Name: 에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: 학습하세요 제브라피시 애벌레의 골격 근육 무결성을 평가하는 에반스 블루 염료 주입법을. 이 기술은 근육 영양 장애 모델을 특성화하고 새로운 치료법 개발에 활용됩니다.

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우리는 자신의 기술 지원을 트렌트 워 감사하고 싶습니다. 우리는 또한 아픈 아이들이 프로젝트에 대한 자신의 관대 한 자금에 대한 치료 선천성 근육 영양 장애 (CMD)의 병원에서 소아과를 인정합니다.

한천 사출 플레이트 1. 준비 (시간 : 45 분) <ol><li> E3 미디어의 2 % ~ 3 % 아가로 오스를 삶아 및 솔루션은 벤치에 약간 냉각 할 수 있습니다. 참고 제조되는 분사 플레이트의 수는 필요 아가 로스의 양을 지시한다. 각 분사 플레이트 아가 용액 약 35 ㎖에 필요하다. </li><li> 끓는 후, 원하는 온도가 사출 금형 제조 업체의 지침에 따라 (예., 45 ℃로)에 도달 할 때까지 아가로 오스를 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 100mm 접시에 아가로 오스 냉각의 약 35 ml에 붓고. </li><li> 솔루션으로 선호하는 사출 금형의 한쪽 끝을 놓고, 다음 (이 기포의 발생을 줄이는 데 도움이됩니다) 아가로 오스 솔루션에 금형의 나머지를하다. </li><li> 아가로 오스 용액을 약 30 분 동안 하나 실온에서 4 ° C를 공고히 할 수 있습니다. </li><li> 고체 아가에서 금형의 일단을 분리 주걱을 사용한다. 천천히 m의 나머지를 제거<html> 늙은. </li></ol> 에반스 블루 염료 (EBD) 사출 믹스 2. 준비 (시간 : 30 분) <ol><li> 1X 링거액에 EBD의 1 %의 주식을 확인 (5 mM의 KCl을 155 mM의 NaCl을 2 mM의 염화칼슘 2 1 밀리미터의 MgCl 2, 2 밀리미터 나 2 HPO 4, 10 mM의 HEPES 10 mM의 포도당, 7.2의 pH), 이는 실온에서 저장 될 수있다. </li><li> 25 밀리그램에서 MW 10,000 kDa의 -dextran 형광 염료의 주식 솔루션 (FITC)를 확인 / ㎖ -20 ℃에서 1X 링거액 및 저장소 </li><li> (. 즉, 100 μL의 최종 작업 볼륨 : FITC 덱스 트란 주식의 90 μL에 1 % EBD 10 μl를 혼합) FITC-덱스 트란 주식의 원액을 직접 0.1 %에 EBD를 희석하여 주입 믹스를 준비합니다. </li><li> 철저하게 소용돌이 주입 믹스 (이 녹색으로 변합니다) 및 알루미늄 호일에 주입 혼합 튜브를 배치하여 직접 빛이 닿지 않는 곳에 보관. </li></ol> 3. EBD 주입 준비 (시간 : 약 30 분) ENT &quot;&gt; 참고 : 프로토콜 3-7 일 포스트 수정 (DPF)에서 유충으로 가장 적합합니다. <ol><li> RT에 대한 사전 따뜻한 주입 판. </li><li> 금속 접시에 미세 조작기를 배치하여 사출 장치를 설정하고 현미경 옆에 사출에 사용되는 서있다. 공기 구동 미세 주입 컨트롤러를 켭니다. 참고 : 선호 분사 시스템은 실험실에 따라 다릅니다 및 분석의 결과를 변경해서는 안됩니다. </li><li> 위로 EBD 믹스의 약 2-4 μL와 주사 바늘을 입력합니다. </li><li> EBD 믹스의 약 5 NL에 주입 볼륨을 보정합니다. 주 : 주입량 교정 교정 방법에 의존 할 것이다. 