빠른 현장에서 하이브리드

이 절차의 전반적인 목표는 파라폼 알데히드 접두사가 있는 뇌 조직에서 C에서 빠른 2 혼성화를 수행하는 것입니다. 이는 먼저 뇌 조직 절편을 탈수하고 전처리 1, 2, 3 시약으로 절편을 처리함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 단면을 1차 올리고뉴클레오티드 프로브와 하이브리드화한 다음 두 번째, 세 번째 및 네 번째 프로브로 하이브리드화하는 것입니다.

다음으로, 표적 RNA를 검출하기 위해 빠른 빨간색 기질을 추가합니다. 마지막 단계는 Image J 소프트웨어를 사용하여 mRNA 신호 수준을 정량화하는 것입니다. 궁극적으로 RNA 유전자 발현의 변화는 실험군과 대조군을 비교하여 얻을 수 있습니다.

기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 비교적 간단하고 저렴하게 재현할 수 있으며 완료하는 데 2일도 채 걸리지 않는다는 것입니다. 이 작업은 저와 Ross University School of Veterinary Medicine의 John Jay Lenan, Florida Atlantic University 의과대학의 Jean Soza와 RU Tao가 개발했습니다. 이 절차에서 그녀의 탈수는 섭씨 80도의 음의 냉동고에 보관된 현미경 슬라이드 상자에서 4개의 슬라이드를 가져옵니다.

P-P-I-B-D-A-P-B 및 HT 테스트에 섹션을 할당하고 두 개의 A 유전자 표시를 하고 볼펜으로 레이블을 지정합니다. 그런 다음 슬라이드를 실온에서 100% 알코올에 5분 동안 담급니다. 그런 다음 전처리 피펫 20 마이크로 리터의 전처리 피펫을 위해 흄 후드에서 슬라이드를 5 분 동안 건조시키고 각 섹션에 하나의 시약을 놓고 슬라이드를 수분 트레이의 랙 레일에 놓습니다.

수평 셰이커의 수분 트레이를 저속으로 10분 동안 부드럽게 흔듭니다. 그런 다음 이중 증류수로 슬라이드를 2분 동안 두 번 세척합니다. 450밀리리터의 전처리 2개 시약이 들어 있는 1000밀리리터 비커에 슬라이드를 담그십시오.

다음으로, 슬라이드를 섭씨 100도에서 총 5분 동안 끓여서 RNA 구조를 복원합니다. 그런 다음 이중 증류수로 슬라이드를 두 번 두 번 씻을 때마다 2분씩 씻습니다. 슬라이드를 100% 알코올에 5분 동안 넣습니다.

그런 다음 슬라이드를 5분 동안 건조시킵니다. 흄 후드에서 소수성 펜을 사용하여 조직 섹션에서 선택한 영역 주위에 원을 그립니다. 그 후, 10 마이크로 리터의 전처리 시약을 선택한 각 영역에 피펫팅하여 프로브 침투를 증가시키고 수분 트레이를 뚜껑으로 덮습니다.

다음으로, 수평 셰이커가 장착된 하이브리드화 오븐에 트레이를 놓습니다. 오븐 온도를 섭씨 40도로 설정하고 트레이를 30분 동안 부드럽게 흔든 다음 매번 2분씩 이중 증류수로 슬라이드를 두 번 씻습니다. 이 단계에서는 선택한 영역에 10 마이크로 리터의 P-P-I-B-D-A-P-B 또는 HTR 2 A 프로브를 피펫팅합니다.

그런 다음 시약의 증발을 방지하기 위해 수분 트레이를 뚜껑으로 덮습니다. 수평 셰이커의 슬라이드를 저속으로 부드럽게 흔들면서 섭씨 40도의 오븐에서 2시간 동안 배양합니다. 다음으로, 매번 2분 동안 세척 버퍼로 슬라이드를 두 번 세척하고 선택한 각 영역에 1개의 시약 증폭 시약을 10마이크로리터로 피펫팅합니다.

슬라이드를 흔들어 섭씨 40도에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 매번 2분 동안 세척 버퍼로 슬라이드를 두 번 세척하고 선택한 각 영역에 10마이크로리터의 증폭 시약을 2개 피펫으로 세척합니다. 슬라이드를 흔들어 섭씨 40도에서 15분 동안 배양합니다.

