자 발현을 검출합니다. J. Vis. 특급 (2016). 이 비디오는 이중 형광 in situ hybridization을 사용하여 마우스 뇌 섹션에서 두 RNA 표적의 발현을 시각화하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 플루오레세인 이소티오시아네이트 및 디곡시게닌으로 표지된 프로브를 사용하여 RNA를 순차적으로 검출한 다음 효소 신호 증폭을 통해 감도를 향상시키는 것을 포함합니다. 그 결과 생성된 형광은 조직 내 표적 RNA의 공동 국소화 분석을 가능하게 합니다.

 Performing Double Fluorescence In Situ Hybridization to Detect Gene Expression in Mouse Brain Sections(쥐 뇌 절편에서 유전자 발현을 검출하기 위한 이중 형광 혼성화)

RNA in situ hybridization (ISH)는 세포와 조직에서 RNA를 시각화할 수 있습니다. 여기에서는 RNAscope ISH와 면역조직화학 또는 조직학적 염료의 조합을 사용하여 마우스와 인간 뇌 섹션에서 축삭돌기에 국한된 mRNA를 검출하는 방법을 보여줍니다.

고해상도를 사용하여 뇌 섹션에서 Axonally 지역화 된 mRNA를 검출<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

특정 세포 유형에 대한 유전자 발현을 국소화하는 것은 특정 항체가 없기 때문에 어려울 수 있습니다. 여기에서는 이중 형광 RNA in situ hybridization과 immunostaining을 결합하여 유전자 발현을 동시에 삼중 검출하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

더블 형광 결합<em&gt; 현장에서</em&gt; 마우스 뇌 섹션에서 세 가지 유전자의 발현의 검출을위한 Immunolabelling와 하이브리드

우리는 쥐의 뇌의 편측성 반구에 반복적인 경두개 자기 자극(rTMS)을 적용하여, 양귁 선의 꼭짓점에서 1cm 측면으로 25mm 8자형 코일을 배치하고 코일을 45° 각도화하여 적용했습니다. rTMS를 위해 사내 수냉식 시스템이 20분 이상 사용되었습니다.

쥐 뇌의 일방적 인 북반구에 반복 경 두개 자기 자극

핵 accumbens에 있는 도파민 D1-알파 수용 체의 식별은 중앙 신 경계 질환 중 D1 수용 체 역 기능을 명확히 중요 합니다. 우리는 새로운 RNA 제자리에서 교 잡 분석 결과 시각화 특정 뇌 영역에 하나의 RNA 분자를 수행.

탐지 기술 현장에서 혁신적인 RNA에 의해 설치류 핵 Accumbens에서 도파민 D1-알파 수용 체의 식별

DetectSyn은 치료 또는 질병 상태에 걸친 상대적 시냅스 (시냅스 전 및 시냅스 후 참여) 수의 변화를 측정하는 편향되지 않은 신속한 형광 분석법입니다. 이 기술은 배양된 뉴런 및 고정 조직 모두에서 사용될 수 있는 근접 라이게이션 기술을 이용한다.

DetectSyn: Synapse 밀도의 변화를 감지하는 빠르고 편향되지 않은 형광 방법

우리는 쥐 맥락막신경총에서 인슐린 수용체 이성질체 IR-A 및 IR-B를 매핑하기 위해 Duplex in situ hybridization assay를 구축하여 기존 방법의 한계를 극복했습니다. 이 고해상도 접근법은 동형(isoform) 특이적 발현을 밝혀 뇌 인슐린 신호전달에 대한 새로운 통찰력과 신경 장애에 대한 잠재적인 동형(isoform) 표적 치료에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다.

RNA In Situ Hybridization Assay를 사용한 쥐 뇌의 인슐린 수용체 A 및 B의 정확한 시각화

학습하세요 패러포름알데히드 고정 뇌 조직에서 빠른 현장에서 하이브리드화 기법을 사용하여 htr2a 유전자 발현을 검출하는 방법을. 이 단순화된 프로토콜은 신경과학 연구에서 RNA 신호 정량 분석을 신속하게 수행할 수 있게 합니다.

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