가스 압력이 인젝터 마이크로 미터를 사용하여 볼륨을 통해 볼 루스 보정 주입 부피를 필요로하는 반면, 피스톤 구동 주입 직접 주어진 주입 부피로 설정 될 수있다. </li><li> 1X 링거액 젖은 주입 판과는 우물에서 초과 제거합니다. </li><li> 0.04 %의 에틸 3- 아미노 벤조 에이트의 메탄 샐 사전 치료 유충분사의 시작에 앞서 유충 고정화 1X 링거액 희석 t (tricaine). 참고 : 적절한 주입 잔여 움직임 어렵 기 때문에 유충을 보장하는 것은 완전히 immotile 있습니다 중요하다. </li><li> 유리 피펫을 사용하여 한천 주입 판 우물에 마취 애벌레를 놓습니다. 유충이 완전히 잘 내에서 자신의 측면에 누워 있는지 확인합니다. 참고 : 물론 당 유충의 수는 실험에 달려있다. </li><li> 유충이 웰에 넣어 후 웰 내에 유충 움직임을 최소화하기 위해 과량의 링거액을 제거한다. 그 애벌레가 탈수되지 않도록 용액의 잔류량을 남겨주세요. </li></ol> EBD와 Zebrafish의 유충 4. 심막 주입 (시간 : 유충 주입의 수에 따라, 약 1-3 시간) <ol><li> 주사가 수행 될 해부 범위에 유충을 포함하는 주입 판을 놓습니다. </li><li> 포함하는 주입 피펫 바늘의 위치를EBD는 제브라 피쉬 애벌레를 통해 섞는다. </li><li> 다시 위치를 회전시킴으로써 분사 플레이트 정도로 주사 바늘은 유충의 중심부 근처이며, 대략 45 ° 복부 전후방 축으로부터. </li><li> 정맥 처음 지느러미 방향으로 돌고 노른자 (그림 1)의 전방 부분에서 정맥의 영역에서 일반 추기경 정맥 (CCV)에 주사 바늘을 ​​삽입합니다. 참고 : 최대 40 배까지의 배율이 명확하게 CCV를 참조하는 것이 유용 할 수 있습니다. </li><li> EBD 믹스 5 NL을 주입하고 EBD 믹스 즉시 누출을 최소화하기 위해 5-8 초 동안 위치에 주사 바늘을 유지. 참고 : 좋은 주입은 심장 챔버에서 볼 수 염료 착색 (그림 1)을해야합니다. EBD 믹스는 심장에서 관찰되지 않으면, EBD 믹스 추가 5 NL 염료 흡수를 유도하기에 충분할 수있다 주입. 또한, 배아는 폐기 될 수있다. 참고 : 어떤 경우에는 심장이 박동을 중지 할 수 있습니다. 이 O를하는 경우ccurs, 20 ~ 40 초 동안 유충을 모니터링하는 것을 계속한다. 염료가 순환 시스템을 통해 이동함에 따라 일반적으로 심장 박동이 다시 시작됩니다. </li><li> 다음 유충 반복에 이동합니다. </li><li> 바로 주입 (그림 2) 후 혈관에 FITC-덱스 트란의 존재를 관찰하여 성공적으로 주입 된 배아를 식별합니다. </li></ol> 5. 배양 및 EBD 통풍 관 (시간 : 4 ~ 6 시​​간) <ol><li> 유충의 원하는 번호가 주입 된 후, 반환 100mm 요리에 tricaine없이 1X 링거액에 유충을 주입. </li><li> 알루미늄 호일에 싸서 요리를 유지합니다. 주 : 어두운 주입 유충 크게 늘리지 생존율을 증가시키고, 신호 강도에 큰 일관성을 보장한다. 알루미늄 호일로 포장 유충 인큐베이터 외부의 시간 동안 특히 중요하다. </li><li> 충분한 EBD 흡수를 보장하기 위해 유충은 4 ~ 6 시간 동안 28.5 ℃에서 부화 할 수 있습니다. </li></OL&gt; 근육에 EBD 6. 시각화 (시간 : 유충 주입과 현미경의 종류의 수에 따라, 예상 0.5-3 시간) <ol><li> 이전 영상에 움직임을 방지하기 위해 0.04 %의 유충과 tricaine 마취. </li><li> EBD 흡수가 골격 근육 (그림 3)에서 발생하는 경우 적색 형광에서보기 유충 확인합니다. </li></ol>

