Name: 3 차원 형광 이미지에서 세포 형태학의 변경 사항 단정 지을 분석 도구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 배우세요 3차원 형광 이미지에서 비정형 세포의 형태학적 변화를 자동 분석하고 정량화하는 방법을. Imaris와 MATLAB을 활용한 이 기술은 신경과학 및 약물 발견 연구에 활용됩니다.

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우리는 Imaris, Imaris XT와 MATLAB의 사용에 대한 캘리포니아의 생물 이미징 개발 센터 (BIDC) 대학, 샌프란시스코 감사합니다. 우리는 기술 지원 및 헨리, LK Floren, 원고의 편집에 대한 그들의 공헌에 대한 L. Daitch AT V. Kharazia 감사드립니다. 1R21DA029966-01과 약국의 세브 UCSF 학교에 MLSMR 컬렉션을 화면으로 NIH 패스트 트랙 상 (:이 작품은 세브 국립 보건원에 UCSF을 통해 알코올 및 약물 중독에 캘리포니아 의료 연구의 주에서 자금에 의해 지원되었다 딘의 사무실 및 임상 약학)와 CLHK에 의학 대학 (임상 약리학 및 실험 치료학).

1. 단일 셀 Phenotypic 변경의 세 가지 차원 Morphometric 분석 <ol><li> 인간 배아 신장 (HEK293) 세포와 transfected 된 적혈구 응집소 (HA) corticotropin이 같은 G 단백질 결합 수용체 (GPCR)는 이전 4 5 요소 수용체-2 (CRF-R2) 설명 릴리스 태그. </li><li> 세포는 (AS CRF-R2의 내생의 리간드, corticotropin 방출 인자, CRF (1 μM, 30 분) 또는 선택적 CRF-R2 길항제, 항 sauvagine 30과 pretreated와 자극, (NO 치료, NT) 치료 남은 -30, 1 μM, 작용제 치료 이전 30 분). </li><li> 세포는 다음 고정 per​​meabilized 및 안티 HA로 치료했다. CRF-R2 알렉사 594 nm의 공액 안티 - 마우스 (IgG 1) 항체를 사용하여 시각화했다. DAPI는 핵의 mitotic 단계를 시각화하는 데 사용되었다. </li><li> 실험을 주관를 제한하려면 실험 조건은 이미지를 획득하여 분석 하였다 전까지는 알려져 있지 않았습니다. </li><li> 우리는 이미지를 획득베르디 - V5 레이저와 미라 900-F 레이저 시스템 구성 코 히어 런트 통합 두 광자 레이저 시스템에 연결 계획 - 고차 색지움 63x/1.4 오일 DIC 목표와 Zeiss LSM 510 META 공 촛점 현미경을 사용하여 고정 HEK293 세포에서 s입니다. </li><li> 데이터 수집 과정에서 세포는 모두 바깥 쪽 세포 수용체에 핵 막에서 데이터를 포함하는 multispectral sectioning, 488 nm의, 그리고 790 nm의 (~ 350 nm의 2ph​​ 예.) 및 z-분할 (0.5 μm 단위)에 의해 compartmentalized되었습니다 극단. </li><li> 형광 데이터가 처음 3D 현미경 데이터 세트의 시각화 및 세분화 할 수 있습니다 Imaris를 사용하여 처리되었고, 입방 voxels로 구성된 3D 모델은 morphometric 분석을 위해 만들어졌습니다. 그런 다음 Imaris XT 모듈은 GPCR 확장의 좌표 위치를 결정하기 위해 MATLAB 컴퓨터 프로그램 언어 인터페이스 Imaris로 활용되었다. 계정 세포 다양성을 고려하기 위해, 우리는 형광 이미지 치 렀어를 획득하고 분석22 세포에서 전용 : 작용제 치료 (N = 7) 이전없이 처리 (NT) (N = 7), 작용제 (CRF) 처리 (N = 8) 및 길항제와 사전 처리 (AS-30) (그림 2) . <ol><li> 관심 지역 (ROI)은 활성 mitotic 단계에 있지와 다른 셀에 닫지 한 셀이 포함되어야합니다. 이러한 방법으로 분석 한 핵 및 수용체 확장과 세포가 다른 세포의 가까이에 어리둥절하지 않습니다 포함됩니다. </li><li> 셀룰러 3D 구조가 먼저 Imaris (v.7.1.1)를 사용하여 multispectral 형광 데이터를 복원되었다. </li><li> Imaris가 설계 한 알고리즘을 따라 먼저 표면 렌더링은 핵 멤브레인을 나타 내기 위해 이용되었다. 투자 수익 (ROI)에서 하나 이상의 핵이있을 경우 Imaris를 결정합니다. </li><li> 그런 다음 명소 - 생성 알고리즘은 CRF-R2 확장을 찾습니다 활용되었다. 