Cryosectioning Methode voor Microdissection van Murine colonslijmvlies
12 juli 2015
Hier beschrijven we een eenvoudige methode voor het isoleren van ruimtelijk verschillende muis colonische epitheliale oppervlaktecellen van de onderliggende crypt-basiscellen.
Het algemene doel van deze procedure is om twee ruimtelijk verschillende regio's van het colon te microdissecteren: de proliferatieve K-cryptzone en de gedifferentieerde oppervlakkige epitheelcellen. Dit wordt bereikt door eerst het colon van de muis te verwijderen. De tweede stap is om het weefsel tussen twee metalen platen te bevriezen.
Vervolgens wordt het weefsel gemonteerd op een vooraf genivelleerd OCT-blok. De laatste stap is het snijden van het weefsel in een cryostaat met intervallen van 10 micron. Ten slotte worden real-time PCR of Western blot gebruikt om veranderingen in gen- en eiwitexpressie aan te tonen.
Het voordeel van onze techniek is dat deze snel en goedkoop is en een hoge opbrengst aantoont. Onze procedure is uitgevoerd door Christian Garner Schmidt, een technicus in onze groep. Alle procedures met dieren zijn beoordeeld en goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Emory University en zijn uitgevoerd volgens de criteria van de National Institutes of Health.
Nadat de cryostaat zoals gebruikelijk is ingesteld, worden de cryostaatmessen en de houders geëquilibreerd naar -20 °C. Vul vervolgens een lege cryovorm met optimal cutting temperature compound en equilibreer deze naar -20 °C. Dit zal ongeveer 30 minuten duren.
Verwijder het bevroren OCT uit de mal en bevestig het aan de houder met vloeibaar OCT. Plaats de houder in de arm van de microtoom en laat het OCT 10 minuten uitharden. Stel de cryostaat in op 10 micron per sectie en scheer het OCT-blok af tot het vlak is, terwijl u de arm van de microtoom enkele centimeters van het mes af beweegt.
Bereid vervolgens per monster twee scheermesjes voor door met een metalen vijl de scherpe rand van de mesjes te stompen. Verwijder daarna de aluminium flens met een pincet. Bereid een kweekschaal van 10 centimeter voor, voor de helft gevuld met siliconen en voorzien van 10 tot 15 dissectienaalden.
Voeg vijf milliliters kamertemperatuur hanks buffer toe aan de schaal nadat de muis is geëuthanaseerd volgens goedgekeurde methoden en een distaal colonsegment tussen nul en zes centimeter vanaf de anus is uitgesneden. Gebruik een schaar om te knippen. Open het colon in de lengte en verwijder de fecale inhoud.
Zet het weefsel vast op de siliconen dissectieschaal met Hank's buffer, waarbij het slijmvliesoppervlak naar boven is gericht. Rek het weefsel uit met behulp van de dissectiepennen. Laat het weefsel vervolgens 10 minuten rusten bij kamertemperatuur om plooien in het weefsel te verwijderen en om de spierlagen te laten ontspannen.
Nadat het weefsel heeft gerust, verwijdert u alle pinnen behalve de eindpinnen. Schuif een scheermesje onder het gewenste weefselsegment en giet vervolgens de hanks-buffer af. Plaats een ander scheermesje aan de bovenzijde om een sandwich te vormen.
Snijd het weefselsegment door en verwijder de eindpinnen. Verplaats de weefselsandwich tussen de scheermesjes naar droogijs. Laat het weefsel vijf tot 10 minuten invriezen.
Pak de sandwich van scheermesjes en weefsel op en laat deze licht opwarmen door een vinger op het bovenste mesje te plaatsen. Scheid de sandwich en snijd langs de randen van het weefselsegment. Snijd een weefselsegment van ongeveer 0,5 centimeter bij één centimeter.
Laat het weefsel opwarmen tot het ijs bovenop het weefsel begint te smelten. Druk het weefsel op dat moment snel en voorzichtig in het OCT-blok. Plaats in de cryostaat een vinger over het monster.
