Name: 신선한 냉동 인간 조직에서 장의 중추의 격리에 대 한 레이저 캡처 서의 최적화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 배우세요 레이저 캡처 현미분리를 사용하여 신선한 인간 장 조직에서 장신경절을 격리하고 고품질 RNA를 추출하는 방법을. 이 기술은 장신경계의 유전자 발현 프로필을 연구하여 소화관 신경 기능을 이해하는 데 도움이 됩니다.

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우리는 기증자와이 일을 가능 하 게 그들의 가족에 감사입니다. 우리는 또한 국제 의학 연구소 및 테네시 기증자 서비스 조직의이 연구에 사용 된 좌표 컬렉션을 돕는 직원의 도움을 주셔서 감사 합니다. 이 작품은 건강의 국가 학회, NIH OT2-OD023850 EMS2 와 봉급 지원 NIH에서 T32 일부-DK007673 AMZ 하에서 교부 금에 의해 지원 되었다. 우리는 밴 더 빌 트 변환 병리학 공유 리소스의 직원 조직 준비에 조언과 LCM 악기에 대 한 액세스 감사입니다. 밴 더 빌 트 조직 병리학 공유 리소스 NIH P30-CA068485-14 보조금과 U24-DK059637-13에 의해 부분에서 지원 됩니다. 우리는 게놈 분석에 대 한 게놈 기술 접근 센터 워싱톤 대학의과 대학에 유전학의 부에 감사합니다. GTAC는 부분적으로 지원 됩니다 Siteman 암 센터 NCI 암 센터 지원 그랜트 #P30 CA91842와 국립 센터에서 ICTS/CTSA 그랜트 #UL1TR002345 연구 자원 (NCRR), 국립 보건원 (NIH), 그리고 NIH의 구성 요소에 대 한 의료 연구에 대 한 로드맵입니다. 이 간행물은 전적으로 저자의 책임 고 반드시 NCRR 또는 NIH의 공식 보기를 대표 하지 않는다.

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저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

이 절차 RNA-이 대 한 RNA를 파생 하는 원본으로 수많은 장 중추의 효율적인 수집 가능 여기, 우리가 극대로 RNA 무결성을 유지 하면서 기존 프로토콜에서 설명 하는 프로세스를 가속 있다. 이 절차의 모든 단계는 상호 의존, 그것은 중요 한 연구의 개시에서 모든 문제를 제거 하 고는 모든 샘플 준비가 되어로 유사 하 게 다른 가능한 신뢰할 수 있는 RNA-이를
절차의 개시에서 RNA 무결성 수 있습니다 부정적인 영향을 받을 경우 실험실에서 처리를 위해 장기 기증 시 조직의 컬렉션 및 조직의 영수증 사이 시간 간격 (찬 허 혈 성 시간) 너무 깁니다. 이 문제를 감안할 때, 우리는 높은-품질 RNA 여전히에서 추출 수 있습니다 장 샘플 24 시간 냉 허 혈 성 후에 놀 랐 다. 장 샘플은 냉장 냉장 솔루션에 제대로 저장 때 조직의 무결성 및 RNA 품질의 최상의 보호가 이다. 장 조직 기관 컬렉션 팀 내장의 소화 효소, RNases 및이 기간 동안 RNA 품질에 영향을 줄 수...