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제브라 피쉬는 신경 근육 질환 2,29의 연구를위한 강력한 도구로 부상하고있다. 현재까지, 제브라 피쉬 시스템은 새로운 근육 질환을 일으키는 돌연변이를 확인 16,17,30 신규 pathomechanisms 18을 해명하고, 잠재적으로 새로운 치료약 (12, 24)를 식별하는 데 사용되어왔다. 이러한 집단적인 노력은 인간의 신경 근육 질환을 모델링 할 수있는 제브라 피쉬의 유틸리티를 설립했다. 그러나, 제브라 피쉬와 포유 동물 모델로 만든 진보에도 불구하고, 신경 근육 조건의 넓은 스펙트럼 내에서 환자에 대한 제한적인 치료 옵션이 있습니다. 따라서, 수요는 파괴적인 질병이 그룹에 대한 치료 개발을 위해 존재한다. 치료법이 요구 평행하면 새로운 동물 모델 및 추정 치료 전략을 검증하는 실험 진행 혁신뿐만 아니라 엄격한 분석을위한 대응이 필요하다. EBD 분석은 일반적으로 마우스 모델에서 사용연구 조직과 뇌, 심장에서 세포 손상 및 골격 근육 27,31. 특히, EBD 근육 세포막 불안정성의 정도를 표시하고 8 손상 근이영양증 다양한 아형의 마우스 모델에서 광범위하게 사용된다. 근육 세포막 손상을 드러내는 EBD의 사용은 인간의 질병 상태 (9) 동물 모델의 유사성을 확립지지 파라미터이다. 마우스에 EBD의 힘은 개발 및 신경 근육 질환의 제브라 피쉬 모델에 EBD를 적용, 우리 자신을 포함한 여러 실험실을 주도하고있다. EBD 인해 분석의 적용으로,이 기술은 활발 인간 질병 상태에 11,15,22,24,32 제브라 피쉬 모델을 확증하기 위해 구현되고있다. 손상된 근육 막과 유충은 근육 섬유 내의 EBD 흡수하기 때문에 적색 형광을해야합니다. 개별 근섬유 내의 섬유 간 공간에 형광 관찰 아니지만 역시 t의 기저막로부터 분리 섬유의 정보 일 수있다유용한 진단 세부 사항을 제공하는 멤브레인 손상의 그는 부재. EBD 분석은 동물 모델 검증을 넘어 잠재적 인 응용 프로그램이 있습니다. 우리의 실험실에서 노력은 최근 EBD 분석은 잠재적으로 새로운 치료 약물 (24)의 유효성을 검사에 도움이되도록 증명하고있다. 잠재적 인 치료 치료를 감소 시키거나 관련 치료 활동 (8)을 의미 할 수 있습니다 신경 근육 질환 모델에 EBD 흡수를 폐지 여부 확인. 이러한 유형의 분석 치료제 메커니즘 (들)을 설정하는 데 도움 EBD 및 분석 애플리케이션을 확대 할 수있다. 많은 기술과 마찬가지로, EBD 분석은 실험 설계 및 연습 동안 관찰 할 몇 가지주의 사항을 가지고있다. 예를 들어, 나이 인해 조직의 비후에 CCV를 식별하기 어려울 수있다. 또한, 실험 횟수를 줄이고 다수의 유충 수험 할 필요성을 증가 전과 심낭 주입 중에 제조에서 유충을 손상하기 쉽다.손상된 근육 EBD을 차지할 수 게다가, 처리 및 사출 동안 유충 짓을 물리적 손상은 오탐 (false positive)이 발생할 수 있습니다. 이러한 장애들을 극복하기 위해, 우리는 사출 전에 후속 분석 직후 성공적인 염료 주입과 유충 쉽고 신뢰할 수 있도록 식별이 비디오 문서 공동 사출 전략을 설명 하였다. 전에 근육 섬유로의 흡수로 혈관에 EBD의 확인을 허용하여 성공적으로 주입을위한 공동 분사 제어 FITC-덱스 트란. EBD 형광은 근육 섬유에서 수집되지 않을 경우 몇 시간 후 애벌레 매우 확산되면서 특히 유용 할 수있다; 이와 같이, 탐지하기 어려울 수있다. 또한, CCV 누락 및 노른자 또는 신체 공동으로 EBD를 주입하면, 배양 한 후, 손상된 근육 섬유에 의해 흡수의 감소 가능성과 아직 배아를 제어 할 유사한 확산 붉은 형광이 발생할 수 있습니다. 종합적으로,이 동굴ATS는 EBD 주입이 일관되고 신뢰할 수있는 결과를 달성하기 위해 인내와 연습이 필요 좋습니다. 모든에서는 제브라 애벌레 EBD 분석을 수행 실용적이고 간단한 방법을 설명한다. 지금까지 모델 시스템으로서 지브라 피쉬의 사용은 특히 인간의 질환 모델로서, 급속하게 확장되고있다. 이 확장은 제브라 피쉬 시스템의 현재 장점을 개선 실험 기술의 지속적인 개발 및 수정에 부분적으로 기인한다. EBD 주입 기술은 검증 및 제브라 피쉬 근육 질환 모델 연구를위한 연구자의 무기에 추가하고 강력한 도구를 제공합니다. 이 기술의 지속적인 구현 및 수정은 새로운 치료 전략뿐만 아니라 질병을 일으키는 메커니즘을 밝히기 도울 수있는 잠재력을 가지고있다.