De warmteoverdracht stelt u in staat om het mes te verwijderen zonder het weefsel te verstoren. Bedek het weefsel met OCT en laat het vijf minuten equilibreren. Snijd vervolgens secties van 10 microns.
Plaats de coupes op een objectglas en inspecteer deze visueel totdat de crypten zichtbaar zijn. Plaats de coupes in buisjes van 1,5 milliliter of op objectglazen. Deze afbeelding toont colonweefsel gekleurd met hematoxyline en eosine in een traditionele dwarsdoorsnede, waarbij de circulaire muscularis is aangeduid als cm.
De muscularis mucosa, aangeduid als MM, de cellen van de cryptbasis, de transitiecellen en de oppervlaktecellen zijn duidelijk zichtbaar. Deze afbeelding toont de circulaire muscularis na seriële sectie. Naarmate we richting de oppervlaktecellen gaan, is de muscularis mucosa zichtbaar.
Deze afbeelding toont h- en D-gekleurde crypt-basaalcellen bij een hogere vergroting. Let op de afwezigheid van een centraal lumen. Hier zijn transitionele cellen te zien en deze afbeelding toont de oppervlaktecellen.
De volgende afbeeldingen tonen de immunofluorescente kleuring van geïsoleerde colone crypten, waarbij is gekleurd voor het cel-celverbindingseiwit. Zonula occludens-1 of ZO-1 verschijnt groen en de kernen, die blauw verschijnen, zijn in dwarsdoorsnede geobserveerd. De transitionele cellen en oppervlaktcellen worden hier getoond na seriële sectiering.
Verschillende differentiatiefactoren worden op spatiotemporele wijze tot expressie gebracht langs de as van het crypte-oppervlak. Hiertoenoe behoort de transcriptiefactor KLF4, in het groen weergegeven, die verrijkt is in oppervlaktecelpopulaties wanneer bekeken in dwarsdoorsnede; seriële doorsneden maken real-time PCR-beoordeling van KLF4-mRNA-niveaus tussen de drie compartimenten mogelijk. Tot slot demonstreert deze western blot de niveaus van het KLF4-eiwit in deze celpopulaties.
Vergeet niet dat werken met microtoommesjes extreem gevaarlijk kan zijn, wees dus extra voorzichtig wanneer u deze procedure uitvoert.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het isoleren van ruimtelijk onderscheiden muize colone epitheliale oppervlaktecellen van de onderliggende crypt-basiscellen. De techniek maakt het mogelijk om het colon op te delen in twee regio's: de proliferatieve K crypt-zone en de gedifferentieerde epitheliale oppervlaktecellen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Histologie
Achtergrond
- De isolatie van colonepitheelcellen is essentieel voor het bestuderen van gen- en eiwitexpressie.
- De procedure omvat microdissectie van specifieke regio's van het colon.
- Real-time PCR- en Western blot-technieken worden gebruikt om de monsters te analyseren.
- De dierprocedures zijn goedgekeurd door de betreffende institutionele commissie.
Doel van de studie
- Om een snelle en goedkope methode te ontwikkelen voor het isoleren van colonic epitheelcellen.
- Om een hoog rendement in het isolatieproces aan te tonen.
- Om de studie naar differentiatiefactoren in colonic cellen te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Dissectie van de muizencolon en invriezen tussen metalen platen.
- Het plaatsen van weefsel op een OCT-blok en het maken van coupes van 10 micron.
- Het isoleren van de gewenste weefselsegmenten met scheermesjes.
- Immunofluorescentiekleuring om celjunctioneiwitten te visualiseren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van cryptbasis- en oppervlakte-epitheelcellen.
- Visualisatie van differentiatiefactoren langs de crypt-oppervlakte-as.
- Real-time PCR- en Western blot-analyse bevestigden de gen- en eiwitexpressieniveaus.
- Afbeeldingen toonden duidelijke onderscheidingen tussen celtypen aan.
Conclusies
- De beschreven methode is efficiënt en levert monsters van hoge kwaliteit op.