가 배경 소음의 불규칙 강도에 대한 보상 때문 명소 감지를 활용 한비정질 모양의 세포의 복잡한 네트워크. </li><li> CRF-R2의 형광 검출의 각 단위의 포함을 극대화하려면 명소 &#39;직경은 가우스 필터를 사용하여 측정 강도의 형태로 뚜렷한 정보를 추정 할 수있는 이미지 내의 가장 작은 단위입니다 0.2 μm로 설정되었습니다. 스팟 필터링이 명소 자동 생성 과정에 통합되었습니다. 이 소프트웨어는하지만, 사용자에게 매개 변수를 정의하는 필터를 사용하여 할 수있는 유연성을 제공합니다. </li><li> 데이터 잘림을 방지하려면 데이터 세트는 32 비트의 십진수로 8 비트 (서명) 고정 소수점에서 개조되었습니다. </li><li> voxel 농도 데이터는 참조 점 (그림 3)과 같이 핵 멤브레인을 사용하여 거리 변환을 수행하여 결정되었습니다 Imaris XT의 MATLAB과 인터페이스 모듈과 각 지점의 정확한 공간 위치를 사용하여 좌표 데이터를 파악하기 위해 교환했다. </li></ol></li><li> 그 결과 데이터는 s에 대한 정량화 및 그래픽 형식으로 제시 될 수 있습니다tatistical 분석. 그룹 간의 비교는 양방향 ANOVA와 Bonferroni posttest를 사용하여 수행되었습니다. 데이터는 의미 ± SD를로 제공됩니다. 차이는 * P는 &lt;0.05에서 중요한 것으로 간주됩니다. 계산 GraphPad의 프리즘 5.02 (그림 4)로 만들어졌다. </li></ol> 2. 대표 결과 접근의 힘을 보여하기 위해, 우리는 세포 변화를 정량화이 G 단백질 결합 수용체 (GPCRs)와 corticotropin 방출 인자 transfected HEK293 세포에서의 내생 리간드 CRF있는 수용체-2 (CRF-R2)의 상호 작용 따른 모든 책임은 사용자에게 있습니다. 우리는 CRF-R2 수용체는 세포 (그림 2A와 영화 1) 멤브레인의 유한 지역의 플라즈마 막 및 프로젝트에있는 것을 보여줍니다. 기존의 2D 분석 사용하면, 우리가 수용체 부착 PO를 분석하는 경우에만 세포 CRF-R2 수용체의 하위 집합을 감지 할 수 있습니다유리에 ints이 적용됩니다. 따라서 우리는 Z-스택 multispectral 데이터 (그림 5)에서 파생 된 다른 정보를 잃게됩니다. 플라즈마 막에서 장소 거리의 감소에 의해 그림과 같이 셀이 CRF로 치료하는 경우, 세포 수용체가 크게 감소하고 있습니다. 또한 분리 된 지역의 수 (그림 2B와 영화 2)에 주로 유한 위치에서 배포됩니다. 수용체 막 배포 CRF의 효과는 CRF-R2 특정 길항제, antisavagine 30 일 (AS-30) 전처리에 의해 방지하고 우리는 CRF-R2 확장 (그림 2C와 영화 3) 변경되지 않는 것을 발견합니다. 장소의 말초 배포, 5 μm 스펙트럼 컬러 코딩 간격으로 해본 핵 막에서 voxels의 거리를 시각화하기 위해 사용됩니다. 어떤 치료 및 길항제 pretreatm 없습니다다닐이 (AS-30, 1 μM, 30 분) 작용제 치료 (CRF, 1 μM, 30 분) 전에 GPCR의 수축에 중요한 (NS) 차이를 보여 없습니다. 더 치료, 0-5 μm (NS), 6-15 μm (에 비해 작용제 (CRF, 1 μM, 30 분)과 세포의 치료는 점점 CRF-R2 함유 voxels의 수를 감소 ** P &lt; 0.01) 및&gt; 15 μm (*** P &lt;0.005) 또는 AS-30 처리, 0-10 μm (NS), 11-15 μm (비교 ** P &lt;0.01)와&gt; 15 μm (*** P &lt;0.005) (그림 4). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig1.jpg" /> 1 그림. 현재 사용 가능한 기술과 형광 이미지를 분석하기 위해 제한의 다이어그램. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4233/4233fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig2.jpg" /> <strong&gt; 그림 2. 작용제 및 길항제 치료 전후 HA-CRF-R2와 HEK293 transfected 세포의 3D multispectral 형광 이미지. 표시 병합 이미지 안티 - HA를 사용 HA-CRF-R2는 - 탐색과 알렉사 488 복합 항 마우스 (IgG 1) 이차 항체를 사용하여 시각화, DAPI는 핵을 시각화하는 데 사용되었다. 