근이영양증은 특정한 조직병리학적 특징을 가진 널리 퍼진 이질적인 인간 근육 질환의 그룹을 구성합니다1,2. 이 파괴적인 질병군과 관련된 전형적인 증상으로는 근육 약화, 근육 퇴화, 운동성 상실, 조기 사망 등이 있습니다1,3. 근이영양증의 주요 병리 기전은 육종을 안정화하고, 막관통 복합체를 고정하고, 막을 가로지르는 세포 신호를 매개하는 단백질의 손실입니다4-6. 예를 들어, 디스트로핀-당단백질 복합체의 일차 골격 단백질인 단백질 디스트로핀(dystrophin)의 완전한 손실은 뒤셴 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy)7에서 근육막의 불안정화를 초래합니다. 대부분의 근이영양증은 세포외 기질(extracellular matrix)과 근골격(sarcolemmal cytoskeleton) 사이의 연결에 참여하는 단백질의 돌연변이로 인해 발생하기 때문에, 세포 수준에서 흔히 관찰되는 것은 천골 무결성(sacrolemmal integrity)의 상실이다8,9. 근이영양증과 관련된 일차적 병리기전(들)에 대한 이러한 이해는 동물 모델 시스템2,10-15를 이용한 수년간의 연구의 산물이다. 그러나 이 분야의 발전에도 불구하고 다양한 이영양증 하위 유형의 치료 또는 관리를 위한 치료 옵션은 여전히 제한적입니다. 이러한 실행 가능한 치료법의 한계는 다음과 같은 몇 가지 주요 요인에 기인합니다: 1) 유전자 치료 전략의 어려움, 2) 새로운 질병 사례의 높은 빈도와 그에 따른 번역 가능한 동물 모델의 부족, 3) 명확하고 재현 가능한 결과 측정으로 추정되는 치료제의 생리학적 결과를 테스트하기 위한 엄격한 전략의 부족.
이러한 한계를 극복하기 위해 우리 실험실을 포함한 수많은 실험실에서 제브라피시를 사용하여 인간의 신경근 질환을 모델링하고 연구하고 있습니다2. 지금까지 제브라피시는 질병 연구에서 유용한 도구임이 입증되었습니다. 제브라피시 모델은 돌연변이를 일으키는 새로운 인간 질병을 식별 및 검증하고(16,17), 특성화되지 않은 질병 유발 메커니즘17,18을 규명하고, 새로운 치료 전략을 식별하는 데 사용되었습니다12,19. 이러한 발전은 부분적으로 제브라피시 시스템의 표준적 강점, 즉 광학적 선명도, 유전자 조작의 용이성, 많은 수의 번식 능력에 의해 이루어졌다20. 제브라피시는 또한 새로운 치료제22-24의 식별을 위한 귀중한 방법인 대규모 약물 스크리닝21로 수정할 수 있음이 입증되었습니다. 근육 질환 연구와 관련하여, 이러한 강점은 해리25를 통해 단일 제브라피시 골격근 섬유를 분리할 수 있는 능력과 복굴절26이라는 광학 현상을 사용하여 생체 내에서 근섬유 조직을 검사할 수 있는 능력으로 보완되며, 이를 통해 거시적 근육 무결성을 신속하게 결정할 수 있습니다. 이러한 사용 가능한 유틸리티에 관계없이 조사를 진행하기 위해 추가 도구 개발이 지속적으로 필요합니다.
우리와 다른 사람들은 제브라피시 모델에서 EBD 주입 및 분석을 위한 프로토콜을 채택했습니다. EBD는 손상된 세포, 퇴화 세포 또는 자가사멸 세포에 흡수된 후 형광27 하에서 시각화되는 중요한 세포 투과성 염료입니다. 현재까지 EBD 분석은 골격근 및 심장 질환의 마우스 모델에서 근육 막 무결성을 분석하는 데 광범위하게 사용되었습니다8,9,27. 그러나 포유류 준비에서 적출된 근육은 일반적으로 분석 전에 힘든 절편 또는 해부가 필요합니다. 제브라피시에서는 살아있는 동물과 온전한 동물을 사용하여 많은 수의 직접 분석이 가능합니다. 이 비디오 기사에서는 제브라피시 이영양증 돌연변이 계통 sapje15,28에서 EBD 흡수의 대표적인 이미지와 함께 살아있는 제브라피시 유충에서 EBD 주입 및 분석을 수행하는 방법론을 시연합니다. 또한, EBD 제제의 정량화를 증가시킬 수 있는 동시 주입 전략을 제시합니다.

