생리 활성, PCL 기반 "셀프 피팅"형상 기억 폴리머 비계의 제작

다음 실험의 전반적인 목표는 불규칙한 두개악안면 결손 부위에 스스로 맞춤형으로 장착되어 골유착 및 치유를 촉진할 수 있는 형상기억고분자(SMP) 지지체를 제작하는 것입니다. 이는 먼저 용매 캐스팅과 polycaprolactone di acrl의 광화학적 경화를 이용하여 융합 염 템플릿을 형성함으로써 달성됩니다. 염 템플릿 위로 골전도성에 필요한 고도의 상호 연결된 다공성을 가진 지지체가 형성됩니다.

두 번째 단계로, 생체 활성을 부여하기 위해 스캐폴드를 폴리 도파민으로 코팅합니다. 다음으로, 스캐폴드를 따뜻한 식염수로 처리하여 불규칙한 모델에 압입(press fit)될 수 있도록 합니다. 압입 결과, 주사 전자 현미경 이미지 및 in vitro 하이드록시아파타이트 형성을 통해 자가 적합성, 낮은 상호 연결성 및 생체 활성을 나타내는 결함 결과가 도출됩니다.

자가 이식과 같은 기존 방법보다 이 기술이 갖는 주요 장점은, 구현된 적응형 피팅이 골융합과 골치유를 결정적으로 지원한다는 점입니다. 본 절차의 시연은 저희 연구실의 박사 과정 연구원인 Lindsey Nail이 맡았습니다. 지지체 준비를 시작하기 위해, 먼저 염화나트륨을 425 micron 체로 거른 후 1.8 grams를 3 liter 유리 바이알에 옮깁니다. 그 다음 146 milligrams의 탈이온수를 바이알에 천천히 첨가하며 금속 스패튤라로 혼합합니다.

각 첨가 후 바이알의 뚜껑을 닫고 티슈로 감싼 뒤 원심분리 튜브에 수직으로 넣습니다. 튜브를 15분 동안 원심분리한 후 뚜껑을 열어 용액을 하룻밤 동안 자연 건조시킵니다. 텍스트 프로토콜에 명시된 대로 P-C-L-D-A를 합성한 후, 유리 바이알에 chloro methane 1mL당 150mg의 P-C-L-D-A가 포함된 메이저(macer) 용액을 준비하고, 바이알의 뚜껑을 닫고 호일로 감싼 뒤 1분 동안 볼텍싱합니다.

다음으로, 유리 바이알에 1 mL의 1-vinyl-2-pyrrolidone 내에 115 mg의 DMP를 포함하는 광개시제 용액을 준비합니다. 다시 바이알의 뚜껑을 닫고 알루미늄 호일로 감싼 뒤, 1분 동안 볼텍싱합니다. 광개시제 용액을 마세레이션 용액에 피펫으로 분주하여 부피 기준 15% 혼합물을 만들고, 바이알을 1분 동안 볼텍싱합니다.

다음으로, 염 scaffold가 들어 있는 바이알을 알루미늄 호일로 감싸고, 염이 완전히 덮일 때까지 광개시제 macer 혼합물을 추가합니다. 바이알의 캡을 닫고 티슈로 감싼 뒤 원심분리 튜브에 수직으로 세워 넣습니다. 튜브를 10분 동안 원심분리합니다.

다음으로, 호일을 제거하고 바이알 캡을 연 후, 용액을 3분 동안 자외선에 노출시킵니다. 그 후 용액을 하룻밤 동안 공기 건조하고, 핀셋을 사용하여 유리를 긁고 깨뜨려 바이알의 윗부분을 제거합니다. 스캐폴드를 1:1 물-에탄올 용액으로 옮겨 4일 동안 유지하며, 용액을 매일 교체합니다.

마지막으로 SMP 지지체를 제거하고 하룻밤 동안 공기 건조합니다. 폴리도파민 코팅을 먼저 적용하려면, 20 gauge 바늘을 SMP 지지체 중간까지 삽입한 다음 바늘 허브에 와이어를 감습니다. 교반 중인 도파민 용액 200 milliliters에 지지체를 담그고, 와이어를 비커 가장자리에 고정하여 바늘 허브가 용액 위에 위치하도록 유지합니다.