이 메서드는 레이저 캡처 기정 (LCM)를 사용 하 여 인간의 창 자 조직에서 장의 중추의 높은-품질 RNA 샘플을 얻기 위해 설계 되었습니다. 여기에 설명 된 프로토콜 RNA 시퀀싱 (RNA-seq)에 대 한 충분 한 RNA 품질 및 수율을 제공 하도록 최적화 된 하며 갓 절제, 고정, 플래시-냉동 인간 창 자 조직으로 사용 될 것입니다.
기능성 위장 하 고 본질적인 운동 성 장애는 미국에서 4 명 중 하나에 영향을 줍니다. 장 신 경계 (ENS), 두 번째 뇌1라고도 종종 이러한 장애의 중심에 직감 항상성 및 운동에 중요 한 역할. 창 자 운동 성의 조작 일반적으로 aganglionic/noncontractile 조직, 만성 식이 수정 및/또는 약물의 외과 절제술으로 제한 되었습니다. 놀랍게도, 성인 팔의 전체 transcriptome 시퀀싱 할 약물 타겟 줄기 세포 치료에 활용 될 수 있는 ENS 내의 분자를 식별 하는 우리의 기능을 크게 제한 남아 있습니다.
인간의 장 중추에서 RNA를 분리 하는 데 상대적으로 몇 가지 방법이 있다. 첫 번째 접근 방법, 셀 분리2, 필요 높은 부 화 온도 및 긴 보육 시간; 모두는 RNA 저하를 촉진 하 고 변경 transcriptome2,3으로 알려져 있습니다. 다른 접근 방법, LCM, 더 안정적으로 transcriptome를 유지 하 고 RNA 무결성 보호. 이러한 방법 중 가난한 RNA 품질 및 수량에 의해 방해 했다, 아주 노동 집약, 여러 연구는 사용 하지만 LCM 신선한-냉동 인간 창 자 조직4,,56에서 중추를 수집, 또는 얼룩 또는 RNA 추출 기술을 우리의 손에서 일의 필요한 수정. LCM 제품 설명서 제공 장의 중추8, 의 분리에 적용 될 때 추가 개선7,8, 하지만 적응 필요에서 발견 된 다른 LCM 프로토콜 RNA를 보존 하기 위한 9. 이러한 이유로 우리는 최적화 된 프로토콜을 기반으로 이러한 리소스에는 인간의 장 중추에서 상당한 양의 높은 무결성 RNA 생성, 상대적으로 빠른 워크플로우, 그리고 대형에 걸쳐 일관 된 결과 생성을 개발 샘플의 수입니다.
이 연구에서 우리는 절제 인간의 창 자 조직에서 공급 하는 장 신경에서 높은 무결성 RNA의 분리를 용이 하 게 하는 최적화 된 절차의 개요를 제시. 우리의 방법 5 가지 중요 한 측면을 통합합니다. 첫째, 갓 절제, 고정 되지 않은 인간의 장 샘플 크기, 모든 과잉 습기 실험실 티슈로 제거 하 고 2-methylbutane (2 MB)과 드라이 아이스의 슬러리 꼭대기 플래시-냉동 하기 전에 큰 기본 몰드에 평평 하 게 손질 한다. 내장의 두 번째, 더 섹션 장의 중추의 큰 페이로드를 제공 하는 슬라이드에 myenteric 총의 전체 평면을 얻기 위해 준비 되어야 한다. 성공이 단계는 조직 준비 과정에 크게 의존 합니다. 셋째, 중추는 존재에의 비균일 구조 폴 리 에틸렌 napthalate (펜) 막 슬라이드6, LCM 과정에서 최고의 속도 정밀도 제공 하는 사용을 해야 합니다. Cresyl 바이올렛 등 4, 에탄올 호환 염료 장의 중추 얼룩 동안 RNA 무결성을 유지 하기 위해 사용 되어야 한다. 마지막으로, RNA 추출 과정은 RNA-시퀀스와 성공적인 결과 위해 중요 한 우리는 높은 RNA 무결성, 장 신경의 작은 컬렉션을 시작할 때 RNA 수율을 극대화, DNA 오염 제거 하 고 가능한 많은 RNA 종 유지 RNA 추출 방법을 모색.
함께 찍은, 현재 연구에서 이러한 요소의 최적화 크게 가속 워크플로 및 장의 중추 뛰어난 RNA 수량 및 품질의 샘플을 생성. 결과이 접근의 일관성을 나타내는 샘플의 상당한 그룹 간에 크게 일관 되었습니다. 또한, 이러한 접근 수십 장의 중추에서 RNA 샘플을 성공적으로 시퀀싱을 사용 했습니다. 여기에서 강조 하는 전략 수행 원하는 중추의 LCM 또는 주변 장치 및 중앙 신 경계와 높은-품질 RNA의 절연이 필요한 다른 경우의 핵에 대 한 광범위 하 게 적응 수 있습니다 또한.