<table><tbody><tr><td>플루오레세인 이소티오시아네이트-덱스트란 MW 10,000</td><td>시그마</td><td>FD10S</td><td></td></tr><tr><td>에반스 블루 염료</td><td>시그마</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트 염</td><td>시그마</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>100mm 페트리 접시</td><td>Fischerbrand</td><td>FB0875712</td><td>사출 금형 베이스</td></tr><tr><td>얇은 벽 유리 모세관</td><td>세계 정밀 기기</td><td>TW100F-4</td><td>주입 바늘</td></tr><tr><td>용 Agarose</td><td>Bioshop</td><td>AGA001</td><td>사출 금형</td></tr><tr><td>미세 사출 금형</td><td>적응 과학 도구</td><td>TU-1</td><td>사출 금형</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Bioshop</td><td>SOD001</td><td>Ringer의 용액</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Bioshop</td><td>POC888</td><td>Ringer의 용액</td></tr> 염화 <tr><td>마그네슘 육수화물</td><td>시그마</td><td>M2670</td><td>링거 용액</td></tr><tr><td>인산 나트륨 일 염기성 일 수화물</td><td>시그마</td><td>S9638</td><td>링거 용액</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마</td><td>H4034</td><td>링거 용액</td></tr><tr><td>포도당</td><td>BioBasic</td><td>GB0219</td><td>링거 용액</td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>시그마</td><td>C1061</td><td>링거 용액</td></tr></tbody></table>

