3 차원 형광 이미지에서 세포 형태학의 변경 사항 단정 지을 분석 도구

이 절차의 전반적인 목표는 3차원 컨포칼 형광 이미지에서 가져온 정의되지 않은 형상 셀의 형태 변화를 분석하고 정량화하는 자동화된 방법을 제공하는 것입니다. 이는 먼저 작용제 세포로 처리된 세포, 길항제로 처리된 세포, 작용제와 처리되지 않은 세포를 포함하는 화학적 자극 실험을 수행하여 수행됩니다. 그런 다음 세포는 면역 형광 분석을 위해 준비됩니다.

두 번째 단계는 다중 스펙트럼 3차원 형광 이미지를 획득하는 것입니다. 다음으로 ameris neuroscience, ameris XT 및 MATLAB 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 3차원 형태 분석을 수행합니다. 3차원 형태 분석을 통해 시각화된 단일 세포 표현형 변화는 최종 단계로 분석되고 정량화됩니다.

궁극적으로 이 소프트웨어 플랫폼은 수용체 활성화 후 세포 모양의 변화를 정량화하는 데 사용되어 약물 발견을 위한 추가 도구를 제공합니다. 일반적으로 연구자는 생물학적 시스템에 대한 표준 전문 지식을 가지고 있으며 컴퓨터 응용 프로그램에 익숙하지 않을 수 있습니다. 이 프로토콜에서 I 60 모듈, 이 절차를 시작하기 전에 시각화와 컴퓨터 언어 사이의 격차를 해소하십시오.

서면 프로토콜에 언급된 바와 같이 hemagglutinin 태그가 지정된 코르티코트로핀 방출 인자 수용체 2 또는 CRF R 2로 인간 배아 신장 세포를 transfection합니다. CFR 2는 G 단백질 결합 수용체 또는 GPCR입니다. transfection 화염 덮개가 미끄러져 들어간 다음 날, 6개의 웰 플레이트에 넣습니다.

동결건조된 폴리리신 5mg이 든 바이알에 PBS 10ml를 넣고 섞습니다. 그런 다음 500밀리리터의 PBS에 5밀리리터의 용해된 폴리리신을 희석하고 각 커버 슬립에 2밀리리터의 혼합물을 추가합니다. 커버 슬립이 있는 플레이트를 실온에서 20분 동안 그대로 두십시오 20분 후 PBS 2ml를 첨가하여 커버 슬립을 세척한 다음 제거하고 이 과정을 두 번 반복합니다.

10%FBS 매체가 포함된 2밀리리터의 DMEM을 편집한 다음 커버 슬립에 2-5방울의 세포를 추가합니다. 세포는 60%co 유창성을 달성하기 위해 필요한 농도에 있어야 합니다. 다음 날.

다음날 섭씨 37도에서 밤새 세포를 배양합니다. 작용제 치료를 위해 세포가 60% 융합되어 있는지 확인하십시오. 배지를 1마이크로몰 농도에서 CRF R 2개의 내인성 리간드 부신 피질 자극 호르몬 방출 인자로 보충된 2밀리리터의 배지로 대체하여 지정된 세포를 자극합니다.

섭씨 37도의 인큐베이터에서 세포를 30분 동안 배양하여 세포를 길항제로 전처리합니다. 배지를 1마이크로몰의 농도에서 선택적 CFR, 2개의 길항제, 회수 방지 30이 보충된 2밀리리터의 배지로 교체하십시오. 섭씨 37도의 인큐베이터에서 30분 동안 세포를 배양합니다.

길항근 치료 후. 작용제 CRF로 세포를 자극하고 처리되지 않은 세포의 경우 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 처리 후 미디어를 2ml의 새 미디어로 교체하십시오.

각 웰의 배지를 2밀리리터의 새 배지로 교체하고 섭씨 37도에서 60분 배양 후 1-1,000개로 희석된 안티 HHA를 추가합니다. 배지를 흡입하고 각각에 2ml의 고정제를 추가합니다. 정착액을 흡인시킨 후 20분 동안 실온에서 플레이트를 잘 배양합니다.

트리스 복식 식염수로 세포를 세 번 씻습니다. 케 인. 각 덮개 위에 100마이크로리터의 혈액 용액을 넣고 밀어 넣고 30분 동안 실온에서 배양합니다. 그런 다음 웰에서 기존 블로토 용액을 흡인하고 각 커버 슬립에 100마이크로리터의 새로운 2차 항체 칵테일을 추가한 후 어두운 곳에서 실온에서 45분 동안 배양한 후 최종 세척 용액에 있는 동안 웰 측벽에서 용액을 부드럽게 추가 및 제거하여 TBSC로 4회 세척합니다.

바늘과 구부러진 집게로 각 커버 슬립을 집습니다. 매니큐어로 단정하게 고정한 벡터 쉴드 장착 매체 한 방울이 있는 슬라이드 슬립 셀을 아래로 향하게 하여 슬라이드에 놓고 15-20분 동안 건조시킵니다. Alexa, 4 88 나노미터 접합체 뮤즈 항체는 CFR 2를 시각화하는 데 사용되며 DAPI는 핵 유사분열 단계를 시각화하는 데 사용되어 고정 세포를 형광 현미경에 장착하기 시작하여 실험 주관성을 제한하고 이미지를 획득하기 위해 이미지를 획득하고 분석하기 위해 분석할 때까지 실험 조건을 알 수 없습니다.

