3 차원 형광 이미지에서 세포 형태학의 변경 사항 단정 지을 분석 도구

본 절차의 전반적인 목표는 3차원 공초점 형광 이미지에서 추출한 비정형 세포의 형태 변화를 분석하고 정량화하는 자동화된 방법을 제공하는 것입니다. 이를 위해 먼저 효능제 처리 세포, 길항제 처리 후 효능제 처리 세포, 그리고 무처리 세포를 포함하는 화학적 자극 실험을 수행합니다. 이후 세포를 면역형광 분석을 위해 준비합니다.

두 번째 단계는 다분광 3차원 형광 이미지를 획득하는 것입니다. 그다음 ameris neuroscience, ameris XT 및 MATLAB 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 3차원 형태 분석을 수행합니다. 마지막 단계로, 3차원 형태 분석을 통해 시각화된 단일 세포의 표현형 변화를 분석하고 정량화합니다.

궁극적으로 이 소프트웨어 플랫폼은 수용체 활성화에 따른 세포 형태의 변화를 정량화하는 데 사용되며, 이는 신약 개발을 위한 추가적인 도구를 제공합니다. 일반적으로 연구자들은 생물학적 시스템에 대한 표준 전문 지식을 갖추고 있지만, 컴퓨터 애플리케이션에는 익숙하지 않을 수 있습니다. 본 I 60 모듈 프로토콜에서는 이 절차를 시작하기 전에 시각화와 컴퓨터 언어 사이의 간극을 메워줍니다.

서면 프로토콜에 명시된 대로, 헤마글루티닌(hemagglutinin) 태그가 붙은 부신피질자극호르몬 방출인자 수용체 2(corticotropin releasing factor receptor two) 또는 CRF R2를 인간 배아 신장 세포에 형질전환합니다. CRF R2는 G 단백질 결합 수용체(G protein coupled receptor) 또는 GPCR입니다. 형질전환 다음 날, 커버스립을 화염 멸균하여 6-웰 플레이트에 배치합니다.

동결 건조된 polylysine 5 mg이 들어 있는 바이알에 PBS 10 milliliters를 추가하고 혼합합니다. 그다음, 용해된 polylysine 5 milliliters를 PBS 500 milliliters에 희석하고, 이 혼합액 2 milliliters를 각 커버슬립 위에 추가합니다. 커버슬립이 놓인 플레이트를 실온에서 20분 동안 둡니다. 20분 후, PBS 2 milliliters를 추가했다가 제거하는 방식으로 커버슬립을 세척하며, 이 과정을 두 번 반복합니다.

10% FBS가 함유된 DMEM 배지 2 mL를 넣은 후, 커버슬립 위에 세포를 2~5방울 떨어뜨립니다. 세포는 60% 합류도(confluency)를 달성할 수 있는 적절한 농도여야 합니다. 다음 날.

다음 날까지 세포를 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 효능제 처리를 위해 세포의 합류도가 60%인지 확인합니다. 1 µM 농도의 CRF R2 내인성 리간드인 corticotropin releasing factor가 첨가된 배지 2 mL로 배지를 교체하여 지정된 세포를 자극합니다.

세포를 37 °C 인큐베이터에서 30분 동안 배양하여 길항제로 전처리합니다. 배지를 1 µM 농도의 선택적 CFR2 길항제 anti salvaging 30이 첨가된 배지 2 mL로 교체합니다. 세포를 37 °C 인큐베이터에서 30분 동안 배양합니다.

길항제 처리 후, 처리하지 않은 세포의 경우 효능제 CRF로 세포를 자극하고 37°C에서 30분 동안 배양합니다. 처리 후에는 배지를 2 mL의 신선한 배지로 교체합니다.

각 웰의 배지를 2 mL의 신선한 배지로 교체하고 37 °C에서 60분 동안 배양한 후, 1:1000으로 희석한 anti-HHA를 첨가합니다. 배지를 흡입하여 제거하고 각 웰에 고정액 2 mL를 추가합니다. 고정액을 흡입하여 제거한 후, 플레이트를 실온에서 20분 동안 배양합니다.

tris buffered saline(TBS)으로 세포를 3회 세척합니다. 각 커버슬립 위에 100 µL의 블로킹 용액을 첨가하고 상온에서 30분 동안 배양합니다. 그 다음, 웰에서 기존의 블로킹 용액을 흡입하여 제거하고, 각 커버슬립에 100 µL의 신선한 2차 항체 칵테일을 첨가한 후 암실 상온에서 45분 동안 배양합니다. TBSC로 4회 세척하며, 이때 용액을 웰의 측벽을 통해 부드럽게 넣고 제거하며 세척하고 마지막 세척 용액이 남아있는 상태에서 종료합니다.

바늘과 곡선 핀셋을 사용하여 각 커버슬립을 집어 올립니다. 벡터 쉴드(vector shield) 마운팅 용액 한 방울이 떨어져 있는 슬라이드 위에 커버슬립의 세포 면이 아래로 향하게 놓은 뒤, 매니큐어를 사용하여 고정하고 15분에서 20분 동안 건조시킵니다. CFR2를 시각화하기 위해 Alexa 488 nm 접합 마우스 항체를 사용하며, 핵의 유사분열 단계를 시각화하기 위해 DAPI를 사용합니다. 관찰을 시작하려면 고정된 세포를 형광 현미경에 마운팅합니다. 실험적 주관성을 제한하기 위해, 이미지를 획득하고 분석할 때까지 실험 조건을 알지 않은 상태로 유지하여 이미지를 획득합니다.