에반스 블루 염료와 zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

제브라피시 모델은 신경근 질환 연구를 위한 새로운 시스템입니다. 신경근 질환에 대한 연구에서 근육 막의 무결성은 중요한 질병 결정 요인입니다. 현재까지 수많은 신경근 질환은 비정상적인 막 무결성으로 퇴화하는 근육 섬유를 나타냅니다. 이것은 근이영양증에서 가장 일반적으로 관찰됩니다. Evans Blue Dye(EBD)는 변성, 손상 또는 자가사멸 세포로 빠르게 흡수되는 중요한 세포 투과성 염료입니다. 대조적으로, 온전한 막을 가진 세포는 그것을 흡수하지 않습니다. EBD 주사는 일반적으로 신경근 질환의 마우스 모델에서 근육 무결성을 확인하는 데 사용됩니다. 그러나 이러한 EBD 실험은 분석 전에 근육 절개 및/또는 절편을 필요로 합니다. 대조적으로, 제브라피시의 EBD 흡수는 살아 있고 손상되지 않은 제제에서 시각화됩니다. 여기에서는 살아있는 제브라피시에서 EBD 주입 및 분석을 수행하기 위한 간단하고 직접적인 방법론을 보여줍니다. 또한 EBD 분석의 효능을 높이기 위한 동시 주입 전략을 입증합니다. 전반적으로 이 비디오 기사는 신경근 질환의 제브라피시 모델에서 EBD 주입 및 특성화를 수행하기 위한 개요를 제공합니다.

EBD 주입 혼합 3 DPF에서 sapje 동형 접합 돌연변이와 야생 형 형제의 CCV에 주입했다. 심장 챔버 (그림 1B)를 가득 주입 후 FITC - 덱스 트란 녹색 형광 아래에있는 혈관에 (그림 2) 시각화하여 성공적으로 주입을 분석 하였다. 4 시간의 잠복기 후, EBD 흡수는 형광 현미경을 사용하여 체절 수준에서 조사 하였다. sapje 동형 접합 돌연변이가 근육 막 (15) (그림 3B)에 손상을 나타내는, EBD 흡수를 보여 주었다 반면 야생 형 형제, 눈에 보이는 근육 섬유 (그림 3A) 내에 EBD 형광을 나타내지 않았다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53183/53183fig1.jpg" /> 제브라 피쉬 엠브리의 일반 추기경 정맥 (CCV)에 그림 1. 주입 EBD 주입 믹스오. (A) Uninjected 배아. 화살표는 CCV 주입을위한 이상적인 위치를 나타낸다. (B) CCV에 성공 주입. 염료는 심장 챔버 (화살표)를 입력하고 혈관을 통해 펌핑하기 시작합니다. (C) 실패 CCV 주입 일부 또는 배아 (화살표)의 난황을 입력 염료의 모든 발생합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53183/53183fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53183/53183fig2.jpg" /> 그림 2. 배아는 즉시 주입 전에 EBD 흡수에 다음과 같은 혈관을 통해 녹색 형광 아래 FITC-덱스 트란 분포를 관찰하여 성공적으로 주입 정렬 할 수 있습니다.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53183/53183fig3.jpg" /> 그림 3 : EBD는 손상된 세포막과 섬유에 의해 흡수 될 것입니다 근육 섬유에는 EBD 형광을 보여주는 (A) 야생형 형제.. (B) 여러 근육 섬유 (화살표) 내 EBD 형광와 Sapje ​​동형 접합 돌연변이. 모든 유충 EBD 주입 믹스 주입하고 3 DPF에서 4 시간 동안 배양 한 후에 분석 하였다. 형제 자매 및 돌연변이가 CCV 주입하기 전에 근육 섬유의 분리으로 분류되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53183/53183fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 연구에서는 제브라피시 유충에 대해 EBD(Evans Blue Dye) 분석을 수행하는 간단한 방법을 설명합니다. 이 기술은 골격근 무결성의 특성화와 근이영양증의 제브라피시 모델을 묘사하기 위한 강력한 도구이며 새로운 치료법 개발을 위한 귀중한 방법입니다.