<table><tbody><tr><td>10% 중립 완충 포르말린</td><td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>2-Methylbutane</td><td>Fisher</td><td>O3551-4</td><td></td></tr><tr><td>3-mL 주사기</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>50-mL 원뿔형 튜브, 폴리프로필렌&nbsp;</td><td>Corning</td><td>05-526B</td><td></td></tr><tr><td>베이스 몰드 37x24x5mm, 일회용</td><td>전자 현미경 과학</td><td>5025511</td><td></td></tr><tr><td>Belzer UW&nbsp; 냉장 보관 솔루션</td><td>Bridge to Life</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>CapSure 매크로 LCM 캡</td><td>Arcturus, ThermoFisher</td><td>LCM0211</td><td></td></tr><tr><td>클링 랩, 프레스 N 씰&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; 다행스럽다&nbsp; &nbsp;</td><td>N.A.&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cresyl Violet Acetate</td><td>Acros Organics</td><td>AC405760025</td><td></td></tr><tr><td>Cutting Board</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63308</td><td></td></tr><tr><td>에탄올, 190-proof</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000190</td><td></td></tr><tr><td>에탄올, 200-proof</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>유리 현미경 슬라이드</td><td>Fisher</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>장갑, 확장 커프</td><td>Microflex&nbsp;</td><td></td><td></td>19010144</tr><tr><td>가운, 수술용</td><td>일회용 킴벌리-클라크&nbsp;</td><td>19-088-2116</td><td></td></tr><tr><td>트레이, 20 L (대형 폴리프로필렌 살균 팬)</td><td>Nalgene&nbsp; &nbsp;</td><td>1335920B</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes (대)</td><td>킴벌리-클락&nbsp;</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes (small)</td><td>킴벌리-클락&nbsp;</td><td>34133</td><td></td></tr><tr><td>레이저 캡처 미세해부 시스템(ArcturusXT)</td><td>ThermoFisher</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Leica Cryostat 척, 대형,&nbsp; 40 mm&nbsp;</td><td>남동부 병리학 기기 서비스</td><td>N.A.&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>광학 현미경</td><td>Olympus</td><td>CX43</td><td></td></tr><tr><td>현미경 대물렌즈(20X)</td><td>Olympus UPlanFl 20X/0.50, &infin;/0.17</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>현미경 대물렌즈 (10X)</td><td>Olympus UPlanFl 10X/0.25, &infin;/-</td><td>N.A.&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Molecular Sieves</td><td>Acros Organics</td><td>AC197255000</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>PicoPure RNA 추출 키트</td><td>Applied Biosystems</td><td>12204-01</td><td></td></tr><tr><td>펠렛 유봉</td><td>Kimble Kontes</td><td>4621973</td><td></td></tr><tr><td>PEN 멤브레인 LCM 슬라이드</td><td>Arcturus, ThermoFisher</td><td>LCM022</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free 튜브, 1.5 mL</td><td>Ambion</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZAP&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Sigma-R2020</td><td></td></tr><tr><td>RNA 추출 키트 "A" (PicoPure)</td><td>Applied Biosystems</td><td>12204-01</td><td></td></tr><tr><td>RNA 추출 키트 "B" (RNeasy&nbsp; 마이크로 키트)</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>RNA 추출 방법 "C"(TRIzol)</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>RNA 추출 키트 "D"(RNeasy PLUS Mini 키트)</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>스플래시 쉴드, 일회용 안면 보호대</td><td>Fisher</td><td>17-310</td><td></td></tr><tr><td>가위, 외과용, 14.5cm "날카롭게"</td><td>정밀 과학 도구</td><td>14002-14</td><td></td></tr><tr><td>주사기 필터, 셀룰로오스 아세테이트(0.2 & m)</td><td>Nalgene&nbsp; &nbsp;</td><td>190-2520</td><td></td></tr><tr><td>조직 냉동 매체</td><td>일반 데이터 의료</td><td>TFM-5</td><td></td></tr><tr><td>자일렌</td><td>피셔</td><td>X3P1GAL</td><td></td></tr></tbody></table>

