에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

Evans Blue Dye 및 Fitzy Dextrin 일반 추기경 정맥 주사의 전반적인 목표는 살아있는 제브라피시의 골격근막 무결성을 관찰하여 근이영양증의 다양한 하위 유형과 관련된 질병 유발 메커니즘을 특성화하는 데 도움이 되는 것입니다. Evan의 파란색 염료 주입은 근이영양증에 대한 동물 모델을 특성화할 때 질병 병리학에 기여하는 생물학적 메커니즘을 밝히는 데 도움이 될 수 있으며, 질병 치료를 위한 잠재적인 치료 메커니즘에 대한 이해에도 기여할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 살아있는 제브라피시를 사용하여 수행 및 분석할 수 있다는 것입니다.

또한 Fitz Dextrin의 co 주사는 성공적인 주사를 위한 품질 관리를 보여 주어 엄격함과 정량화를 향상시킵니다. 이 기술의 의미는 근육 질환에 대한 제브라피시 모델의 검증에 대한 유용성과 관련이 있습니다. 또한 특정 돌연변이가 어떻게 근이영양증(muscular dystrophy)과 같은 근육 질환 표현형으로 이어지는지에 대한 이해를 높이며, 이는 치료법과 치료법을 찾는 데 중요합니다.

한천 주입 플레이트를 준비하려면 E 3 매체에서 2-3 % aros를 끓이고 용액을 벤치에서 약간 식히십시오. 냉각된 아그로스 약 35ml를 각 100mm 접시에 붓습니다. 그런 다음 나머지 금형을 농업 용액에 놓기 전에 선호하는 사출 금형의 한쪽 끝을 용액에 놓습니다.

농업 용액이 실온 또는 섭씨 4도에서 약 30분 동안 응고되도록 합니다. 그런 다음 주걱을 사용하여 곰팡이의 한쪽 끝을 단단한 아그로스에서 분리하고 나머지 곰팡이를 천천히 제거합니다. 하나의 x 링거 용액에 Evan's Blue Dye 또는 EBD의 1% 재고를 만드십시오.

그런 다음 하나의 x 링거 용액에 Fitzy Dextrin의 원액을 준비하고 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 주입 혼합물을 만들려면 Fitz Dextrin 원액에서 EBD를 0.1%로 직접 희석하고 주입 혼합물을 철저히 와류에 넣고 주입하기 전에 알루미늄 호일을 사용하여 튜브를 감싸서 직사광선을 피하십시오. 주입 플레이트를 실온으로 예열합니다.

금속판에 마이크로 매니퓰레이터를 놓고 주입 현미경 옆에 서 있습니다. 공기 구동 마이크로 분사 컨트롤러를 켭니다. 그런 다음 약 2-4 마이크로 리터의 EBD 혼합물로 주사 바늘을 다시 채 웁니다.

다음으로, 약 5나노리터의 EBD 혼합물로 주입량을 보정합니다. 그런 다음 하나의 x 링거 용액을 사용하여 주입 플레이트를 적시고 웰에서 과도한 용액을 제거하고 유리 피펫으로 주입하기 전에 유충을 완전히 고정시키기 위해 하나의 x 링거 용액에 희석된 0.04% 트리카로 유충을 전처리합니다. 마취된 유충을 오거 주입판의 우물에 넣고 유충이 옆으로 누워 있는 우물에 완전히 있는지 확인합니다.

우물 내에서 유충의 이동을 최소화하기 위해 과도한 trica 용액을 제거하되 탈수를 방지할 수 있을 만큼 충분히 남겨 두십시오. 유충의 주사 플레이트를 해부 내시경에 놓고 EBD가 들어 있는 주사 피펫 바늘을 배치합니다. 제브라피시 유충을 심장 근처와 전방 후축에서 약 45도 떨어진 곳에 섞습니다.

정맥이 처음에 등쪽 방향으로 회전하는 난황의 앞쪽 부분 근처의 총추기경 정맥 또는 CCV에 주사 바늘을 삽입합니다. 다음으로, 5나노리터의 EBD 믹스를 주입하고 주사 바늘을 5-8초 동안 제자리에 유지합니다. EBD 믹스의 즉각적인 누출을 최소화하기 위해 잘 주입하면 심실에 염료가 나타나며 반복할 수 있습니다.

성공적인 주사 직후 EB DMX가 심장에서 보이지 않으면 배아는 다음과 같이 혈관 구조에 Fitz Dextrin을 축적합니다. 원하는 수의 유충을 주입한 후 유충을 100mm 접시에 trica가 없는 하나의 x ringer 용액으로 되돌려 생존율을 높이고 신호 강도를 유지합니다. 접시를 알루미늄 호일로 싸서 보관하십시오.

효율적인 EBD 흡수를 보장하기 위해 섭씨 28.5도에서 4-6시간 동안 유충을 배양합니다. 근육의 EBD를 시각화하려면 0.04%trica를 사용하여 유충을 마취한 후 적색 형광 아래에서 유충을 관찰합니다. EBD는 여기와 같이 심실을 채운 3D PF 주사에서 Sapia 동종 돌연변이와 야생형 형제의 CCV에 주입된 후 녹색 형광 하에서 혈관 구조의 fitzy dextrin을 시각화하여 성공적인 다이 관류를 위해 분석되었습니다.

4시간의 배양 기간 후, EBD 흡수는 이 그림과 같이 Soo Mite 수준에서 검사되었습니다. 야생형 형제자매는 눈에 보이는 근육 섬유 내에서 EBD 형광을 나타내지 않은 반면, 사피아 동형접합 돌연변이는 근육막의 손상을 나타내는 EBD 흡수를 보였습니다. 제브라피쉬의 일반적인 추기경 정맥에 능숙한 Evans blue 염료 주입이 완료되면 주입되는 유충의 수에 따라 30-60분 이내에 유충을 완료할 수 있습니다.

또한 숙련도를 보장하기 위해 하루 만에 실험 결과를 얻을 수 있습니다. 일관되고 해석 가능한 결과를 생성하기 위해 기본 정맥을 신중하게 조준하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이것은 어려울 수 있으며 이 절차에 따라 연습이 필요할 수 있습니다.

관련된 막 손상의 원인이 되는 분자 메커니즘을 결정하기 위해 화학적 및 유전자 검사와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이러한 실험은 근육 질환 발병 후 근육 질환에 대한 새로운 치료 전략을 수립하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 근육 질환 연구 분야의 연구자들이 근이영양증의 제브라피시 모델에서 멤브레인 무결성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 제브라피시 유충의 일반적인 기본 정맥에 Evan의 파란색 염료를 주입하는 방법을 철저히 이해하게 될 것입니다. 또한 섬유 내에 Evan의 파란색 염료가 존재하기 때문에 막 손상이 있는 근육 섬유를 식별하는 방법을 이해해야 합니다.