미세 유체 공동 문화 장치를 사용하여 치아 세균 신경 분포를 개발 분석

이 실험 절차의 전반적인 목표는 발달 중인 삼차신경절과 치배를 분리하고 공배양하는 방법을 보여주는 것입니다. 이는 먼저 미세유체 장치를 멸균, 장착 및 코팅함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 관심 대상인 마우스의 특정 발달 단계에서 삼차신경절과 치배를 적출하는 것입니다.

다음으로, 삼차신경절과 치배를 미세유체 장치에 넣고 공동 배양합니다. 마지막 단계는 세포를 고정하고 면역형광법을 사용하여 염색하는 것입니다. 최종적으로, 현미경을 통해 공동 배양의 결과로 나타난 신경 분포 패턴을 확인합니다.

기존의 일반적인 공배양과 같은 방법들에 비해 이 기술이 가진 주요 장점은, 각 장기와 조직을 각각의 최적 배양 배지에서 공배양할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 치아 혁신에 미치는 다양한 분자의 역할이나 치아 발달 과정에서 혁신의 규칙과 같이 인공 혁신 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 먼저 미세 해부 핀셋 한 쌍과 가위 한 쌍을 포함한 해부 도구들을 오토클레이브로 멸균하며 시작하십시오.

다음으로, 24 mm x 24 mm 크기의 유리 커버슬립 한 배치를 1 M 염산 용액에 넣고 37 °C의 궤도 셰이커에서 24시간 동안 처리하여 멸균합니다. 그 후 커버슬립을 멸균 증류수로 3회 세척하고, 99% 에탄올로 3회 헹굽니다. 멸균 플로우 후드 내에서 커버슬립을 건조시킨 뒤, 건조가 완료되면 후드의 UV 램프를 30분 동안 켭니다. 이후 커버슬립을 사용할 때까지 70% 에탄올에 보관합니다.

다음으로, 멸균 집게를 사용하여 패키지에서 축삭 분리 미세유체 장치를 조심스럽게 꺼내고, 1 mm 멸균 생검 펀치를 사용하여 멸균 페트리 접시에 놓습니다. 배양 챔버의 위치에 맞춰 각 샘플당 장치에 하나의 구멍을 뚫습니다.

압력으로 인해 마이크로 홈(micro grooves)이 손상될 수 있으므로 홈에 너무 가까이 펀칭하지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 장치들을 70% ethanol에 담가 멸균하십시오. 이때 내부에 갇힌 공기를 모두 제거하는 것에 유의하십시오.

그런 다음 에탄올에서 장치들을 꺼내 멸균 flow hood 아래에서 완전히 건조합니다. 또한, 70% 에탄올 용액에서 커버 슬립을 꺼내 멸균 flow hood 아래에서 건조시킵니다. 다음 단계로 진행하기 전 최소 3시간 동안 기다립니다.

각 커버슬립을 6-웰 플레이트의 웰에 넣습니다. 그런 다음 마이크로유체 장치를 커버슬립 위에 올리고, 분리 장치와 유리 커버슬립 사이에 완전히 밀착되도록 핀셋으로 부드럽지만 단단하게 누릅니다. 다음으로, 각 배양 챔버에 0.1 mg/mL poly-D-lysine 150 µL를 피펫으로 분주합니다.

그 후, 챔버 내의 모든 공기를 제거하기 위해 미세유체 장치를 5분 동안 진공 상태로 둡니다. 만약 챔버 내에 여전히 공기가 보인다면, 폴리 D 라이신(poly D lysine) 용액을 챔버에 다시 주입하십시오.

장치를 poly-D-lysine과 함께 37 °C에서 하룻밤 동안 배양한 후, 다음 날 멸균 증류수로 챔버를 세 번 세척하고, 5 µg/mL 농도의 lamin 작업 용액 150 µL를 챔버에 채워 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 이어서, 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 삼차신경절 및 치배 배양을 위한 배지를 준비합니다.