다음으로, 니들 허브에 시린지를 장착하고 플런저를 당겨 스캐폴드 내부의 공기를 제거합니다. 완전히 탈기되면 스캐폴드를 16시간 동안 용액에 담가 둡니다. 그 후 용액에서 스캐폴드를 꺼내고 니들을 제거합니다.

그 다음 스캐폴드를 탈이온수로 헹구고 진공 오븐에서 상온으로 24시간 동안 건조합니다. 스캐폴드를 85 °C의 건조 오븐에 1시간 동안 둡니다. 마지막으로, 스캐폴드를 꺼내어 상온까지 식힙니다.

먼저, 5 mm 두께의 단단한 플라스틱 시트에 평균 직경 약 6 mm의 불규칙한 빈 공간을 뚫어 결함 모델을 준비합니다. 그런 다음 SMP 스캐폴드를 약 60 °C의 탈이온수가 담긴 비커에 2분 동안 담급니다. 핀셋을 사용하여 스캐폴드의 모양을 변형시켜 스캐폴드가 눈에 띄게 연화되었는지 확인합니다.

핀셋을 사용하여 물에서 부드러워진 스캐폴드를 꺼내 결함 모델에 손으로 눌러 넣습니다. 스캐폴드가 실온으로 식을 때까지 기다린 후 결함 모델에서 분리합니다. 새롭게 고정된 임시 모양을 관찰하여 기공, 상호 연결성 및 크기를 시각화합니다.

먼저, 핀셋을 사용하여 SMP 스캐폴드를 액체 질소에 1분 동안 담급니다. 그런 다음 깨끗한 면도날을 이용해 스캐폴드의 중앙 부분을 파쇄합니다. 이어서, 파쇄된 면이 위를 향하도록 스캐폴드 절반을 샘플 스테이지 위에 고정합니다.

카본 테이프를 사용하여 스캐폴드를 금 및 백금 합금으로 약 4 nm 두께로 스퍼터 코팅합니다. 시료를 SEM에 로드한 후 10~15 kV의 가속 전압에서 이미지를 캡처합니다. 이는 인비트로(in vitro) 생체 활성을 특성화하기 위함입니다.

먼저 깨끗한 칼날을 사용하여 원형 가장질을 따라 원통형 SMP 스캐폴드를 반으로 자릅니다. 스캐폴드의 절반을 30 milliliters의 유사 체액이 담긴 튜브에 넣고, 14일 후 튜브를 37 degrees Celsius의 정지식 항온수조에 넣습니다. 튜브에서 스캐폴드를 꺼내 24시간 동안 공기 중에서 건조시킵니다.

다음으로, 절단면이 위를 향하도록 지지체를 카본 테이프를 사용하여 전자 현미경의 시료 스테이지에 고정합니다. 그런 다음 지지체 표면을 금-백금 합금으로 약 4 nm 두께가 되도록 스퍼터 코팅합니다. 이전과 마찬가지로 시료를 SEM에 로드하고 10~15 kV의 가속 전압에서 이미지를 캡처합니다.

SMP 스캐폴드는 60 °C에서 가열하면 가소성이 생겨 결함 모델 내에 맞게 조정할 수 있습니다. 실온으로 냉각한 후 SMP 스캐폴드를 제거하면 새롭게 고정된 일시적 형태를 유지합니다. 코팅되지 않은 SMP 스캐폴드의 주사 전자 현미경 사진에서 기공 구조와 고도로 상호 연결된 형태를 확인할 수 있습니다.

주사 전자 현미경 사진에서 볼 수 있듯이, 기공 내 하이드록시아파타이트의 형성을 통해 폴리도파민이 코팅된 SMP 스캐폴드의 생체 활성을 입증하였습니다. 이 영상을 시청한 후, 솔벤트 캐스팅과 염 템플릿 입자 침출 공정 및 폴리도파민 코팅 적용을 통해 생체 활성 자가 적합형 형상 기억 폴리머 스캐폴드를 제조하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.