에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

Evans Blue Dye 및 Fitzy Dextran의 일반적인 추세정맥 주입의 전반적인 목표는 살아있는 제브라피쉬의 골격근 막 무결성을 관찰하여 다양한 아형의 근이영양증과 관련된 질병 유발 기전을 규명하는 것입니다. Evans Blue dye 주입은 근이영양증 동물 모델의 특성을 분석할 때 질병 병리에 기여하는 생물학적 기전을 밝히는 데 도움이 되며, 질병 치료를 위한 잠재적인 치료 기전에 대한 이해를 높이는 데에도 기여할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 살아있는 제브라피쉬를 사용하여 수행하고 분석할 수 있다는 점입니다.

또한, Fitz Dextrin을 함께 주입하여 주입이 성공적으로 이루어졌는지에 대한 품질 관리를 수행함으로써 엄격성과 정량화를 향상시킵니다. 이 기술의 함의는 근육 질환 제브라피시 모델의 검증 유용성과 관련이 있습니다. 또한 이는 근이영양증과 같은 특정 돌연변이가 어떻게 근육 질환 표현형으로 이어지는지에 대한 이해를 높이며, 이는 치료법 및 완치법을 찾는 데 매우 중요합니다.

한천 주입 플레이트를 준비하려면 2~3% 농도의 한천을 E3 배지에서 끓인 후, 벤치 위에서 용액을 약간 식힙니다. 식힌 한천 용액을 100mm 디시에 약 35mL씩 붓습니다. 그다음, 선호하는 주입 몰드의 한쪽 끝을 용액에 먼저 넣고, 몰드의 나머지 부분을 한천 용액 위에 올립니다.

아그로 용액을 실온 또는 4°C에서 약 30분 동안 굳힙니다. 그 후 스패튤라를 사용하여 몰드의 한쪽 끝을 굳은 아그로에서 분리하고 나머지 몰드를 천천히 제거합니다. 1x 링거 용액(ringer solution)에 1% 농도의 에반스 블루 염료(Evan's Blue Dye 또는 EBD) 스톡 용액을 만듭니다.

그런 다음 1x ringer 용액으로 Fitzy Dextrin 표준 용액을 준비하여 -20 °C에서 보관하십시오. 주입 혼합액을 만들기 위해 Fitz Dextrin 표준 용액에 EBD를 0.1%가 되도록 직접 희석하십시오. 주입 혼합액을 충분히 볼텍스하고, 주입 전 알루미늄 호일로 튜브를 감싸 직사광선을 차단하십시오. 주입 플레이트를 실온으로 미리 데워 두십시오.

마이크로 조절기(micro manipulator)를 금속판 위에 배치하고 주입 현미경 옆에 세웁니다. 공압식 마이크로 주입 제어기를 켭니다. 그런 다음 약 2~4 µL의 EBD 혼합물을 사용하여 주입 바늘을 역충전합니다.

다음으로, 약 5 nL의 EBD 혼합액을 사용하여 주입량을 교정합니다. 그 후 1x ringer 용액을 사용하여 주입 플레이트를 적시고 웰에서 과잉 용액을 제거합니다. 유리 피펫으로 주입하기 전, 1x ringer 용액에 희석한 0.04% trica로 유충을 전처리하여 완전히 마취시킵니다. 마취된 유충을 오거(auger) 주입 플레이트의 웰에 넣고, 유충이 옆으로 누운 상태로 웰 안에 완전히 들어가도록 합니다.

웰 내에서 치어의 움직임을 최소화하기 위해 과잉의 trica 용액을 제거하되, 탈수를 방지할 수 있을 만큼의 양은 남겨둡니다. 치어가 담긴 주입 플레이트를 해부 현미경 위에 올리고 EBD가 들어 있는 주입 피펫 바늘을 위치시킵니다. 심장 근처이며 전후축에서 약 45도 각도가 되는 지점에서 제브라피쉬 치어에게 혼합물을 주입합니다.

주입 바늘을 난황의 앞부분 근처에서 정맥이 처음으로 등쪽 방향으로 꺾이는 총심장정맥(common cardinal vein, CCV)에 삽입합니다. 다음으로, 5 nL의 EBD 혼합물을 주입하고 주입 바늘을 5~8초 동안 그대로 유지합니다. EBD 혼합물이 즉시 유출되는 것을 최소화해야 하며, 주입이 잘 되었다면 심장실 내에 염료가 보일 것이고, 필요시 이를 반복할 수 있습니다.

성공적인 주입 직후 심장에서 EB DMX가 보이지 않는다면, 여기에서 보는 바와 같이 배아의 혈관계에 Fitz Dextrin이 축적될 것입니다. 원하는 수의 치어가 주입된 후, 생존율을 높이고 신호 강도를 유지하기 위해 치어를 trica가 없는 1x ringer solution이 담긴 100 mm 디쉬로 옮기십시오. 디쉬는 알루미늄 호일로 감싸서 보관하십시오.

효율적인 EBD 흡수를 위해 유충을 28.5 °C에서 4~6시간 동안 배양합니다. 근육 내 EBD를 시각화하려면 0.04% trica로 유충을 마취시킨 후 적색 형광 하에서 유충을 관찰하십시오. Sapia 동형 접합 돌연변이체와 야생형 형제들의 CCV에 EBD를 주입하였습니다. 3D PF 단계에서 여기에서 보는 바와 같이 심실을 채우도록 주입하였으며, 이후 녹색 형광 하에서 혈관계의 fitzy dextrin을 시각화하여 염료 관류가 성공적으로 이루어졌는지 분석하였습니다.

4시간의 배양 기간 후, 이 그림에 표시된 것과 같이 소절(somite) 수준에서 EBD 흡수를 조사하였습니다. 야생형 형제들은 가시적인 근섬유 내에서 EBD 형광이 나타나지 않은 반면, sapia 동형 접합 돌연변이체는 근육막의 손상을 나타내는 EBD 흡수를 보였습니다. 제브라피쉬의 공통 심장정맥으로의 Evans blue dye 주입 기법에 숙달되면, 주입하는 치어의 수에 따라 30분에서 60분 이내에 치어들에 대한 처리를 완료할 수 있습니다.

또한, 숙련도를 보장하기 위해 단 하루 만에 실험 결과를 얻을 수 있습니다. 일관되고 해석 가능한 결과를 생성하기 위해서는 심장 정맥(cardinal vein)을 정확하게 겨냥하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이는 어려울 수 있으며, 본 절차를 수행함에 있어 연습이 필요할 가능성이 높습니다.

근이영양증과 관련된 막 손상을 일으키는 분자적 기전을 규명하기 위해 화학적 및 유전적 스크리닝과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이러한 실험들은 개발 이후 근육 질환에 대한 새로운 치료 전략을 수립하는 데 도움이 될 수 있습니다. 본 기술은 근육 질환 연구 분야의 연구자들이 근이영양증 제브라피쉬 모델에서 막 무결성을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

이 영상을 시청한 후, 제브라피쉬 치어의 총 추심정맥(common cardinal vein)에 에반스 블루(Evan's blue) 염료를 주입하는 방법에 대해 철저히 이해하게 될 것입니다. 또한, 근섬유 내에 에반스 블루 염료가 존재함에 따라 막 손상이 발생한 근섬유를 식별하는 방법도 이해하게 될 것입니다.