빠른

이 절차의 전반적인 목표는 파라포름알데히드로 고정된 뇌 조직에서 신속한 in C two 하이브리다이제이션을 수행하는 것입니다. 이는 먼저 뇌 조직 절편을 탈수하고 전처리 1, 2, 3 시약으로 처리함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 절편을 1차 올리고뉴클레오타이드 프로브와 하이브리다이제이션한 다음, 2차, 3차 및 4차 프로브를 처리하는 것입니다.

다음으로, 표적 RNA를 검출하기 위해 fast red 기질을 첨가합니다. 마지막 단계는 Image J 소프트웨어를 사용하여 mRNA 신호 수준을 정량화하는 것입니다. 최종적으로, 실험군과 대조군을 비교함으로써 RNA 유전자 발현의 변화를 확인할 수 있습니다.

기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 상대적으로 단순하고 저렴하며 재현성이 높고, 완료하는 데 이틀이 채 걸리지 않는다는 점입니다. 이 연구는 Ross University School of Veterinary Medicine의 저와 John Jay Lenan, 그리고 Florida Atlantic University 의과대학의 Jean Soza 및 RU Tao가 공동으로 개발하였습니다. 이 절차에서, 탈수를 위해 -80 °C 냉동고에 보관된 현미경 슬라이드 박스에서 슬라이드 4장을 꺼냅니다.

P-P-I-B-D-A-P-B 및 HT 두 A 유전자의 테스트 구역을 지정하고 볼펜으로 표시 및 라벨링합니다. 다음으로, 슬라이드를 상온의 100% alcohol에 5분 동안 담급니다. 그 후 흄 후드 내에서 5분 동안 슬라이드를 건조시킵니다. 전처리를 위해 각 구역에 전처리 시약 1(pretreatment one reagent) 20 µL를 피펫으로 분주하고, 슬라이드를 습도 트레이의 랙 레일에 놓습니다.

수평 셰이커에서 저속으로 10분 동안 습도 트레이를 부드럽게 흔들어 줍니다. 그다음 2중 증류수로 슬라이드를 2분 동안 두 번 세척합니다. 450 milliliters의 전처리 시약 2가 담긴 1000 milliliter 비커에 슬라이드를 침지시킵니다.

다음으로, RNA 구조를 복원하기 위해 슬라이드를 100 °C에서 총 5분 동안 끓입니다. 그 후, 이중 증류수로 슬라이드를 2분씩 2회 세척합니다. 슬라이드를 100% 알코올에 5분 동안 담급니다.

그 후 슬라이드를 5분 동안 건조합니다. 흄 후드 내에서 소수성 펜을 사용하여 조직 절편의 선택된 영역 주변에 원을 그립니다. 이어서, 프로브 침투력을 높이기 위해 각 선택된 영역에 전처리 시약 3을 10 µL씩 피펫으로 분주하고 습도 유지 트레이를 덮개로 덮습니다.

다음으로, 수평 진탕기가 장착된 하이브리드화 오븐에 트레이를 넣습니다. 오븐 온도를 40 °C로 설정하고 트레이를 30분 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 그 후, 슬라이드를 2중 증류수로 각각 2분씩 두 번 세척합니다. 이 단계에서, 선택한 영역에 10 µL의 P-P-I-B-D-A-P-B 또는 HTR two A 프로브를 피펫으로 분주합니다.

그런 다음 시약의 증발을 막기 위해 습도 트레이를 덮개로 덮습니다. 슬라이드를 오븐에서 40 °C로 2시간 동안 배양하면서 수평 셰이커를 이용해 낮은 속도로 부드럽게 흔들어 줍니다. 다음으로, 슬라이드를 세척 버퍼로 2분씩 두 번 세척한 후, 선택된 각 영역에 증폭 시약 1을 10 µL씩 피펫으로 분주합니다.

슬라이드를 40 °C에서 30분 동안 흔들어 배양합니다. 그런 다음 세척 버퍼로 슬라이드를 2분씩 2회 세척하고, 선택한 각 영역에 증폭 시약 2를 10 µL씩 피펫팅합니다. 슬라이드를 40 °C에서 15분 동안 흔들어 배양합니다.