신선한 냉동 인간 조직에서 장의 중추의 격리에 대 한 레이저 캡처 서의 최적화

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

이 방법의 목적은 고정, 갓 절제 인간의 창 자 조직 레이저 캡처 기정 (LCM)를 사용 하 여에서 수집 하는 장 신경에서 높은 무결성 RNA 샘플을 얻을 것입니다. 5 단계 워크플로에서 RNA-이 대 한 충분히 높은 품질과 수량 장의 중추에서 RNA 분리를 얻기위한 중요 한를 확인 했습니다. 첫째, 준비할 때 장 조직, 각 샘플 아래쪽 큰 기본 금형의 가능한 serosa 병합 전에 blotting에 의해 제거 하는 모든 초과 액체를가지고 있어야 합니다. 다음 샘플 2 methylbutane 드라이 아이스의 슬러리 꼭대기 신속 하 게 고정 됩니다. 둘째, 조직 단면, 그것 장 섹션 슬라이드 당 장 신경의 가장 큰 표면 영역을 양보 함으로써 myenteric 총의 전체 평면 병렬 cryomolds 위치에 중요 하다. LCM, 폴 리 에틸렌 napthalate (펜) 중 세 번째-최고의 속도 장의 중추를 수집 하는 때 장 중추의 비균일 도형의 윤곽에 유연성을 제공 하는 막 슬라이드. 넷째, 섹션 내 장 신경의 고유한 시각화를 위한 Cresyl 바이올렛 같은 에탄올 호환 염료 수성 염료를 기준으로 RNA 무결성의 우수한 보존을 제공합니다. 마지막으로, 캡처된 중추에서 RNA 추출, 우리는 DNA 오염을 제거 하는 동안 우수한 RNA 수량 나왔고 상업적인 RNA 추출 키트와 품질, 차이점 관찰. 현재 프로토콜에서 이러한 요소의 최적화 크게 워크플로우를 가속화 하 고 뛰어난 RNA 품질 및 수량 장의 중추 샘플을 생성 합니다.

기존 프로토콜 RNA-이 대 한 기준을 충족 하는 LCM을 사용 하 여 인간의 장 샘플에서 장의 중추의 상대적으로 빠른 컬렉션을 사용할 수 있는 여러 가지 개선을 하였습니다. 첫째, 우리는 2-mb (그림 1B) 드라이 아이스의 슬러리의 표면에 배치 하는 큰 기본 금형에서 장 조직 세그먼트의 급속 동결 최적화. Cryosectioning 및 후속 LCM 동안 최고의 성공 (1B-1 C 수치)를 점 막 쪽에 직면, 기본 금형 내 평면 장 세그먼트 누워 하 여 얻은 했다. 로 어떤 곡률을 myenteric 총의 큰 단면도를 훨씬 더 어렵게 만들 것입니다 기본 금형 기지, 가능한 평면 인지 확인 합니다. 이 이렇게 쉽게 8 µ m 두께 (그림 1E) 구분 및 착 색 과정에서 TFM...

이 프로토콜의 목표에서 고정, 갓 절제 인간의 창 자 조직 레이저 캡처 기정 (LCM)를 사용 하 여 격리 장 중추에서 높은 무결성 RNA 샘플을 얻을 것입니다. 이 프로토콜 포함 플래시-냉동 인간 창 자 조직, cryosectioning, ethanolic 얼룩 및 탈수, LCM, 샘플 준비 및 RNA 추출.