이미지는 공 촛점 레이저 스캐닝 (CLS) 현미경으로 획득했다. 스케일 바 5 μm. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig3.jpg" /> 그림 3은. HA-CRF-R2와 HEK293 transfected 세포의 3D 모델은 Imaris 소프트웨어를 사용하여 CLS 이미지에서 복원. 작은 소포로 변환 GPCR 확장을 설명하는 핵 및 명소 생성의 표면 렌더링. 형광 데이터가 처음 3D 현미경 데이터 집합의 시각화 및 세분화 할 수 있습니다 Imaris을 사용하여 처리 하였다. 그런 다음, Imaris XT는 MATLAB과 인터페이스 Imaris로 활용되었다. voxel 농도는로 교환되었다장소 맡고있다. 명소 스펙트럼 코딩 된 색상 (파란색 0-5 μm, 녹색, 6-10 μm, 노란색 11-15 μm과 빨간색&gt; 15 μm) 거리 형태 핵 멤브레인을 나타냅니다. 5 μm 크기를 조정. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig4.jpg" /> 그림 4. 장소의 말초 배포의 그래픽 표현을 5 μm 간격으로 코딩 된 스펙트럼 색에 해본는 핵 막에서 voxels의 거리를 시각화하기 위해 사용됩니다. 작용제 치료 전에 길항제 (AS-30, 1 μM, 30 분) (CRF, 1 μM, 30 분)를 가진 치료 및 전처리는 GPCR의 수축에 중요한 (NS) 차이를 보여 없습니다. 더 치료를 0-5 μm (NS), 6-15 μm을 (** P 비해 작용제 (CRF, 1 μM, 30 분)과 세포의 치료는 점점 CRF-R2 함유 voxels의 수의 거리를 감소 &lt;0.01)와&gt; 15 μm (*** P &lt;0.005), 또는 AS-30 치료 0-10 μm (NS), 11-15<html> μm (** P &lt;0.01)와&gt; 15 μm (*** P &lt;0.005). <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig5.jpg" /> 그림 5. HA-CRF-R2와 HEK 293 transfected 세포의 2D morphometric 분석의 제한. 핵의 중심을 보여주는 세포의 중간 평면 섹션 (유리 coverslip 위에 3 4μm)는 DAPI와 HA-CRF-R2와 시각화 안티 - HA를 사용 탐지 및 알렉사 488nm 복합 안티 - 마우스 (IgG 1) 차를 사용하여 시각화 수용체 부착 지점은 크게 다릅니다 동안 항체와 CLS와 함께 인수는 (A) 노 처리 (NT)와 (B) 작용제 (CRF, 1 μM, 30 분) 사이에 차이점을 보여줍니다 없습니다. 영화는 1. 자유롭게 HA-CRF-R2, 아니 치료와 293 transfected 세포는 수용체 단백질 중 세포 표현형의 차이를 평가하는 HEK의 &quot;초과&quot;모드에서 3D 모델을 회전. 5-20 μm의 크기 바./ files/ftp_upload/4233/4233movie1.avi &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt; 영화를 보려면 여기를 클릭하십시오. 자유롭게 HA-CRF-R2, 작용제 치료로 293 transfected 세포가 HEK의 &quot;초과&quot;모드에서 3D 모델을 회전 영화 2., CRF (CRF, 1 μM, 30 분) 수용체 단백질 중 세포 표현형의 차이를 평가합니다. 5-20 μm에서 규모 바. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4233/4233movie2.avi" target="_blank">동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 영화 3. 자유롭게 HA-CRF-R2, 작용제 치료 전에 길항제 (AS-30, 1 μM, 30 분)로 전처리 (CRF, 1 μM, 30 분으로 293 transfected 세포는 HEK의 &quot;초과&quot;모드에서 3D를 회전 ) 수용체 단백질 중 세포 표현형의 차이를 평가합니다. 5-20 μm에서 규모 바. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4233/4233movie3.avi" target="_blank">동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