- Het maakt een gedetailleerde analyse van de differentiatie van colonepitheelcellen mogelijk.
- Toekomstige studies kunnen deze techniek benutten voor verdere inzichten in de biologie van het colon.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Ruimtelijk opgeloste microdissectie van de coloneuze mucosa van muizen maakt de precieze isolatie van proliferatieve crypt- en gedifferentieerde oppervlakte-epitheelcelpopulaties mogelijk voor moleculaire analyse. Deze mogelijkheid ondersteunt mechanistische risicoreductie en targetvalidatie in gastro-intestinale ziektemodellen, waardoor het voorspellend vertrouwen in vroege discovery- en translationeel onderzoek wordt vergroot. De efficiëntie en opbrengst van de methode faciliteren een robuuste triage van de portfolio en risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling in biofarmaceutische R&D.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt onderzoek naar gen- en eiwitexpressie in verschillende epitheelcompartimenten mogelijk.
- Ondersteunt functionele validatie van targets door het isoleren van proliferatieve versus gedifferentieerde celpopulaties.
- Faciliteert mechanische risicoreductie door middel van ruimtelijk opgeloste moleculaire profilering.
- Verbetert het voorspellend vertrouwen bij de selectie van targets in gastro-intestinaal onderzoek.
Screening & Assayontwikkeling
- Levert gevalideerde weefselmonsters voor downstream kwantitatieve analyses zoals real-time PCR en Western blot.
- Verbetert de reproduceerbaarheid van analyses door gestandaardiseerde isolatie van gedefinieerde celpopulaties mogelijk te maken.
- Ondersteunt de ontwikkeling van robuuste screeningsplatforms voor epitheliale differentiatiemarkers.
- Maakt een betrouwbare evaluatie van compound-effecten op specifieke mucosale compartimenten mogelijk.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt moleculaire uitlezingen uit met ziekterelevante epitheliale compartimenten in preklinische modellen.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door compartimentspecifieke biomarkeranalyse mogelijk te maken.
- Faciliteert risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van ruimtelijk opgeloste moleculaire gegevens.
- Biedt mechanistisch inzicht in de epitheliale barrièrefunctie en differentiatie die relevant zijn voor gastro-intestinale aandoeningen.
Pipeline- en workflowintegratie
Deze methode voor cryosectie en microdissectie is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking tot prekliniek, waardoor compartiment-specifieke moleculaire analyse mogelijk wordt gemaakt, van vroege hypothesetoetsing tot translationele validatie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden door crypt- en oppervlaktecelpopulaties te isoleren voor moleculaire analyse.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve monsters voor assay-ontwikkeling en workflows voor compound-screening.
- Analytica: Levert hoogwaardig RNA en eiwit voor kwantitatieve read-outs, wat robuuste statistische vergelijkingen tussen compartimenten mogelijk maakt.
- Translationeel onderzoek: Stemt moleculaire bevindingen af op ziekterelateerde epitheliale structuren in preklinische modellen.
- Bedrijfsmatige herbruikbaarheid: Vestigt een herbruikbaar platform voor ruimtelijk opgeloste weefselanalyse binnen GI-onderzoeksprogramma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in studies naar epitheelbiologie.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, hoogrendement en reproduceerbare weefselisolatie voor moleculaire workflows.
- Strategische waarde: Maakt geïnformeerde go/no-go beslissingen en kapitaalefficiënt portfoliomanagement mogelijk in GI-onderzoek.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling van GI-therapeutische programma's.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in cryosectie- en microdissectietechnieken.
- Toegang tot cryostaatinstrumentatie en infrastructuur voor moleculaire analyse is noodzakelijk.
- Standaardisatie tussen teams is vereist voor reproduceerbare isolatie van compartimenten.
- Aanpassing kan nodig zijn voor andere weefseltypen of ziektemodellen.
- Voorzichtig gebruik van microtoombladen is essentieel voor de veiligheid en de integriteit van de monsters.