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Evans Blue Dye 및 Fitzy Dextran의 일반적인 추세정맥 주입의 전반적인 목표는 살아있는 제브라피쉬의 골격근 막 무결성을 관찰하여 다양한 아형의 근이영양증과 관련된 질병 유발 기전을 규명하는 것입니다. Evans Blue dye 주입은 근이영양증 동물 모델의 특성을 분석할 때 질병 병리에 기여하는 생물학적 기전을 밝히는 데 도움이 되며, 질병 치료를 위한 잠재적인 치료 기전에 대한 이해를 높이는 데에도 기여할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 살아있는 제브라피쉬를 사용하여 수행하고 분석할 수 있다는 점입니다.또한, Fitz Dextrin을 함께 주입하여 주입이 성공적으로 이루어졌는지에 대한 품질 관리를 수행함으로써 엄격성과 정량화를 향상시킵니다. 이 기술의 함의는 근육 질환 제브라피시 모델의 검증 유용성과 관련이 있습니다. 또한 이는 근이영양증과 같은 특정 돌연변이가 어떻게 근육 질환 표현형으로 이어지는지에 대한 이해를 높이며, 이는 치료법 및 완치법을 찾는 데 매우 중요합니다.한천 주입 플레이트를 준비하려면 2~3% 농도의 한천을 E3 배지에서 끓인 후, 벤치 위에서 용액을 약간 식힙니다. 식힌 한천 용액을 100mm 디시에 약 35mL씩 붓습니다. 그다음, 선호하는 주입 몰드의 한쪽 끝을 용액에 먼저 넣고, 몰드의 나머지 부분을 한천 용액 위에 올립니다.아그로 용액을 실온 또는 4°C에서 약 30분 동안 굳힙니다. 그 후 스패튤라를 사용하여 몰드의 한쪽 끝을 굳은 아그로에서 분리하고 나머지 몰드를 천천히 제거합니다. 1x 링거 용액(ringer solution)에 1% 농도의 에반스 블루 염료(Evan's Blue Dye 또는 EBD) 스톡 용액을 만듭니다.그런 다음 1x ringer 용액으로 Fitzy Dextrin 표준 용액을 준비하여 -20 °C에서 보관하십시오. 주입 혼합액을 만들기 위해 Fitz Dextrin 표준 용액에 EBD를 0.1%가 되도록 직접 희석하십시오. 주입 혼합액을 충분히 볼텍스하고, 주입 전 알루미늄 호일로 튜브를 감싸 직사광선을 차단하십시오. 주입 플레이트를 실온으로 미리 데워 두십시오.마이크로 조절기(micro manipulator)를 금속판 위에 배치하고 주입 현미경 옆에 세웁니다. 공압식 마이크로 주입 제어기를 켭니다. 그런 다음 약 2~4 µL의 EBD 혼합물을 사용하여 주입 바늘을 역충전합니다.다음으로, 약 5 nL의 EBD 혼합액을 사용하여 주입량을 교정합니다. 그 후 1x ringer 용액을 사용하여 주입 플레이트를 적시고 웰에서 과잉 용액을 제거합니다. 유리 피펫으로 주입하기 전, 1x ringer 용액에 희석한 0.04% trica로 유충을 전처리하여 완전히 마취시킵니다. 마취된 유충을 오거(auger) 주입 플레이트의 웰에 넣고, 유충이 옆으로 누운 상태로 웰 안에 완전히 들어가도록 합니다.웰 내에서 치어의 움직임을 최소화하기 위해 과잉의 trica 용액을 제거하되, 탈수를 방지할 수 있을 만큼의 양은 남겨둡니다. 치어가 담긴 주입 플레이트를 해부 현미경 위에 올리고 EBD가 들어 있는 주입 피펫 바늘을 위치시킵니다. 심장 근처이며 전후축에서 약 45도 각도가 되는 지점에서 제브라피쉬 치어에게 혼합물을 주입합니다.주입 바늘을 난황의 앞부분 근처에서 정맥이 처음으로 등쪽 방향으로 꺾이는 총심장정맥(common cardinal vein, CCV)에 삽입합니다. 다음으로, 5 nL의 EBD 혼합물을 주입하고 주입 바늘을 5~8초 동안 그대로 유지합니다. EBD 혼합물이 즉시 유출되는 것을 최소화해야 하며, 주입이 잘 되었다면 심장실 내에 염료가 보일 것이고, 필요시 이를 반복할 수 있습니다.성공적인 주입 직후 심장에서 EB DMX가 보이지 않는다면, 여기에서 보는 바와 같이 배아의 혈관계에 Fitz Dextrin이 축적될 것입니다. 원하는 수의 치어가 주입된 후, 생존율을 높이고 신호 강도를 유지하기 위해 치어를 trica가 없는 1x ringer solution이 담긴 100 mm 디쉬로 옮기십시오. 디쉬는 알루미늄 호일로 감싸서 보관하십시오.효율적인 EBD 흡수를 위해 유충을 28.5 °C에서 4~6시간 동안 배양합니다. 근육 내 EBD를 시각화하려면 0.04% trica로 유충을 마취시킨 후 적색 형광 하에서 유충을 관찰하십시오. Sapia 동형 접합 돌연변이체와 야생형 형제들의 CCV에 EBD를 주입하였습니다. 3D PF 단계에서 여기에서 보는 바와 같이 심실을 채우도록 주입하였으며, 이후 녹색 형광 하에서 혈관계의 fitzy dextrin을 시각화하여 염료 관류가 성공적으로 이루어졌는지 분석하였습니다.4시간의 배양 기간 후, 이 그림에 표시된 것과 같이 소절(somite) 수준에서 EBD 흡수를 조사하였습니다. 야생형 형제들은 가시적인 근섬유 내에서 EBD 형광이 나타나지 않은 반면, sapia 동형 접합 돌연변이체는 근육막의 손상을 나타내는 EBD 흡수를 보였습니다. 제브라피쉬의 공통 심장정맥으로의 Evans blue dye 주입 기법에 숙달되면, 주입하는 치어의 수에 따라 30분에서 60분 이내에 치어들에 대한 처리를 완료할 수 있습니다.또한, 숙련도를 보장하기 위해 단 하루 만에 실험 결과를 얻을 수 있습니다. 일관되고 해석 가능한 결과를 생성하기 위해서는 심장 정맥(cardinal vein)을 정확하게 겨냥하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이는 어려울 수 있으며, 본 절차를 수행함에 있어 연습이 필요할 가능성이 높습니다.근이영양증과 관련된 막 손상을 일으키는 분자적 기전을 규명하기 위해 화학적 및 유전적 스크리닝과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이러한 실험들은 개발 이후 근육 질환에 대한 새로운 치료 전략을 수립하는 데 도움이 될 수 있습니다. 본 기술은 근육 질환 연구 분야의 연구자들이 근이영양증 제브라피쉬 모델에서 막 무결성을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.이 영상을 시청한 후, 제브라피쉬 치어의 총 추심정맥(common cardinal vein)에 에반스 블루(Evan's blue) 염료를 주입하는 방법에 대해 철저히 이해하게 될 것입니다. 또한, 근섬유 내에 에반스 블루 염료가 존재함에 따라 막 손상이 발생한 근섬유를 식별하는 방법도 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

