신선한 냉동 인간 조직에서 장의 중추의 격리에 대 한 레이저 캡처 서의 최적화

이 방법은 성인 인간의 장에서 장 신경절의 발현 프로필과 같은 장 신경계에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 RNA 품질을 최대한 유지하면서 인간 장 신경절에서 높은 수율의 RNA를 얻는 데 사용할 수 있다는 것입니다. 장 조직을 20cm 길이로 자른 것부터 시작한다.

먼저 지방 조직과 결합 조직을 잘라냅니다. myenteric plexus에 구조적 손상을 줄 수 있는 혈청사에 흠집을 내지 마십시오. 다음으로, 트리밍된 샘플의 전체 길이를 따라, 바람직하게는 장간막 부착 부위를 세로로 절개합니다.

그런 다음 결장에서 대장균을 절개하여 버리면 조직이 평평해질 수 있습니다. 이제 점막이 아래로 향하게 하여 장을 식힌 도마 위에 펴십시오. 그런 다음 조직의 전체 길이를 따라 1.25cm 너비의 스트립을 자릅니다.

절단할 때 임시 보관을 위해 각 조각을 냉장 티슈 보관 솔루션으로 옮깁니다. 그런 다음 각 스트립을 2-1.5cm 길이의 세그먼트로 자릅니다. 스트립을 세그먼트로 자른 후 세그먼트를 닦아내십시오.

조직이 얼었을 때 조직에 얼음 결정이 형성되지 않도록 조직이 매우 건조해야 합니다. 이제 건조된 조직 조각을 점막이 위로 향하게 하여 차가운 일회용 플라스틱 틀에 놓습니다. 그런 다음 구부러진 집게를 사용하여 각 조각을 평평하게 하여 갇힌 기포를 제거합니다.

조직은 평평해짐에 따라 확장됩니다. 조직 세그먼트를 평평하게 한 후 얼기 전에 두께를 평가합니다. 필요한 경우 장 샘플이 원래 두께에 도달할 때까지 샘플의 가장자리를 안쪽으로 밉니다.

이제 적재된 기본 금형을 드라이 아이스와 2-메틸부탄 슬러리로 옮깁니다. 조직은 30-60초 이내에 완전히 얼어야 합니다. 그런 다음 드라이 아이스에 보관된 차가운 물티슈를 사용하여 금형 바닥을 즉시 말리십시오.

이제 샘플을 확인하십시오. 평평하게 보이지 않는 샘플을 기록해 두십시오. 다음으로, 사용하기 전에 미리 라벨이 부착되고 냉각된 알루미늄 호일로 금형을 감쌉니다.

그런 다음 탈수를 최소화하기 위해 호일을 플라스틱 랩으로 덮습니다. 섭씨 영하 80도에서 보관할 수 있을 때까지 샘플을 얼음 위에 보관하십시오. 필요한 재료를 준비한 후 3-5mm 마운드의 TFM을 대형 저온 유지 장치 검체 홀더에 붓고 장 검체를 혈청 면이 위로 향하게 하여 TFM에 즉시 옮깁니다.

실온에서 몇 초 후 시편 홀더를 드라이 아이스로 옮기고 분말 드라이 아이스로 덮습니다. 자르기 전에 TFM이 myenteric plexus의 평면 아래에 있는지 확인하십시오. 다음으로, 표본 홀더를 저온 유지 장치 표본 헤드에 장착하고 표본을 저온 유지 장치 블레이드에 맞춥니다.

myenteric plexus의 평면을 절단 날과 평행하게 만듭니다. 이제 myenteric plexus에 도달할 때까지 혈청과 종방향 근육을 통해 8미크론 절편을 만듭니다. myenteric plexus를 찾으려면 샘플을 장착하고 1% crystal violet과 같은 수성 염료로 염색합니다.

계속 진행하려면 종근층과 원형 근육층 사이의 접합부를 식별합니다. 절편이 시작되면 장막은 결합 조직의 존재로 표시됩니다. 일부 남아 있는 장간막 지방도 혈청을 따라 존재할 수 있습니다.

