Cryosectioning שיטה לMicrodissection של Murine גס רירית
July 12th, 2015
כאן אנו מתארים שיטה פשוטה לבידוד של תאי פני השטח של המעי הגס של עכברים מובחנים מרחבית מתאי בסיס הקריפטה הבסיסיים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לנתח מיקרו שני אזורים נפרדים מרחבית של המעי הגס, אזור הקריפטה K המתפשט ותאי האפיתל של פני השטח המובחנים. זה מושג על ידי הסרת המעי הגס של העכבר. השלב השני הוא הקפאת הרקמה בין שתי לוחות מתכת.
לאחר מכן, הרקמה מותקנת על בלוק OCT מפולס מראש. השלב האחרון הוא לחתוך את הרקמה על קריוסטט במרווחים של 10 מיקרון. בסופו של דבר, נעשה שימוש ב-PCR בזמן אמת או כתם מערבי כדי להראות שינויים בביטוי הגנים והחלבונים.
היתרון של הטכניקה שלנו הוא שהיא מהירה, זולה ובעלת תפוקה גבוהה. הנוהל שלנו הוא כריסטיאן גארנר שמידט, טכנאי בקבוצה שלנו. כל ההליכים המשתמשים בבעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת אמורי, ובוצעו על פי הקריטריונים של המכונים הלאומיים לבריאות.
לאחר הגדרת הקריוסטט, כרגיל, יש לאזן את להבי הקריוסטט והצ'אקים למינוס 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן מלאו תבנית קריו ריקה בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית ואזנו למינוס 20 מעלות צלזיוס. זה ייקח בערך 30 דקות.
הוציאו את ה-OCT הקפוא מהתבנית וקבעו אותו לצ'אק עם OCT נוזלי. הניחו את הצ'אק בזרוע המיקרוטום והניחו ל-OCT להתייצב למשך 10 דקות. הגדר את הקריוסטט ל-10 מיקרון לכל קטע וגלח את בלוק ה-OCT עד שהוא שטוח לאחור את זרוע המיקרוטום הרחק מהלהב בכמה סנטימטרים.
לאחר מכן, הכינו שני סכיני גילוח לכל דגימה באמצעות קובץ מתכת, הקהו את הקצה החד של הלהבים. ואז הסר את אוגן האלומיניום בעזרת מלקחיים. הכינו צלחת תרבית רקמה בגודל 10 סנטימטרים, 50% מלאה בסיליקון, ועם 10 עד 15 סיכות חיתוך.
הוסף חמישה מיליליטר של טמפרטורת החדר, האנקס חוצץ לצלחת לאחר המתת חסד של העכבר על פי שיטות מאושרות וכריתת קטע מעי גס דיסטלי בין אפס לשישה סנטימטרים מפי הטבעת. השתמש במספריים כדי לחתוך. פתח את המעי הגס לאורך והסר את תוכן הצואה.
הצמד את הרקמה לצלחת חיתוך הסיליקון המכילה את המאגר של האנק כשפני השטח הריריים פונים כלפי מעלה. מתחו את הרקמה באמצעות סיכות החיתוך. לאחר מכן הניחו לו לנוח 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר קפלים מהרקמה ולאפשר לשכבות השריר להירגע.
פועל לאחר שהרקמה נחה, הסר את כל סיכות הקצה מלבד סיכות הקצה. החלק סכין גילוח מתחת לחלק הרקמה הרצוי, ולאחר מכן שפך את מאגר ההנקס. הוסף סכין גילוח נוסף למעלה והכין כריך.
חותכים את קטע הרקמה ומסירים את סיכות הקצה. העבירו את כריך הרקמה של סכין הגילוח לקרח יבש. הניחו לממחטת הנייר לקפוא למשך חמש עד 10 דקות.
הרם את כריך רקמת הגילוח ואפשר לו להתחמם מעט על ידי הנחת אצבע על הלהב העליון. מפרידים את הכריך וחותכים סביב שולי קטע הרקמה. חיתוך קטע רקמה כ- 0.5 סנטימטר על סנטימטר אחד.
הניחו לרקמה להתחמם עד שהקרח על גבי הרקמה מתחיל להימס. בשלב זה, לחץ במהירות ובזהירות את הרקמה לתוך בלוק ה-OCT. בקריוסטט הניחו אצבע על הדגימה.