63배 배율 및 1.4 개구수를 가진 Plan acro mat oil, DIC objective를 coherent integrated two photon laser system에 연결된 zeis LSM five 10 meta confocal microscope와 함께 사용했습니다.데이터 수집 프로세스 중에 핵막에서 외부 세포외 수용체 말단까지의 데이터를 포함하도록 다중 채널 및 c 분할을 통해 세포를 구획화합니다. 3D 현미경 데이터 세트의 시각화 및 세분화를 허용하는 amris를 사용하여 형광 데이터를 처리합니다. 먼저 Amaris가 설계한 알고리즘에 따라 표면 렌더링을 활용하여 NU 핵막을 나타냅니다.

Amaris는 관심 영역에 하나 이상의 핵이 있는지 또는 ROI가 있는지 확인합니다. 그런 다음 스팟 생성 알고리즘을 사용하여 CFR 두 개의 확장 지점을 찾습니다. CFR 2의 형광 검출의 각 단위의 포함을 최대화하기 위해 비정질 모양의 세포의 복잡한 네트워크의 배경 노이즈 및 불규칙한 강도를 보상하고, 스폿 직경을 이미지 내에서 가장 작은 단위인 0.2 마이크로미터로 설정합니다.

이를 통해 측정된 강도의 형태로 고유한 정보를 외삽할 수 있습니다. 가우스 필터를 사용하여 스폿의 자동화된 생성 프로세스에 스폿 필터링을 통합합니다. 데이터 양이온을 방지하려면 데이터 세트를 8비트 고정 소수점에서 32비트 부동 소수점으로 변환합니다.

생성된 표면을 선택하고 핵막을 기준점으로 사용하여 거리 변환을 수행하여 핵 표면 외부 각 지점의 정확한 공간 위치를 결정합니다. MATLAB과 인터페이스하는 ameris XT 모듈을 사용하여 복셀 강도 데이터를 스폿 좌표 데이터로 교환합니다. 스폿을 선택하고 통계 유형으로 코드화된 통계를 선택합니다.

생성된 새 채널에서 보고된 강도 중심을 선택합니다. 표시할 원하는 색상을 로드하고 분석을 위한 색상 맵 범위를 설정합니다. 숫자 데이터는 통계 탭에서 시각화하고 GraphPad 프리즘을 사용하여 Excel로 내보낼 수 있습니다.

결과 데이터를 정량화하고 통계 분석을 위해 그래픽 형식으로 표시합니다. 양방향 Inova 및 Bonferroni 사후 테스트를 사용하여 그룹 간 비교를 수행하면 데이터가 평균 플러스 또는 마이너스 표준 편차로 표시됩니다. 이 접근법의 힘을 입증하기 위해, G-단백질 결합 수용체와 부신 피질 자극 호르몬 방출 인자 수용체 2와 내인성 리간드 CRF의 상호 작용으로 인한 세포 변화.

형질주입된 HT K 2 93 세포에서 병합된 이미지는 Alexa 4 88 conjugated, anti mouse, secondary antibody 및 DPI를 사용하여 시각화하여 핵을 시각화합니다. 그 결과, CRF R, 두 개의 수용체가 원형질막에 위치하며 세포 막의 유한한 영역에서 돌출되어 있음을 알 수 있습니다. 종래의 2D 분석을 사용하여, 유리 덮개 상의 수용체 접착점이 분석되는 경우에만 세포외 CRF R 두 수용체의 이러한 하위 집합을 검출할 수 있습니다.

결과적으로 ZS 적층 MULTISPECTRAL 데이터에서 파생된 다른 모든 정보가 손실됩니다. 그 결과, 무치료와 작용제 사이에 차이가 없었다. 세포가 CRF로 처리될 때 수용체 접착 지점은 극적으로 다르지만, 원형질막에서 반점의 거리가 감소하는 것에서 알 수 있듯이 세포 외 수용체는 크게 감소합니다.

그들은 또한 주로 유한한 위치에서 여러 개의 신중한 위치로 재분배됩니다. 수용체 막 분포에 대한 CRF의 영향은 CR 2개의 특이적 길항제와 전처리함으로써 방지됩니다. 30 30.

이러한 조건하에서, CRFR 2 확장은 CRF 처리로 변경되지 않습니다. 5마이크로미터 스펙트럼의 색상으로 구분된 간격으로 표시된 점의 원위 분포는 핵막에서 복셀까지의 거리를 시각화하는 데 사용됩니다. 작용제 치료 전 치료 및 길항제 전처리에서는 GPCR 수축에 유의한 차이가 나타나지 않았습니다.

작용제 CRF로 세포를 처리하면 무처리 또는 세포와 비교할 때 복셀을 포함하는 CFR 2의 수가 점진적으로 감소합니다. 길항제와 함께 사전 처리됨 그의 발달 후 As. 이 기술은 정량화 이미징 기술 분야의 연구자가 수많은 단일 세포 표현형 변화를 탐색하고 특성화하는 데 도움이 되었으며, 이 세포 기반 분석은 약물 발견 프로세스를 위한 추가 단일 세포 프로파일링 도구가 되었습니다.