그런 다음, 바깥쪽 종방향 근육층의 시트가 보이게 됩니다 종근층과 원형 근육층 사이의 경계에 도달하면 장 신경절의 일부가 관찰됩니다. 다음 몇 가지 섹션에서는 myenteric plexus가 단일 섹션 내에 존재하는 큰 신경절과 함께 매우 분명해질 것입니다. 이제 레이저 캡처 현미해부를 위한 연속 절편을 수집합니다.

Chill PEN은 저온 유지 장치에서 5-10초 동안 미끄러져 들어가 섹션을 장착하는 데 사용합니다. 가장 좋은 부분에는 많은 뉴런과 신경교세포가 있습니다. 이제 염색을 진행한 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 섹션을 탈수합니다.

준비 과정에서 LCM 캡 카트리지를 LCM 현미경 스테이지에 삽입합니다. 그런 다음 샘플 슬라이드를 스테이지에 로드하고 슬라이드의 개요 이미지를 가져옵니다. LCM의 원하는 위치를 식별하고 슬라이드에 캡을 로드합니다.

그런 다음 적외선 레이저를 정렬하고 20-30미크론 직경의 캡처 지점에 대한 레이저의 출력과 지속 시간을 조정합니다. 다음으로, 수집하고자 하는 신경절의 윤곽을 그립니다. 녹색 원으로 표시된 캡의 수집 가능 영역 경계 내에 있어야 합니다.

UV 절단 트레이스로 요약된 각 신경절에 대해 100-500미크론마다 하나 이상의 IR 스폿이 있도록 IR 스폿을 조정하여 샘플에서 캡을 들어 올릴 때 신경절이 모두 수집되도록 합니다. 그런 다음 IR UV Cut 버튼을 눌러 표시된 모든 신경절의 채취를 진행합니다. 수거가 완료되면 캡을 새 위치로 이동하고 수거 프로세스를 반복합니다.

이것은 60-80 분 동안 반복 할 수 있습니다. LCM 캡에 충분한 신경절이 로드되면 품질 관리 스테이션으로 옮깁니다. 캡에 이물질이 있으면 RNA 사용을 위해 준비된 끝이 가는 페인트 브러시를 사용하여 닦아내십시오.

제거하기 어려운 이물질은 피펫 팁을 사용하십시오. 그런 다음 230마이크로리터의 RNA 용해 완충액으로 채워진 0.5ml 마이크로분리 튜브에 캡을 고정합니다. 캡을 뒤집고 잠시 와류로 만든 다음 실온에서 30분 동안 샘플을 배양합니다.

나중에, 5, 000 g 또는 더 빠른 속도로 5 분 동안 샘플을 원심 분리한 다음 마이크로분리 튜브를 드라이 아이스로 옮깁니다. 이제 샘플이 RNA 추출을 위한 준비가 되었습니다. 샘플당 장신경절 캡 2개를 뽑았을 때, RNA-Seq에 충분한 1나노그램 이상의 RNA가 얻어졌으며 RNA의 품질이 우수했습니다.

표시된 샘플의 RNA 무결성은 8.3입니다. 무결성 수치가 7.5 및 6.9인 샘플도 수집되었습니다. 전체적으로 준비된 모든 샘플의 95% 이상이 RNA-Seq에 충분했습니다.

RNA-Seq 데이터 세트의 품질은 생물정보학 파이프라인을 사용하여 평가되었습니다. end bias는 샘플의 염기서열 분석이 성공적으로 이루어졌으며 3개의 프라임 end bias만 가졌음을 나타냅니다. 유전자 생물형 플롯은 염기서열분석 결과가 대체로 일관되었음을 보여줍니다.

일단 숙달되면, 이 기술은 8시간에서 12시간 이내에 RNA-Seq에 충분한 질과 양의 장신경절에서 RNA의 생물학적 복제를 수집하는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 인간 장 샘플을 가능한 한 평평하게 동결하는 것이 중요합니다. 이렇게 하면 레이저 캡처 현저절부로 빠르고 쉽게 처리할 수 있는 인간 장신경절의 매우 큰 단면을 수집할 수 있습니다.