우리는 CRF 치료가 중요한 형태의 변화와 CRF-R2의 위치를​​ 유도 것으로 나타났다. CRF-R2의 변경 사항은 선택적 길항제 치료에 의해 저해되었다. 우리는 수용체 수정이 표준 2D multispectral 기술을 사용하여 감지되지 않은 및 측정 할 수없는 것으로 나타났다. 복잡한 3D 이미지를 연구 할 수있는 능력은 morphometric 분석을 위해 생물학적 매개 변수의 복잡성을 반영하는 것이 중요합니다. 우리는 일관성 형광 네트워크 구성 요소와 미리 정의 된 모양없이 세포의 3D 측정을 할 수있었습니다. 사용자가 수정할 자동화 된 방법 우리의 스위트 룸은 세포 역학에 대한 정보를 추출하기 위해 자신의 환경에서 개별 비정질 모양의 세포에서 분자 역학을 수량화 할 수있게. 이 도구는 셀룰러 경로와 억제제의 존재의 세포 형태의 변경에 약리 화합물의 효과에 대한 예측을하고 세포 생존에 대한 정보를 제공하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리의 3D 정량화 방법의 장점은 컴...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 인간 배아 신장 (HEK293) </td><td> 미국 유형 문화 수집 </td><td> CRL-1573 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco의 수정 된 이글 중간 (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 11965118 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 (FBS) </td><td> Invitrogen </td><td> SH30070.03 </td><td></td></tr><tr><td> AlexaFluor-488 (IgG2b) </td><td> Invitrogen </td><td> A-11001 </td><td></td></tr><tr><td> 단클론 항 HA.11 (IgG 1) </td><td> Covance </td><td> 16B12 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI </td><td> 벡터 연구소 </td><td> H-1200 </td><td>; </td></tr><tr><td> CRF </td><td> 시그마 </td><td> C2917 </td><td></td></tr><tr><td> Antisauvagine-30 (AS-30) </td><td> 시그마 </td><td> A4727 </td><td></td></tr></tbody></table>