그 후, 슬라이드를 세척 버퍼로 2분 동안 두 번 세척합니다. 매회 선택된 각 영역에 amplification three 시약 10 µL를 피펫으로 분주합니다. 슬라이드를 흔들어 섞은 후 40 °C에서 30분 동안 배양합니다.

그 다음 세척 버퍼로 슬라이드를 2분 동안 두 번 세척합니다. 선택된 각 영역에 증폭 시약 4를 10 µL씩 피펫팅합니다. 슬라이드를 흔들어 섞은 후 40 °C에서 15분 동안 배양합니다.

다음으로, 슬라이드를 세척 완충액으로 2분 동안 두 번 세척합니다. 선택한 각 영역에 증폭 시약 5를 10 µL씩 피펫팅합니다. 슬라이드를 흔들어 섞은 후 실온에서 30분 동안 배양합니다.

그 후, 슬라이드를 세척 버퍼로 2분 동안 두 번 세척합니다. 선택한 각 영역에 증폭 시약 6를 10 µL씩 분주합니다. 슬라이드를 흔들어 섞은 후 실온에서 15분 동안 배양합니다.

그 다음 슬라이드를 세척 버퍼로 2분씩 2회 더 세척합니다. 이제 선택한 각 영역에 적색 시약 10 µL를 피펫으로 분주하고, 슬라이드를 실온의 수평 진탕기에 있는 습도 유지 트레이에 넣은 뒤 저속으로 10분간 부드럽게 흔들어 줍니다. 그런 다음 2중 증류수로 슬라이드를 10분 동안 2회 세척합니다.

매회 슬라이드를 오븐에서 60 °C로 15분 동안 건조하십시오. 그 후, 흄후드 내의 자일렌에 슬라이드를 5분 동안 담가 둡니다. 다음으로, 선택된 각 영역에 자일렌 기반 마운팅 매질 20 µL를 피펫으로 분주하고 커버 슬립으로 덮으십시오.

이 단계에서는 이미지 파일을 메인 ImageJ 창으로 드래그 앤 드롭하십시오. 메뉴 바에서 Image를 선택합니다. 다음으로 드롭다운 메뉴에서 Type을 선택하고 8-bit를 선택하십시오.

다음으로, adjust를 선택한 후 threshold를 선택하여 대화 상자를 엽니다. 대화 상자의 하단 바 값을 조절하여 불필요한 배경을 제거합니다. 메뉴 바에서 Analyze를 선택한 다음, analyze particles를 선택하여 두 번째 대화 상자를 엽니다.

입자 크기를 10으로 설정하십시오. 다음으로, 외곽선 표시(show outlines)를 선택하고 결과 표시 및 요약 상자(display results and summarize boxes)를 선택하십시오. 마지막으로, 확인(okay)을 클릭하여 대화 상자에서 입자 데이터를 확인하십시오.

스프레드시트 계산을 위해 데이터를 Excel 시트에 입력하고, 기준선으로서 식염수 군의 입자 수 평균을 구합니다. 그런 다음 각 섹션의 백분율 수준을 계산하고 그에 따라 그래프를 작성합니다. 다음은 빨간색 점으로 표시된 하이브리다이제이션 신호의 광학 현미경 관찰 모습입니다.

식염수와 MDMA를 사전 처리하여 깊은 마취 상태에 있는 쥐의 조직을 파라포름알데히드로 고정하였습니다. 사용된 올리고뉴클레오타이드 프로브는 D-A-P-B-P-P-I-B와 HT two A입니다. 이 그림은 MDMA를 사전 처리한 쥐의 시상하부 HT two A 유전자 발현에 미치는 영향을 보여주며, HT two A 발현이 20% 감소한 것이 관찰되었습니다. 이 기술은 파라포름알데히드로 고정된 뇌 조직의 in situ hybridization을 이용하여 신경과학 분야의 연구자들이 메신저 RNA의 유전자 발현을 더 쉽게 측정할 수 있게 해줍니다.