쥐 대장 점막의 이외에 Microdissection을위한 냉동 절편 방법

이 절차의 전반적인 목표는 공간적으로 구별되는 결장의 두 영역, 즉 증식성 K crypt 영역과 분화된 표면 상피 세포를 미시적으로 해부하는 것입니다. 이 작업은 먼저 마우스 콜론을 제거하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 두 금속판 사이의 조직을 동결하는 것입니다.

다음으로, 조직을 미리 수평을 이룬 OCT 블록에 장착합니다. 마지막 단계는 10미크론 간격으로 저온 유지 장치에서 조직을 절단하는 것입니다. 궁극적으로 Real-Time PCR 또는 웨스턴 블롯(Western blot)을 사용하여 유전자 및 단백질 발현의 변화를 보여줍니다.

우리 기술의 장점은 빠르고 저렴하며 수율이 높다는 것입니다. 우리의 절차는 우리 그룹의 기술자인 Christian Garner Schmidt입니다. 동물을 사용한 모든 절차는 에모리 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 검토 및 승인되었으며 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 기준에 따라 수행되었습니다.

저온 유지 장치를 설치한 후 평소와 같이 저온 유지 장치 블레이드와 척을 섭씨 영하 20도로 평형을 이룹니다. 그런 다음 빈 극저온 금형에 최적의 절단 온도 화합물을 채우고 섭씨 영하 20도까지 평형을 이룹니다. 약 30분 정도 소요됩니다.

금형에서 얼어붙은 OCT를 제거하고 액체 OCT로 척에 고정합니다. 척을 마이크로톰 암에 놓고 OCT가 10분 동안 설정되도록 합니다. 저온 유지 장치를 섹션당 10미크론으로 설정하고 마이크로톰 암이 블레이드에서 몇 cm 떨어져 평평해질 때까지 OCT 블록을 면도합니다.

다음으로, 금속 줄을 사용하여 샘플 당 두 개의 면도날을 준비하고 면도날의 날카로운 모서리를 무디게합니다. 그런 다음 집게로 알루미늄 플랜지를 제거합니다. 10cm 크기의 조직 배양 접시를 준비하고, 50%를 실리콘으로 채우고, 10-15개의 해부 핀을 놓습니다.

승인된 방법에 따라 마우스를 안락사시키고 항문에서 0cm에서 6cm 사이의 원위 결장 분절을 절제한 후 5ml의 실온, 행크 완충제를 접시에 추가합니다. 가위를 사용하여 자릅니다. 결장을 세로로 열고 대변 내용물을 제거합니다.

점막 표면이 위를 향하도록 Hank's buffer가 들어 있는 실리콘 해부 접시에 조직을 고정합니다. 해부 핀을 사용하여 조직을 늘립니다. 그런 다음 실온에서 10분 동안 그대로 두어 조직에서 주름을 제거하고 근육층이 이완될 수 있도록 합니다.

조직이 휴식을 취한 후 작용하여 엔드 핀을 제외한 모든 것을 제거합니다. 면도날을 원하는 조직 부분 아래로 밀어 넣은 다음 행크 버퍼를 붓습니다. 상단에 다른 면도날을 추가하여 샌드위치를 만듭니다.

조직 세그먼트를 자르고 엔드 핀을 제거합니다. 면도날 티슈 샌드위치를 드라이아이스로 옮깁니다. 조직을 5분에서 10분 동안 얼립니다.

면도기 티슈 샌드위치를 집어 상단 칼날에 손가락을 올려 약간 데우십시오. 샌드위치를 분리하고 조직 세그먼트의 가장자리 주위를 자릅니다. 조직 세그먼트를 약 0.5cm x 1cm 절단합니다.

조직 위에 있는 얼음이 녹기 시작할 때까지 조직을 따뜻하게 합니다. 이 시점에서 조직을 빠르고 조심스럽게 OCT 블록에 밀어 넣습니다. 저온 유지 장치에서 샘플 위에 손가락을 놓습니다.

열 전달을 통해 조직을 방해하지 않고 블레이드를 제거할 수 있습니다. 조직에 OCT를 코팅하고 5분 동안 평형을 이룹니다. 그런 다음 10미크론으로 단면을 자릅니다.

섹션을 슬라이드에 놓고 지하실이 보일 때까지 섹션을 육안으로 검사합니다. 1.5 밀리리터 튜브 또는 슬라이드에 섹션을 놓습니다. 이 이미지는 cm로 표시된 원형 근육과 함께 전통적인 단면에서 hematin eoin으로 염색된 결장 조직을 보여줍니다.

MM으로 표시된 muscularis 점막, crypt base cell, transitional cells 및 surface cell이 명확하게 보입니다. 이 이미지는 연속 절편 후의 원형 근육을 보여줍니다. 표면 세포를 향해 진행하면서 근육 점막이 보입니다.

이 이미지는 더 높은 배율에서 h 및 D 염색된 crypt base cells를 보여줍니다. 중앙 루멘이 없다는 점에 유의하십시오. 여기에서 전이 세포가 보이며 이 이미지는 표면 세포를 보여줍니다.

다음 이미지는 세포 대 세포 접합 단백질에 대한 분리된 결장 소낭선의 면역형광 염색을 보여줍니다. Soula occludin one 또는 ZO one은 녹색으로 나타나고 파란색으로 보이는 핵은 단면에서 관찰됩니다. 전이 셀과 표면 셀은 연속 절편 후 여기에 표시됩니다.

여러 분화 요인이 cryp 표면 축을 따라 시공간 방식으로 표현됩니다. 여기에는 녹색으로 표시된 인자 4와 같은 전사 인자 cripple이 포함되며, 단면 연속 절편화에서 볼 때 표면 세포 집단이 풍부하여 3개의 구획 사이의 KLF 4개의 mRNA 수준에 대한 실시간 PCR 평가가 가능합니다. 마지막으로, 이 웨스턴 블롯은 이러한 세포 집단에서 KLA 4 단백질의 수준을 보여줍니다.

마이크로톤 블레이드로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행할 때마다 각별히 주의하십시오.