3 차원 형광 이미지에서 세포 형태학의 변경 사항 단정 지을 분석 도구

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

형광 이미지를 측정에 사용할 수있는 가장 일반적인 소프트웨어 분석 도구는 데이터 요소 및 분석의 해석 및 결과를 지원하는 컴퓨터 지원 패턴 인식을 포함 및 제외에 대한 수동 설정에 의존 (2D) 2 차원 데이터입니다. 그것은 세포 역학의 복잡성을 캡처 및 생물학적 시스템 내에서 세포 소성의 기초를 이해 할 수하기 위해 (3D) 입체 데이터 세트로 구성 형광 이미지를 측정 할 수 있도록 점점 더 중요 해지고있다. 정교한 현미경 악기는 multispectral 형광 이미지와 다음 수집 된 2D 이미지의 3D 표현을 제공하는 공 촛점 스택에서 이미지를 reconstructs 강력한 분석 소프트웨어의 인수를 통해 3D 형광 이미지의 시각화를 허용하고 있습니다. 고급 디자인 기반 stereology 방법은 origina의 근사와 가정에서 진행 한복잡한 조직 섹션 2 리터 모델을 기반 stereology 1. 현미경에서 이러한 과학적 진보에도 불구하고, 필요 완전히 세포 형태, 단백질 지역화와 수용체 거래의 복잡한 변화의 분석 및 정량화 할 수 있도록하기 위해 고유 3D 데이터를 이용하는 자동화 된 분석 방법으로 남아있다. 형광 이미지를 수량화 할 수 현재 기술은 메타 Morph (분자 장치, 서니 베일, CA) 및 수동 분석을 제공합니다 이미지 J (NIH)가 포함되어 있습니다. Imaris (ANDOR 기술, 벨파스트, 북 아일랜드) 소프트웨어는 볼륨 이미지에 배치하거나 3D 객체를 생성하기 위해 2D 슬라이스 일련의 발행 할 수 있습니다 측정 포인트의 수동 생성을 수있는 기능 MeasurementPro을 제공합니다. 이 방법은 두 객체 사이의 선 거리를 측정하거나 관심있는 지역을 둘러싼 다각형을 만들려면 한 번만 클릭하면 포인트 측정에 유용하지만, compl에 적용하기가 어렵습니다예 셀룰러 네트워크 구조. 필라멘트 추적기 (ANDOR)는하지만,이 모듈은 이러한 수석, axons과 쪽 (구조 나무 등)으로 구성되어 있습니다 뉴런과 같은 정의 구조를 측정하기 위해 개발 된 필라멘트과 같은 3D neuronal 자동으로 감지 할 수 있습니다. 이 모듈은 ingeniously 비 neuronal 세포 3 형태학의 측정을하기 위해 사용되어 왔습니다 그러나, 출력 데이터 오히려 비정질 모양의 휴대폰 모델 것보다 정의 된 셀 모양에 따라 소프트웨어를 사용하여 확장 셀룰러 네트워크의 정보를 제공합니다. 비정질 모양의 세포를 분석하고 생물학적 응용 프로그램 소프트웨어가 더 적합의 문제를 극복하기 위해 Imaris은 Imaris 셀을 개발했다. 이 세포와 세포 기관 사이의 관계를 계산하기 위해 개발 된 Eidgenössische Technische Hochschule과 과학 프로젝트를했습니다. 소프트웨어는 세포 당 하나의 핵을 강요하여, 생물 제약의 검출을 가능하게하는 동안그리고 세그먼트 셀에 셀 멤브레인을 사용하여, 그것은 이상적으로는 무효 공간없이 세포 표면을 구축하기 때문에 연속되지 형광 데이터를 분석하기 위해 이용 될 수 없습니다. 우리의 지식으로, 현재 3D 형광 이미지에서 morphometric 정보를 제공합니다는 사용자가 수정할 수 자동화 접근 방식은 정의되지 않은 형태 (그림 1)의 세포 공간 정보를 달성 개발되지 않았습니다. 우리는 MATLAB (매트 작품 주식회사)에 인터페이스 Imaris 핵심 소프트웨어 모듈 및 Imaris XT를 사용하여 분석 플랫폼을 개발했습니다. 이 도구는 미리 정의 된 모양없이 일관성 형광 네트워크 구성 요소와 세포의 3D 측정을 할 수 있습니다. 또한,이 방법은 세포 역학에 형태학의 변화를 정량화을 수행하는 컴퓨터 응용 프로그램에 익숙 생물 시스템에 전문 지식을 확장하지만,하지 않은 연구자가 허용됩니다.