제브라 피쉬는 골격 근육의 인간의 질환을 모델링하는 새로운 시스템이다. 우리는 배아 및 유충의 제브라 피쉬에서 골격 근육의 근섬유를 분리하는 빠르고 효율적인 방법을 설명합니다. 이 방법은 하나의 골격 근육 섬유 형태의 연구에 적합한 고밀도 근섬유 준비, 단백질 세포 내 현지화, 근육 생리를 얻을 수 있습니다.

해리 된 준비에서 배아와 애벌레 Zebrafish의 골격 근섬유의 분석

힘의 측정은 개발, 부상, 질병, 치료 또는 화학 물질의 독성에 의한 근육 기능의 변화를 보여주기 위해 사용할 수 있습니다. 이 비디오에서는, 우리는 zebrafish의 애벌레 몸통 근육의 최대 수축시 힘을 측정하는 방법을 보여줍니다.

Zebrafish의 유충의 근육 기능을 평가하기 위해 수축하는 동안 힘 측정

제브라피시는 이제 근이영양증, 선천성 근병증 및 관련 신경근 질환을 모델링하기 위한 확립되고 강력한 도구입니다. 복굴절(Birefringence)과 촉각(touch-hoked) 탈출 행동은 초기 발달 과정에서 제브라피시 배아의 근육 무질서 및 기관차 손상 정도를 결정하는 데 사용되는 두 가지 일반적인 비침습적 분석법입니다.

복굴절(Birefringence) 및 촉각-유발 탈출 반응 분석(Touch-evoke Escape Response Assay)에 의한 유충 제브라피시의 골격근 결손 분석

골격 근육은 운동을 위해 필수적이며, 몸의 주요 단백질 저장소입니다. C. elegans의 내 근육 건강 측정이 설명되어 있습니다. 근육의 구조와 기능에 대한 전향 적 변화는 지역화 된 GFP 및 양이온 성 염료를 사용하여 평가됩니다.

방법은 근육의 세포 내 구획을 평가하기 위해 C. 엘레

얼룩말은 근육 기능과 질병을 연구하는 훌륭한 모델입니다. 초기 배발생 동안 제브라피쉬는 규칙적인 근육 수축을 시작하여 리드미컬한 수영 행동을 일으키며, 이는 근육이 파괴될 때 변경됩니다. 여기에서는 근육 기능의 척도로서 수영 성능을 조사하기 위해 촉각 유발 반응 및 운동 분석에 대해 설명합니다.

터치 유발 대응 및 로코 분석 실험을 사용하여 Zebrafish의 근육의 성능 및 기능을 평가하기 위해

Finite Element Analysis는 하중을 받는 구조물의 기계적 성능을 조사하는 데 자주 사용되는 도구입니다. 여기에서 우리는 제브라피시 턱의 생체 역학을 모델링하는 데 그 사용을 적용합니다.

Zebrafish의 턱 역학을 조사하기 위해 유한 요소 모델을 구축

이 프로토콜의 목표 zebrafish에 치명적인 골격 돌연변이 고기 penetrance 선택적인 breeding에 의해 변경 하는 것입니다. 치명적인 돌연변이 성인 기에 성장 될 수 없는 자신을 사육, 따라서이 프로토콜 추적 하 고 여러 세대에 걸쳐 penetrance 테스트 자손에 의해 선택 하는 방법에 설명 합니다.

Zebrafish 치명적인 골격 돌연변이 Penetrance 자손 테스트 하 여 이동

골격 근 재생 조직 상주 근육 줄기 세포에 의해 구동, 근육 이영양증 등 많은 근육 질환에서 손상 되는, 그리고이 재생 하는 근육의 무능력 결과. 여기서는 근육 질환의 제브라피시 모델에서 근육 재생을 검사할 수 있는 프로토콜을 설명합니다.

근육 질환의 제브라피시 모델에서 근육 재생 검토

여기에서는 아세트산 납 노출이 제브라 피쉬 유충의 뼈 질량 변화를 유발한다는 것을 보여주기 위해 알리자린 레드 염색을 사용했습니다. 이 염색 방법은 다른 위험한 독성 물질에 의해 유도 된 제브라 피쉬 유충 손실의 뼈 손실 조사에 적용될 수 있습니다.

알리자린 레드 염색을 사용하여 제브라피쉬 유충에서 화학적으로 유발된 뼈 손실 검출

광학 선명도는 제브라 피쉬의 세포 생물학적 및 생리 학적 작업에 대한 주요 이점입니다. 골격근 및 이웃 조직의 성장이 전신 성장과 어떻게 통합되는지에 대한 새로운 통찰력을 허용하는 개별 동물의 세포 성장 측정을위한 강력한 방법이 설명됩니다.

변경된 전기적 활동을 받은 개별 살아있는 제브라피쉬의 골격근 성장에 대한 실시간 및 반복 측정

이 프로토콜은 성인 제브라피쉬에서 여러 꼬리 근소체의 심각한 손상을 유도하는 냉동 손상 모델을 설명합니다. 이 방법은 비포유류 척추동물에서 심각한 조직 손실 후 골격근 재생을 연구하기 위한 새로운 접근 방식을 제공합니다.

성인 제브라피쉬에서 꼬리 꽃자루의 골격근 재생을 연구하기 위한 냉동 손상 모델

학습하세요 제브라피시 애벌레의 골격 근육 무결성을 평가하는 에반스 블루 염료 주입법을. 이 기술은 근육 영양 장애 모델을 특성화하고 새로운 치료법 개발에 활용됩니다.

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

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