그 후, 세탁 버퍼로 슬라이드를 2분 동안 두 번 씻습니다. 매번, 10 마이크로 리터의 증폭 3 시약을 선택한 각 영역에 피펫팅합니다. 슬라이드를 흔들어 섭씨 40도에서 30분 동안 배양합니다.

그런 다음 세탁 버퍼로 슬라이드를 2분 동안 두 번 세척합니다. 피펫: 10 μl의 증폭, 선택한 각 영역에 4개의 시약. 슬라이드를 흔들어 섭씨 40도에서 15분 동안 배양합니다.

다음으로, 세탁 버퍼로 슬라이드를 2분 동안 두 번 세탁합니다. 피펫 10 마이크로 리터의 증폭 5 시약을 선택한 각 영역에 넣습니다. 슬라이드를 흔들어 실온에서 30분 동안 배양합니다.

그런 다음 세탁 버퍼로 슬라이드를 2분 동안 두 번 세척합니다. 피펫, 10 μl의 증폭 시약, 선택된 각 영역에 6 개의 시약. 슬라이드를 흔들어 실온에서 15분 동안 배양합니다.

그런 다음 매번 2분 동안 세탁 버퍼로 슬라이드를 다시 두 번 세척합니다. 이제 선택한 각 영역에 10 마이크로 리터의 빨간색 시약을 피펫으로 넣고 실온에서 수평 셰이커의 수분 트레이에 슬라이드를 놓고 10 분 동안 저속으로 부드럽게 흔듭니다. 그런 다음 이중 증류수로 10분 동안 슬라이드를 두 번 세척합니다.

매번 슬라이드를 섭씨 60도의 오븐에서 15분 동안 건조시킵니다. 그 후, 5분 동안 흄 후드에 자일렌에 슬라이드를 놓습니다. 다음으로, 선택한 각 영역에 20마이크로리터의 자일렌 기반 장착 매체를 피펫팅하고 커버 슬립으로 덮습니다.

이 단계에서는 이미지 파일을 기본 이미지 J 창으로 끌어다 놓습니다. 메뉴 표시줄로 이동하여 이미지를 선택합니다. 그런 다음 드롭다운 메뉴에서 유형을 선택하고 8비트를 선택합니다.

그런 다음 조정을 선택한 다음 임계값을 선택하여 대화 상자를 엽니다. 대화 상자에서 아래쪽 막대 값을 조정하여 원하지 않는 배경이 제거되도록 합니다. 메뉴 표시줄로 이동하여 Analyze(분석)를 선택한 다음 analyze particles(파티클 분석)를 선택하여 두 번째 대화 상자를 엽니다.

입자 크기를 10으로 설정합니다. 다음으로, 개요 표시를 선택하고 결과 표시 및 상자 요약을 선택합니다. 마지막으로 확인을 클릭하여 대화 상자에서 입자 데이터를 봅니다.

스프레드시트 계산을 위해 Excel 시트에 데이터를 입력하고 식염수 그룹의 입자 수를 기준선으로 평균화합니다. 그런 다음 각 섹션의 백분율 수준을 계산하고 그에 따라 그래프를 만듭니다. 다음은 빨간색 점으로 표시된 혼성화 신호의 광시적 모습입니다.

조직은 이전에 식염수와 MDMA로 처리된 심부 마취된 쥐에서 파라폼 알데히드를 접두사로 붙였습니다. 사용된 올리고뉴클레오티드 프로브는 D-A-P-B-P-P-I-B이며, HT 2 A.이 그림은 이전에 MDMA로 처리된 쥐에서 시상하부 HT 2 A 유전자 발현에 미치는 영향을 보여주고 HT 2에서 20% 감소, 발현이 관찰되었습니다. 이 기술은 신경과학 분야의 연구자들이 키가 앞에 붙은 뇌 조직인 파라폼(paraform)의 제자리화(in situ ization)를 사용하여 메신저 R a의 유전자 발현을 더 쉽게 측정할 수 있도록 합니다.