미세 유체 공동 문화 장치를 사용하여 치아 세균 신경 분포를 개발 분석

이 절차의 전반적인 목표는 발달 중인 삼차신경절과 치아 세균을 분리하고 공동 배양하는 방법을 보여주는 것입니다. 이것은 먼저 미세유체 장치를 살균, 장착 및 코팅함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 관심 마우스의 특정 발달 단계에서 삼차신경절과 치아 세균을 해부

다음으로, 삼차신경절(trigeminal ganglia)과 치아 세균(dental germs)을 미세유체 장치에 넣고 공동 배양합니다. 마지막 단계는 세포를 고정하고 면역형광을 사용하여 염색하는 것입니다. 궁극적으로 현미경은 공동 배양의 결과인 신경 분포 패턴을 보여주는 데 사용됩니다.

종래의 공동 배양과 같은 기존 방법의 이 기술의 주요 장점은 이 방법을 통해 서로 다른 장기 및 조직의 공동 배양을 각각 최적의 배양으로 할 수 있다는 것입니다. 보통. 이 방법은 치아 혁신에 대한 다양한 분자의 역할 및 치아 발달에서의 혁신 규칙과 같은 인공 혁신 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 한 쌍의 현저해부 겸자와 한 쌍의 가위를 포함하는 해부 도구를 고압멸균하는 것으로 시작합니다.

다음으로, 24mm x 24mm 유리 커버 슬립 배치를 섭씨 37도의 궤도 셰이커에 1몰 염산 용액에 넣어 24시간 동안 살균합니다. 그런 다음 멸균 증류수로 커버 슬립을 세 번 씻은 다음 99% 에탄올로 세 번 헹구고 건조되면 멸균 흐름 후드에서 건조시키고 후드 UV 광선을 30분 동안 켭니다. 그런 다음 필요할 때까지 커버 슬립을 70% 에탄올에 보관하십시오.

다음으로, 멸균 집게를 사용하여 포장에서 축삭 분리 미세유체 장치를 조심스럽게 제거하고 멸균 1mm 생검 펀치를 사용하여 멸균 페트리 접시에 넣습니다. 각 샘플에 대해 장치에 하나의 구멍을 만듭니다. 문화실에 대응하여.

마이크로 홈은 압력에 의해 손상될 수 있으므로 너무 가까이 펀칭하지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 70% 에탄올로 장치를 출현시켜 살균합니다. 갇힌 공기를 모두 제거하도록 주의하십시오.

그런 다음 에탄올에서 장치를 제거하고 멸균 흐름 후드 아래에서 완전히 건조시킵니다. 또한 70% 에탄올 용액에서 커버 슬립을 제거하고 멸균 흐름 후드 아래에서 건조시킵니다. 계속하기 전에 최소 3시간을 기다립니다.

각 덮개 슬립을 6개의 웰 플레이트 내의 우물에 넣습니다. 그런 다음 미세유체 장치를 커버 슬립에 놓고 집게로 부드럽지만 단단히 눌러 절연 장치와 유리 커버 슬립 사이에 완전한 접착이 되도록 합니다. 다음으로, 밀리리터당 0.1mg의 150마이크로리터를 폴리D 라이신을 각 배양실에 피펫팅합니다.

그런 다음 챔버에서 모든 공기를 제거하기 위해 5분 동안 미세유체 장치를 진공 상태에서 놓습니다. 챔버 내에서 여전히 공기를 볼 수 있는 경우. 폴리 D 라이신 용액을 챔버에 반복하십시오.

다음날 섭씨 37도에서 밤새 poly de lysine으로 장치를 배양하십시오. 멸균 증류수로 챔버를 세 번 세척한 다음 챔버에 밀리리터당 5마이크로그램의 150마이크로리터, 라민 작업 용액을 채우고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 다음으로, 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 삼차신경절 및 치아 세균 배양을 위한 배지를 복구합니다.