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

이 방법은 성인 인간의 장에서 장 신경절의 발현 프로필과 같은 장 신경계에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 RNA 품질을 최대한 유지하면서 인간 장 신경절에서 높은 수율의 RNA를 얻는 데 사용할 수 있다는 것입니다. 장 조직을 20cm 길이로 자른 것부터 시작한다.먼저 지방 조직과 결합 조직을 잘라냅니다. myenteric plexus에 구조적 손상을 줄 수 있는 혈청사에 흠집을 내지 마십시오. 다음으로, 트리밍된 샘플의 전체 길이를 따라, 바람직하게는 장간막 부착 부위를 세로로 절개합니다.그런 다음 결장에서 대장균을 절개하여 버리면 조직이 평평해질 수 있습니다. 이제 점막이 아래로 향하게 하여 장을 식힌 도마 위에 펴십시오. 그런 다음 조직의 전체 길이를 따라 1.25cm 너비의 스트립을 자릅니다.절단할 때 임시 보관을 위해 각 조각을 냉장 티슈 보관 솔루션으로 옮깁니다. 그런 다음 각 스트립을 2-1.5cm 길이의 세그먼트로 자릅니다. 스트립을 세그먼트로 자른 후 세그먼트를 닦아내십시오.조직이 얼었을 때 조직에 얼음 결정이 형성되지 않도록 조직이 매우 건조해야 합니다. 이제 건조된 조직 조각을 점막이 위로 향하게 하여 차가운 일회용 플라스틱 틀에 놓습니다. 그런 다음 구부러진 집게를 사용하여 각 조각을 평평하게 하여 갇힌 기포를 제거합니다.조직은 평평해짐에 따라 확장됩니다. 조직 세그먼트를 평평하게 한 후 얼기 전에 두께를 평가합니다. 필요한 경우 장 샘플이 원래 두께에 도달할 때까지 샘플의 가장자리를 안쪽으로 밉니다.이제 적재된 기본 금형을 드라이 아이스와 2-메틸부탄 슬러리로 옮깁니다. 조직은 30-60초 이내에 완전히 얼어야 합니다. 그런 다음 드라이 아이스에 보관된 차가운 물티슈를 사용하여 금형 바닥을 즉시 말리십시오.이제 샘플을 확인하십시오. 평평하게 보이지 않는 샘플을 기록해 두십시오. 다음으로, 사용하기 전에 미리 라벨이 부착되고 냉각된 알루미늄 호일로 금형을 감쌉니다.그런 다음 탈수를 최소화하기 위해 호일을 플라스틱 랩으로 덮습니다. 섭씨 영하 80도에서 보관할 수 있을 때까지 샘플을 얼음 위에 보관하십시오. 필요한 재료를 준비한 후 3-5mm 마운드의 TFM을 대형 저온 유지 장치 검체 홀더에 붓고 장 검체를 혈청 면이 위로 향하게 하여 TFM에 즉시 옮깁니다.실온에서 몇 초 후 시편 홀더를 드라이 아이스로 옮기고 분말 드라이 아이스로 덮습니다. 자르기 전에 TFM이 myenteric plexus의 평면 아래에 있는지 확인하십시오. 다음으로, 표본 홀더를 저온 유지 장치 표본 헤드에 장착하고 표본을 저온 유지 장치 블레이드에 맞춥니다.myenteric plexus의 평면을 절단 날과 평행하게 만듭니다. 이제 myenteric plexus에 도달할 때까지 혈청과 종방향 근육을 통해 8미크론 절편을 만듭니다. myenteric plexus를 찾으려면 샘플을 장착하고 1% crystal violet과 같은 수성 염료로 염색합니다.계속 진행하려면 종근층과 원형 근육층 사이의 접합부를 식별합니다. 절편이 시작되면 장막은 결합 조직의 존재로 표시됩니다. 일부 남아 있는 장간막 지방도 혈청을 따라 존재할 수 있습니다.그런 다음, 바깥쪽 종방향 근육층의 시트가 보이게 됩니다 종근층과 원형 근육층 사이의 경계에 도달하면 장 신경절의 일부가 관찰됩니다. 