우리는 단일 세포의 세 차원 공 촛점 형광에서 가져 정의되지 않은 형태의 형태학의 변화를 측정하기 Imaris 신경 과학, ImarisXT 및 MATLAB을 사용하는 소프트웨어 플랫폼을 개발했습니다. 이 새로운 접근 방식은 수용체 활성화에 따라 세포 모양의 변화를 수량화하는 데 사용되므로 약물 발견을위한 가능한 추가 도구를 나타냅니다 할 수 있습니다.

형광 이미지를 측정하는 데 사용 가능한 가장 일반적인 소프트웨어 분석 도구들은 ...을 위한 수동 설정에 의존하는 2차원(2D) 데이터용입니다.

본 절차의 전반적인 목표는 3차원 공초점 형광 이미지에서 추출한 비정형 세포의 형태 변화를 분석하고 정량화하는 자동화된 방법을 제공하는 것입니다. 이를 위해 먼저 효능제 처리 세포, 길항제 처리 후 효능제 처리 세포, 그리고 무처리 세포를 포함하는 화학적 자극 실험을 수행합니다. 이후 세포를 면역형광 분석을 위해 준비합니다.두 번째 단계는 다분광 3차원 형광 이미지를 획득하는 것입니다. 그다음 ameris neuroscience, ameris XT 및 MATLAB 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 3차원 형태 분석을 수행합니다. 마지막 단계로, 3차원 형태 분석을 통해 시각화된 단일 세포의 표현형 변화를 분석하고 정량화합니다.궁극적으로 이 소프트웨어 플랫폼은 수용체 활성화에 따른 세포 형태의 변화를 정량화하는 데 사용되며, 이는 신약 개발을 위한 추가적인 도구를 제공합니다. 일반적으로 연구자들은 생물학적 시스템에 대한 표준 전문 지식을 갖추고 있지만, 컴퓨터 애플리케이션에는 익숙하지 않을 수 있습니다. 본 I 60 모듈 프로토콜에서는 이 절차를 시작하기 전에 시각화와 컴퓨터 언어 사이의 간극을 메워줍니다.서면 프로토콜에 명시된 대로, 헤마글루티닌(hemagglutinin) 태그가 붙은 부신피질자극호르몬 방출인자 수용체 2(corticotropin releasing factor receptor two) 또는 CRF R2를 인간 배아 신장 세포에 형질전환합니다. CRF R2는 G 단백질 결합 수용체(G protein coupled receptor) 또는 GPCR입니다. 형질전환 다음 날, 커버스립을 화염 멸균하여 6-웰 플레이트에 배치합니다.동결 건조된 polylysine 5 mg이 들어 있는 바이알에 PBS 10 milliliters를 추가하고 혼합합니다. 그다음, 용해된 polylysine 5 milliliters를 PBS 500 milliliters에 희석하고, 이 혼합액 2 milliliters를 각 커버슬립 위에 추가합니다. 커버슬립이 놓인 플레이트를 실온에서 20분 동안 둡니다. 20분 후, PBS 2 milliliters를 추가했다가 제거하는 방식으로 커버슬립을 세척하며, 이 과정을 두 번 반복합니다.10% FBS가 함유된 DMEM 배지 2 mL를 넣은 후, 커버슬립 위에 세포를 2~5방울 떨어뜨립니다. 세포는 60% 합류도(confluency)를 달성할 수 있는 적절한 농도여야 합니다. 다음 날.다음 날까지 세포를 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 효능제 처리를 위해 세포의 합류도가 60%인지 확인합니다. 1 µM 농도의 CRF R2 내인성 리간드인 corticotropin releasing factor가 첨가된 배지 2 mL로 배지를 교체하여 지정된 세포를 자극합니다.세포를 37 °C 인큐베이터에서 30분 동안 배양하여 길항제로 전처리합니다. 배지를 1 µM 농도의 선택적 CFR2 길항제 anti salvaging 30이 첨가된 배지 2 mL로 교체합니다. 세포를 37 °C 인큐베이터에서 30분 동안 배양합니다.길항제 처리 후, 처리하지 않은 세포의 경우 효능제 CRF로 세포를 자극하고 37°C에서 30분 동안 배양합니다. 처리 후에는 배지를 2 mL의 신선한 배지로 교체합니다.각 웰의 배지를 2 mL의 신선한 배지로 교체하고 37 °C에서 60분 동안 배양한 후, 1:1000으로 희석한 anti-HHA를 첨가합니다. 배지를 흡입하여 제거하고 각 웰에 고정액 2 mL를 추가합니다. 고정액을 흡입하여 제거한 후, 플레이트를 실온에서 20분 동안 배양합니다.tris buffered saline(TBS)으로 세포를 3회 세척합니다. 각 커버슬립 위에 100 µL의 블로킹 용액을 첨가하고 상온에서 30분 동안 배양합니다. 그 다음, 웰에서 기존의 블로킹 용액을 흡입하여 제거하고, 각 커버슬립에 100 µL의 신선한 2차 항체 칵테일을 첨가한 후 암실 상온에서 45분 동안 배양합니다. TBSC로 4회 세척하며, 이때 용액을 웰의 측벽을 통해 부드럽게 넣고 제거하며 세척하고 마지막 세척 용액이 남아있는 상태에서 종료합니다.바늘과 곡선 핀셋을 사용하여 각 커버슬립을 집어 올립니다. 