העברת החום תאפשר לך להסיר את הלהב מבלי לשבש את הרקמה. צפו את הטישו ב-OCT והניחו לו להתייצב במשך חמש דקות. ואז חותכים חלקים ב -10 מיקרון.
הניחו את החלקים על שקופית ובדקו ויזואלית את החלקים עד לצפייה בקריפטה. הניחו חלקים בצינורות של 1.5 מיליליטר או על מגלשות. תמונה זו מציגה רקמת מעי גס מוכתמת בהמטין אואין בחתך מסורתי עם השריר העגול המסומן cm.
רירית השרירים המסומנת MM תאי בסיס הקריפטה, תאי המעבר ותאי פני השטח נראים בבירור. תמונה זו מציגה את השרירים המעגליים לאחר חתך סדרתי. ככל שאנו מתקדמים לעבר תאי פני השטח, נראית רירית השרירים.
תמונה זו מציגה תאי בסיס קריפטה מוכתמים ב-h ו-D בהגדלה גבוהה יותר. שימו לב להיעדר לומן מרכזי. כאן נראים תאי מעבר ותמונה זו מציגה את תאי פני השטח.
התמונות הבאות מראות צביעה אימונו-פלואורסצנטית של קריפטות מעי גס מבודדות לצביעה עבור חלבון צומת התא לתא. Soula occludin one או ZO one מופיע בירוק וגרעינים שנראים כחולים נצפים בחתך רוחב. תאי המעבר ופני השטח מוצגים כאן לאחר חתך סדרתי.
מספר גורמי בידול באים לידי ביטוי בצורה מרחבית-זמנית לאורך ציר פני השטח של קריפ. זה כולל את גורם השעתוק הנכה כמו פקטור 4 המוצג בירוק, המועשר באוכלוסיות תאים על פני השטח כאשר צופים בו בחתך סדרתי מאפשר הערכת PCR בזמן אמת של רמות KLF ארבע mRNA בין שלושת התאים. לבסוף, כתם מערבי זה מדגים רמות של חלבון KLA 4 באוכלוסיות תאים אלה.
אל תשכח שעבודה עם להבי מיקרוטון עלולה להיות מסוכנת ביותר, אז היזהר במיוחד בכל פעם שאתה מבצע הליך זה.
סקירה
מאמר זה מתאר שיטה לבידוד תאי פני השטח האפיתליים של המעי הגס העכברי מתאי הקריפטה הבסיסיים. השיטה מאפשרת את פירוק המעי הגס לשני אזורים: אזור הקריפטה K המתחלק ותאי האפיתל הפנימיים המובחנים.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- נוירו-מדע
- ביולוגיה של תאים
- היסטולוגיה
רקע
- בידוד תאי האפיתל של המעי הגס חיוני לחקר ביטוי גנים וחלבונים.
- הנוהל כולל מיקרו-ניתוח של אזורים ספציפיים של המעי הגס.
- טכניקות PCR בזמן אמת ו-Western blot משמשות לניתוח הדגימות.
- הליכי טיפול בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית הרלוונטית.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה מהירה וזולה לבידוד תאי האפיתל של המעי הגס.
- להדגים תפוקה גבוהה בתהליך הבידוד.
- להקל על חקר גורמי ההתמיינות בתאי המעי הגס.
שיטות ששימשו
- ניתוח מעי עכבר והקפאה בין לוחות מתכת.
- הרכבת רקמה על גוש OCT וחיתוך בעובי 10 מיקרון.
- שימוש בלהבי גילוח לבידוד קטעי רקמה רצויים.
- צביעה אימונופלורסנטית להמחשת חלבוני צומת התאים.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של תאי בסיס הקריפטה ותאי האפיתל הפנימיים.
- המחשת גורמי התמיינות לאורך ציר פני השטח של הקריפטה.
- ניתוח PCR בזמן אמת ו-Western blot אישר רמות ביטוי גנים וחלבונים.
- התמונות הראו הבדלים ברורים בין סוגי התאים.
מסקנות
- השיטה המתוארת יעילה ומניבה דגימות באיכות גבוהה.
- היא מאפשרת ניתוח מפורט של התמיינות תאי האפיתל של המעי הגס.
- מחקרים עתידיים יכולים לנצל את השיטה הזו לתובנות נוספות בביולוגיה של המעי הגס.