에탄올 70%로 해부 구역과 실체 현미경을 세척하고, 희생 후 해부 도구를 배치합니다. 배아 단계가 E 14.5에서 E 17.5인 임신한 마우스의 하복부 주변 피부를 절개합니다. 그런 다음 가위를 사용하여 복부를 조심스럽게 엽니다.

자궁의 위치를 확인하여 제거한 후, 얼음이 채워진 튜브에 넣습니다. 차가운 PBS를 사용하여 배아를 박리하고, 얼음처럼 차가운 PBS가 채워진 새로운 페트리 접시에 각각 하나씩 옮깁니다. 모든 배아가 배아 외 조직에서 제거되면, 가위를 사용하여 머리 부분을 절단합니다.

미세 해부 가위를 사용하여 삼차신경절이 손상되지 않도록 주의하며 하악골을 머리의 나머지 부분에서 분리합니다. 다음으로, 머리를 냉각된 해부용 유리 페트리 접시에 놓습니다. 핀셋을 사용하여 피부와 두개골을 제거합니다.

그 다음 핀셋을 두부(cephalon) 아래에 배치하고 들어 올립니다. 두부와 소뇌를 제거하려면 삼차신경절(trigeminal ganglia)의 위치를 확인하고, 핀셋과 해부용 바늘을 사용하여 삼차신경절을 삼차신경에서 분리한 후 신경절을 세척합니다. 해부용 바늘을 칼처럼 사용하여 이들을 차가운 PBS에 보존하십시오.

혀와 턱 주변의 피부를 제거합니다. 턱의 중앙선을 따라 절개하여 좌우 반턱을 분리합니다. 그런 다음 치배(tooth germs)의 위치를 확인하고 해부용 바늘을 사용하여 분리합니다. 삼차신경절과 치배를 해부한 후, 미세유체 장치에서 라미닌을 제거하고 각 챔버에 해당 배지 200 µL를 채웁니다.

포셉을 사용하여 해부된 삼차신경절과 치배를 바이옵시 펀치로 만든 구멍 안으로 조심스럽게 옮깁니다. 이때 치배가 떠 있지 않고 커버슬립에 닿을 때까지 가라앉았는지 확인하십시오. 샘플을 37°C, 5% CO₂ 조건의 인큐베이터에서 배양합니다.

배지를 교체하기 위해 10일 동안 48시간마다 배양액을 갈아줍니다. 먼저, 피펫을 웰의 외부 방향으로 향하게 하여 배지를 제거합니다. 그다음, 배양 기간 동안 챔버 반대편에 위치한 웰의 측면에 미리 데워둔 신선한 배지를 추가합니다.

광학 현미경을 사용하여 언제든지 공배양 세포를 이미지화하십시오. 배양 기간이 끝나면 각 챔버의 웰당 150 µL의 PBS를 피펫팅하여 주입하고, PBS가 챔버를 통해 흐르게 하여 챔버를 세척하십시오. 마지막 세척 후 총 3회 세척을 반복하십시오.

PBS를 제거하고, 챔버당 한쪽 웰에 4% paraformaldehyde/PBS 150 µL를 피펫팅하여 다른 챔버로 흐르게 함으로써 샘플을 고정합니다. 장치를 상온에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 챔버를 PBS로 두 번 세척하고, 면역형광 염색 및 성장을 통한 이미징과 같은 추가 분석을 진행합니다.

공배양 동안, 삼차신경절의 신경돌기들이 배양 구획에서 뻗어 나와 발달 중인 치배를 향해 연장됩니다. 고배율로 관찰하면 신경돌기들이 미세유체 장치의 축삭 챔버와 미세 홈을 통해 연장되는 것을 확인할 수 있습니다. 신경 성장의 진행 과정을 시간에 따라 추적하여 신경의 발달 과정을 설명할 수 있습니다.

이 절차 이후에는, 예를 들어 혁신 이후 표적 조직에서의 유전자 발현 또는 단백질 분비의 변화를 연구하기 위해 RNA 또는 단백질 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.