벡터 쉴드(vector shield) 마운팅 용액 한 방울이 떨어져 있는 슬라이드 위에 커버슬립의 세포 면이 아래로 향하게 놓은 뒤, 매니큐어를 사용하여 고정하고 15분에서 20분 동안 건조시킵니다. CFR2를 시각화하기 위해 Alexa 488 nm 접합 마우스 항체를 사용하며, 핵의 유사분열 단계를 시각화하기 위해 DAPI를 사용합니다. 관찰을 시작하려면 고정된 세포를 형광 현미경에 마운팅합니다. 실험적 주관성을 제한하기 위해, 이미지를 획득하고 분석할 때까지 실험 조건을 알지 않은 상태로 유지하여 이미지를 획득합니다.63배 배율과 1.4 수치 구경을 갖는 plan acro mat 오일 DIC 대물렌즈를 coherent 통합 이광자 레이저 시스템에 연결된 zeis LSM five 10 meta 공초점 현미경과 함께 사용하였습니다. 데이터 획득 과정에서, 핵막부터 외부 세포외 수용체 말단까지의 데이터를 포함하도록 멀티채널 및 c 분할을 통해 세포를 구획화합니다. 3D 현미경 데이터셋의 시각화 및 세분화가 가능한 amris를 사용하여 형광 데이터를 처리합니다. Amaris에서 설계한 알고리즘에 따라, 먼저 표면 렌더링을 활용하여 NU 핵막을 나타냅니다.Amaris는 관심 영역(ROI) 내에 핵이 하나 이상 존재하는지 판단합니다. 다음으로 스팟 생성 알고리즘을 사용하여 CFR two 확장 스팟의 위치를 찾습니다. 무정형 세포들의 복잡한 네트워크에서 발생하는 배경 노이즈와 불규칙한 강도를 보정하여 CFR two의 각 형광 검출 단위를 최대한 포함할 수 있도록, 스팟 직경을 이미지 내 최소 단위인 0.2 micrometers로 설정합니다.이를 통해 측정된 강도 형태의 뚜렷한 정보를 외삽할 수 있습니다. 가우시안 필터를 사용하여 스팟의 자동 생성 과정에 스팟 필터링을 통합하십시오. 데이터 손실을 방지하려면 데이터 세트를 8비트 고정 소수점에서 32비트 부동 소수점으로 변환하십시오.생성된 표면을 선택하고, 핵막을 기준점으로 하여 거리 변환(distance transformation)을 수행함으로써 핵 표면 외부의 각 스팟에 대한 정확한 공간적 위치를 결정합니다. MATLAB과 인터페이스된 ameris XT 모듈을 사용하여 복셀 강도 데이터를 스팟 좌표 데이터로 변환합니다. 스팟을 선택하고 통계 유형에서 통계 코딩을 선택합니다.새로 생성된 채널에서 보고된 강도 중심(intensity center)을 선택하십시오. 디스플레이에 사용할 원하는 색상을 로드하고 분석을 위한 컬러 맵 범위를 설정하십시오. 수치 데이터는 통계 탭에서 시각화할 수 있으며, GraphPad prism을 사용하여 excel로 내보낼 수 있습니다.결과 데이터를 정량화하고 통계 분석을 위해 그래프 형식으로 제시합니다. 이원 분산 분석(two-way ANOVA)과 Bonferroni 사후 검정을 사용하여 그룹 간 비교를 수행하며, 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시합니다. 이 접근법의 효용성을 입증하기 위해, G-단백질 결합 수용체와 부신피질 자극 호르몬 방출 인자 수용체 2가 내인성 리간드인 CRF와 상호작용하여 발생하는 세포 변화를 보여줍니다.형질전환된 HT K 2 93 세포에서 정량화된 병합 이미지는 Alexa 4 88 접합 항마우스 2차 항체와 핵 시각화를 위한 DPI를 사용하여 시각화되었습니다. 결과에 따르면 CRF R two 수용체는 세포의 형질막에 위치하며 막의 한정된 영역으로부터 돌출되어 있음을 알 수 있습니다. 일반적인 2D 분석을 사용할 경우, 유리 커버 위의 수용체 부착 지점을 분석해야만 이러한 세포외 CRF R two 수용체 하위 집합을 검출할 수 있습니다.결과적으로, ZS 적층 다중 스펙트럼(MULTISPECTRAL) 데이터에서 도출된 다른 모든 정보는 소실됩니다. 그 결과 무처리군과 작용제 처리군 사이에 차이가 없는 것으로 나타났습니다. 세포에 CRF를 처리했을 때 수용체 부착 지점은 극적으로 달라지지만, 세포막으로부터의 점 간 거리가 감소하는 것으로 보아 세포외 수용체는 크게 감소했음을 알 수 있습니다.또한 이들은 주로 한정된 위치에서 여러 개의 개별적인 위치로 재분포됩니다. 수용체 막 분포에 미치는 CRF의 효과는 CR2 특이적 길항제를 전처치함으로써 방지됩니다. 30 30.이러한 조건에서, CRFR의 두 연장 부위는 CRF 처리로 인해 변화하지 않습니다. 5 µm 스펙트럼 색상 코딩 간격으로 도식화된 점들의 원위 분포를 활용하여 핵막으로부터 복셀의 거리를 시각화합니다. 무처리군과 작용제 처리 전 길항제 전처리군은 GPCR 수축에서 유의미한 차이를 보이지 않았습니다.효능제 CRF로 세포를 처리하면, 무처리군 또는 길항제 As로 전처리한 세포와 비교했을 때 CRF2를 포함하는 복셀의 수가 점진적으로 감소합니다. 이러한 기술은 정량 영상 기술 분야의 연구자들이 수많은 단일 세포 표현형 변화를 탐색하고 특성화할 수 있는 길을 열어주었으며, 이 세포 기반 분석법을 신약 개발 과정의 추가적인 단일 세포 프로파일링 도구로 만들어 주었습니다.