해부 영역과 입체경을 에탄올 70%로 청소하고 희생 후 해부 기구를 놓습니다. E 14.5 - E 17.5기 마우스 배아를 가진 임신한 마우스의 하복부 주변 피부를 절개합니다. 그런 다음 가위를 사용하여 복부를 조심스럽게 엽니다.

자궁을 찾아 제거한 다음 얼음이 채워진 튜브에 넣습니다. Cold PBS는 배아를 해부하고 얼음처럼 차가운 PBS로 채워진 새로운 페트리 접시에 개별적으로 넣습니다. 여분의 배아 조직에서 모든 배아를 제거했으면 가위를 사용하여 배아의 목을 베십시오.

삼차신경절이 손상되지 않도록 주의하면서 미세 해부, 가위를 사용하여 아래턱을 머리의 나머지 부분과 분리합니다. 다음으로, 머리를 가져다가 식힌 해부 유리 페트리 접시에 놓습니다. 집게를 사용하여 피부와 두개골을 제거합니다.

그런 다음 두부 아래에 집게를 놓고 들어 올립니다. 두부와 소뇌를 제거하려면 삼차신경절(trigeminal ganglia)을 국소화하고 겸자와 해부 바늘을 사용하여 삼차신경절(trigeminal ganglia)을 삼차신경절(trigeminal ganglia)에서 분리하고 신경절을 청소합니다. 해부 바늘을 칼로 사용하여 차가운 PBS에 보관하십시오.

혀와 턱을 둘러싼 피부를 제거합니다. 턱의 정중선을 따라 절단하여 왼쪽과 오른쪽 반턱을 분리합니다. 그런 다음 치아 세균을 찾아 삼차신경절과 치아 세균을 해부한 후 해부 바늘을 사용하여 분리하고 미세유체 장치에서 라미닌을 제거하고 챔버를 각 매체 200마이크로리터로 채웁니다.

집게를 사용하여 절개된 삼차신경절과 치아 세균을 생검 펀치로 만든 구멍으로 부드럽게 옮깁니다. 치아 세균이 뜨지 않고 덮개에 닿을 때까지 가라앉는지 확인하십시오. 배양, 섭씨 37도의 인큐베이터에서 시료 및 5%의 이산화탄소.

배지를 변경하려면 10일 동안 48시간마다 배양 배지를 교체하십시오. 먼저 피펫이 웰의 바깥쪽을 향하도록 하여 매체를 제거합니다. 그런 다음 배양 기간 동안 챔버 맞은편에 위치한 웰 측면에 신선한 예열 배지를 추가합니다.

광학 현미경을 사용하여 언제든지 공동 배양을 이미지화할 수 있습니다. 배양 기간이 끝나면 150마이크로리터의 PBS를 챔버당 하나의 웰에 피펫팅하고 PBS가 챔버를 통해 흐르도록 하여 챔버를 세척합니다. 마지막 세탁 후 총 3회 세탁을 반복합니다.

PBS를 제거하고 PBS에 있는 150마이크로리터의 4% 파라폼 알데히드를 챔버당 하나의 웰에 피펫팅하고 다른 챔버로 흐르게 하여 샘플을 고정합니다. 장치를 실온에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 PBS로 챔버를 두 번 세척하고 면역형광 염색 및 파생물 이미징과 같은 추가 분석을 진행합니다.

석탄 배양 동안, 삼차신경절(trigeminal ganglia)의 신경돌기는 배양 구획에서 갈라져 나와 발달 중인 치아 세균으로 뻗어 나갑니다. 더 높은 배율에서는 축삭 챔버를 통해 확장되는 신경돌기와 미세유체 장치의 미세 홈을 볼 수 있습니다. 신경 성장의 진행 상황은 혁신 개발을 설명하기 위해 시간이 지남에 따라 추적될 수 있습니다.

이 절차에 따라 RNA 또는 PROTEINIZATION과 같은 다른 방법을 수행하여 예를 들어 혁신 후 표적 조직에서 유전자 발현 또는 단백질 분비의 변화를 연구할 수 있습니다.