다음 몇 가지 섹션에서는 myenteric plexus가 단일 섹션 내에 존재하는 큰 신경절과 함께 매우 분명해질 것입니다. 이제 레이저 캡처 현미해부를 위한 연속 절편을 수집합니다.Chill PEN은 저온 유지 장치에서 5-10초 동안 미끄러져 들어가 섹션을 장착하는 데 사용합니다. 가장 좋은 부분에는 많은 뉴런과 신경교세포가 있습니다. 이제 염색을 진행한 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 섹션을 탈수합니다.준비 과정에서 LCM 캡 카트리지를 LCM 현미경 스테이지에 삽입합니다. 그런 다음 샘플 슬라이드를 스테이지에 로드하고 슬라이드의 개요 이미지를 가져옵니다. LCM의 원하는 위치를 식별하고 슬라이드에 캡을 로드합니다.그런 다음 적외선 레이저를 정렬하고 20-30미크론 직경의 캡처 지점에 대한 레이저의 출력과 지속 시간을 조정합니다. 다음으로, 수집하고자 하는 신경절의 윤곽을 그립니다. 녹색 원으로 표시된 캡의 수집 가능 영역 경계 내에 있어야 합니다.UV 절단 트레이스로 요약된 각 신경절에 대해 100-500미크론마다 하나 이상의 IR 스폿이 있도록 IR 스폿을 조정하여 샘플에서 캡을 들어 올릴 때 신경절이 모두 수집되도록 합니다. 그런 다음 IR UV Cut 버튼을 눌러 표시된 모든 신경절의 채취를 진행합니다. 수거가 완료되면 캡을 새 위치로 이동하고 수거 프로세스를 반복합니다.이것은 60-80 분 동안 반복 할 수 있습니다. LCM 캡에 충분한 신경절이 로드되면 품질 관리 스테이션으로 옮깁니다. 캡에 이물질이 있으면 RNA 사용을 위해 준비된 끝이 가는 페인트 브러시를 사용하여 닦아내십시오.제거하기 어려운 이물질은 피펫 팁을 사용하십시오. 그런 다음 230마이크로리터의 RNA 용해 완충액으로 채워진 0.5ml 마이크로분리 튜브에 캡을 고정합니다. 캡을 뒤집고 잠시 와류로 만든 다음 실온에서 30분 동안 샘플을 배양합니다.나중에, 5, 000 g 또는 더 빠른 속도로 5 분 동안 샘플을 원심 분리한 다음 마이크로분리 튜브를 드라이 아이스로 옮깁니다. 이제 샘플이 RNA 추출을 위한 준비가 되었습니다. 샘플당 장신경절 캡 2개를 뽑았을 때, RNA-Seq에 충분한 1나노그램 이상의 RNA가 얻어졌으며 RNA의 품질이 우수했습니다.표시된 샘플의 RNA 무결성은 8.3입니다. 무결성 수치가 7.5 및 6.9인 샘플도 수집되었습니다. 전체적으로 준비된 모든 샘플의 95% 이상이 RNA-Seq에 충분했습니다.RNA-Seq 데이터 세트의 품질은 생물정보학 파이프라인을 사용하여 평가되었습니다. end bias는 샘플의 염기서열 분석이 성공적으로 이루어졌으며 3개의 프라임 end bias만 가졌음을 나타냅니다. 유전자 생물형 플롯은 염기서열분석 결과가 대체로 일관되었음을 보여줍니다.일단 숙달되면, 이 기술은 8시간에서 12시간 이내에 RNA-Seq에 충분한 질과 양의 장신경절에서 RNA의 생물학적 복제를 수집하는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 인간 장 샘플을 가능한 한 평평하게 동결하는 것이 중요합니다. 이렇게 하면 레이저 캡처 현저절부로 빠르고 쉽게 처리할 수 있는 인간 장신경절의 매우 큰 단면을 수집할 수 있습니다.

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