an-analytical-tool-that-quantifies-cellular-morphology-changes-from

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

형광 표지 된 세포의 다중 이미지 기반 분석을 가능하게하는 유연한 정보학 워크 플로우입니다 발표. 워크 플로는 핵 및 세포질 마커를 정량화하고 이러한 구획 사이에 마커 전위를 계산한다. 절차 96- 웰 포맷으로 간접 면역 형광에 의해 마커 검출 용 siRNA를 안정적인 방법을 사용하여 세포의 섭동 제공된다.

높은 콘텐츠, 오픈 소스 소프트웨어에 의해 지원되는 범용 현미경 데이터에서 형광 마커, 개별 셀 정량화를위한​​ 워크 플로우

포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 촬상 실시간 세포 생물학 연구를위한 강력한 도구이다. 여기서, 종래의 표면 형광 현미경을 사용하여 생리적 3 차원 히드로 겔 미세 환경에서 FRET 촬상 세포위한 방법이 제시된다. 활성 범위에 걸쳐 선형 비율을 산출 비율 적 FRET 프로브에 대한 분석을 설명한다.

3 차원 히드로 겔의 이미지를 FRET

이 원고 시각화 및 subcellular 구획에서 지역화 된 번역 이벤트를 계량 하는 방법을 설명 합니다. 이 원고에 제안 접근 기본 confocal 이미징 시스템 및 시 약을 필요로 하 고 신속 하 고 비용 효율적인.

정량적 면역 형광 측정 글로벌 현지화 번역

Microglia 두뇌 면역 세포를 조사 하 고 양적 평가 될 수 있는 형태 론 적 변화를 통해 변경 된 두뇌 생리학에 반응 하는. 이 프로토콜 개요는 ImageJ 셀 분파, 복잡성, 모양 등 통계에 따라 연속 데이터 microglia 형태를 나타내는 분석 프로토콜을 기반으로 합니다.

Microglia 형태학 Immunohistochemistry 조직 ImageJ를 사용 하 여 준비의 Photomicrographs에서 측정

이 문서는 단백질 세포 외 지역화 역학을 조사하고 바실러스 subtilis 및 황색 포도상 구균에 있는 고분해능 형광 현미경 검사법을 사용하여 형태학적 인 변화를 감시하기 위하여 단계별 가이드를 제공합니다.

박테리아의 세포 외 단백질 국소화 및 세포 형태 변화를 조사하는 살아있는 세포 형광 현미경 검사법

이 연구는 자유롭게 사용할 수있는 이미지 처리 도구를 사용하여 C. elegans에서 시냅스 크기와 현지화, 근육 형태 및 미토콘드리아 모양의 정량적 측정을 설명합니다. 이 접근은 C. elegans에 있는 미래 연구 결과가 유전 돌연변이 결과로 조직과 세포기관 구조 변경의 넓이를 정량적으로 비교하는 것을 허용합니다.

예쁜꼬마선충의 세포구조와 세포세포형태를 연구하기 위한 정량적 접근법

이 프로토콜은 살아있는 3차원 이미징을 위해 세균 샘플을 준비하고 장착하는 방법과 이러한 이미지에서 대장균의 3차원 모양을 재구성하는 방법을 설명합니다.

정확한 세포 표현과 정확한 단백질 국소화를 위한 세균 세포의 3차원 이미징

여기에 제시된 스페로이드 이미징 장치의 제조를 위한 프로토콜이 있습니다. 이 장치는 암 세포 스페로이드의 동적 또는 세로 형광 이미징을 가능하게합니다. 이 프로토콜은 또한 암세포 침입의 분석을 위한 간단한 화상 처리 절차를 제공합니다.

3D 스페로이드 모델에서 암세포 침입의 시간 해결 형광 화상 진찰 및 분석

여기에서는 시간 경과에 따른 미토콘드리아 분열 및 융합 활동의 3차원 변화를 정량화하는 데 유용한 ImageJ 플러그인인 미토콘드리아 이벤트 로컬라이저(MEL)를 설명합니다. 또한 ImageJ에서 분석하기 전에 현미경 사진을 정리하는 데 유용한 이미지 처리 파이프라인에 대해서도 설명합니다.

동적 및 3차원 형광 현미경 사진을 통한 미토콘드리아 형태의 변화 이해

다차원 현미경 데이터를 정확하게 분석하려면 복잡한 워크플로가 필요합니다. 이 문서에서는 소프트웨어 Cell-ACDC를 사용하는 방법을 보여줍니다. 현미경 데이터의 세분화, 추적, 세포 혈통 분석 및 정량화를 위해 최첨단 AI 기반 모델을 활용합니다. 결정적으로, 모델 출력의 반자동 수정을 위한 혁신적인 프레임워크로 이러한 모델을 보완합니다.

Cell-ACDC를 사용한 다차원 현미경 데이터 분석

배우세요 3차원 형광 이미지에서 비정형 세포의 형태학적 변화를 자동 분석하고 정량화하는 방법을. Imaris와 MATLAB을 활용한 이 기술은 신경과학 및 약물 발견 연구에 활용됩니다.

3 차원 형광 이미지에서 세포 형태학의 변경 사항 단정 지을 분석 도구

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