63배 배율과 1.4 수치 구경을 갖는 plan acro mat 오일 DIC 대물렌즈를 coherent 통합 이광자 레이저 시스템에 연결된 zeis LSM five 10 meta 공초점 현미경과 함께 사용하였습니다. 데이터 획득 과정에서, 핵막부터 외부 세포외 수용체 말단까지의 데이터를 포함하도록 멀티채널 및 c 분할을 통해 세포를 구획화합니다. 3D 현미경 데이터셋의 시각화 및 세분화가 가능한 amris를 사용하여 형광 데이터를 처리합니다. Amaris에서 설계한 알고리즘에 따라, 먼저 표면 렌더링을 활용하여 NU 핵막을 나타냅니다.

Amaris는 관심 영역(ROI) 내에 핵이 하나 이상 존재하는지 판단합니다. 다음으로 스팟 생성 알고리즘을 사용하여 CFR two 확장 스팟의 위치를 찾습니다. 무정형 세포들의 복잡한 네트워크에서 발생하는 배경 노이즈와 불규칙한 강도를 보정하여 CFR two의 각 형광 검출 단위를 최대한 포함할 수 있도록, 스팟 직경을 이미지 내 최소 단위인 0.2 micrometers로 설정합니다.

이를 통해 측정된 강도 형태의 뚜렷한 정보를 외삽할 수 있습니다. 가우시안 필터를 사용하여 스팟의 자동 생성 과정에 스팟 필터링을 통합하십시오. 데이터 손실을 방지하려면 데이터 세트를 8비트 고정 소수점에서 32비트 부동 소수점으로 변환하십시오.

생성된 표면을 선택하고, 핵막을 기준점으로 하여 거리 변환(distance transformation)을 수행함으로써 핵 표면 외부의 각 스팟에 대한 정확한 공간적 위치를 결정합니다. MATLAB과 인터페이스된 ameris XT 모듈을 사용하여 복셀 강도 데이터를 스팟 좌표 데이터로 변환합니다. 스팟을 선택하고 통계 유형에서 통계 코딩을 선택합니다.

새로 생성된 채널에서 보고된 강도 중심(intensity center)을 선택하십시오. 디스플레이에 사용할 원하는 색상을 로드하고 분석을 위한 컬러 맵 범위를 설정하십시오. 수치 데이터는 통계 탭에서 시각화할 수 있으며, GraphPad prism을 사용하여 excel로 내보낼 수 있습니다.

결과 데이터를 정량화하고 통계 분석을 위해 그래프 형식으로 제시합니다. 이원 분산 분석(two-way ANOVA)과 Bonferroni 사후 검정을 사용하여 그룹 간 비교를 수행하며, 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시합니다. 이 접근법의 효용성을 입증하기 위해, G-단백질 결합 수용체와 부신피질 자극 호르몬 방출 인자 수용체 2가 내인성 리간드인 CRF와 상호작용하여 발생하는 세포 변화를 보여줍니다.

형질전환된 HT K 2 93 세포에서 정량화된 병합 이미지는 Alexa 4 88 접합 항마우스 2차 항체와 핵 시각화를 위한 DPI를 사용하여 시각화되었습니다. 결과에 따르면 CRF R two 수용체는 세포의 형질막에 위치하며 막의 한정된 영역으로부터 돌출되어 있음을 알 수 있습니다. 일반적인 2D 분석을 사용할 경우, 유리 커버 위의 수용체 부착 지점을 분석해야만 이러한 세포외 CRF R two 수용체 하위 집합을 검출할 수 있습니다.

결과적으로, ZS 적층 다중 스펙트럼(MULTISPECTRAL) 데이터에서 도출된 다른 모든 정보는 소실됩니다. 그 결과 무처리군과 작용제 처리군 사이에 차이가 없는 것으로 나타났습니다. 세포에 CRF를 처리했을 때 수용체 부착 지점은 극적으로 달라지지만, 세포막으로부터의 점 간 거리가 감소하는 것으로 보아 세포외 수용체는 크게 감소했음을 알 수 있습니다.

또한 이들은 주로 한정된 위치에서 여러 개의 개별적인 위치로 재분포됩니다. 수용체 막 분포에 미치는 CRF의 효과는 CR2 특이적 길항제를 전처치함으로써 방지됩니다. 30 30.

이러한 조건에서, CRFR의 두 연장 부위는 CRF 처리로 인해 변화하지 않습니다. 5 µm 스펙트럼 색상 코딩 간격으로 도식화된 점들의 원위 분포를 활용하여 핵막으로부터 복셀의 거리를 시각화합니다. 무처리군과 작용제 처리 전 길항제 전처리군은 GPCR 수축에서 유의미한 차이를 보이지 않았습니다.

효능제 CRF로 세포를 처리하면, 무처리군 또는 길항제 As로 전처리한 세포와 비교했을 때 CRF2를 포함하는 복셀의 수가 점진적으로 감소합니다. 이러한 기술은 정량 영상 기술 분야의 연구자들이 수많은 단일 세포 표현형 변화를 탐색하고 특성화할 수 있는 길을 열어주었으며, 이 세포 기반 분석법을 신약 개발 과정의 추가적인 단일 세포 프로파일링 도구로 만들어 주었습니다.