Name: 파킨슨 뇌에서, 수용성 알파 시누 클레인의 순차 추출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-05T14:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: 배우세요 파킨슨병 뇌 조직에서 수용성 및 불용성 알파-시누클레인을 추출하는 방법을. 초고속 원심분리와 웨스턴 블롯팅을 활용하여 단백질 응집 특성을 분석하고 병리 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

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나는 인체 조직에서 α-synuclein을 추출하고 얼룩을 달려준 Adamantios Mamais 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 UCL 신경학 연구소, 셰필드 대학교 및 던디 대학교의 MRC 단백질 인산화 유닛의 회원으로 구성된 영국 파킨슨병 컨소시엄(UKPDC)에 MRC 보조금(MR/L010933/1)과 웰컴 트러스트/MRC 신경 퇴행 공동 호출 상(WT089698)의 지원을 받았습니다. RB는 이 작업을 위해 MJFox 재단으로부터 자금을 지원받았으며 Reta Lila Weston Trust에서도 자금을 지원받았습니다.

사후 뇌 조직은 신경 질환에 대한 여왕 광장 뇌 은행에 기증, 런던 대학, 윤리적으로 승인 된 프로토콜을 사용하여 신경 연구소 인체 조직 기관에서 발급 라이선스에 따라 연구를위한 저장 (HTA) 영국 (NO. 12198). 이 프로토콜 (표 1)에 사용되는 경우의 목록을 참조하십시오. 버퍼 1. 준비 <ol><li> 1X TBS (트리스 완충 식염수) 버퍼를 준비합니다 <ol><li> 500 mM 트리스 - 염산 pH 7.4의 1,500 밀리미터의 NaCl과 원액으로 10 배 TBS를 준비합니다. <ol><li> 밖으로 60.5 g의 트리스 - CL 산도 7.6 및 고순도 물 800 ㎖ 중의 염화나트륨 87.6 g의 무게. 1 M 염산으로 pH를 조정하고 1 L.에 최종 재고 볼륨을 </li></ol></li><li> 증류수 스톡을 10 배 희석하여 1X TBS의 최종 농도를 준비한다. </li><li> 추가 단백질 분해 효소 억제제 (PI), (50 ㎖ 버퍼 당 1 정제) 및 PHOS 스톱 포스 파타 아제 억제제 정 (1 정 버퍼 ml의 10 당)에프로테아제 및 포스파타제의 비 특정 효소 활동의 효과를 폐지. 참고 : 여기에서 우리는 제조업체의 지침에 따라 사용할 수 있습니다 로슈에서 정제하지만 똑같이 다른 상업적으로 이용 가능한 억제제 억제제 효소를 사용하고 있습니다. </li></ol></li><li> (PH 7.4) 1X TBS에 / 나트륨 V 도데 실 설페이트 (SDS) 승 버퍼를 5 %를 추가하여 TBS-SDS 버퍼를 준비합니다. SDS를 가용화 자기 교반기를 사용하여 일정한 교반과 함께 60 ℃로 용액을 가열한다. </li><li> 8 M / TBS-1X SDS 버퍼 V w (PH 7.4)의 최종 농도로 우레아를 첨가하여 TBS-SDS 우레아 버퍼를 준비한다. 우레아를 용해 교반기 일정한 교반과 함께 60 ℃로 용액을 가열한다. </li></ol> 2. 샘플 균질화 및 차등 초 원심 분리 주 : 작업의 다음 부분 HTA UK의 규칙들에 따라 인간의 뇌 조직의 처리를 포함한다. 지역 표준 운영 절차는 모든 TI에 따른다MES. 뇌 시료는 부압 유지 microcabinet 균질화 동결 뇌 조직 블록 재료 해부된다. 일회용 가운 장갑, 얼굴 마스크, 오버 신발 보호 및 안전 고글 절차 전반에 걸쳐 착용. 인체 조직의 폐기물은 안전 처리를위한 20 분 동안 121 ℃에서 고온 가압 멸균 후 폐기됩니다. 샤프 (메스 블레이드) 봉쇄 및 안전한 폐기를위한 적절한 날카로운 컨테이너에 배치된다. <ol><li> (기저핵 지역에서 무게가 약 0.5 g)을 냉동 인간 조직의 덩어리를 타고 빠르게 작은 페트리 접시 및 멸균 메스 블레이드를 사용하여 얼음에 작은 조각 (약 1 ㎜ × 2)로 말하다. 각 샘플에 대한 별도의 배양 접시와 메스 블레이드를 사용합니다. 15 ML 튜브에 다진 조직을 수집하고 튜브에 얼음처럼 차가운 1XTBS 버퍼의 10 권을 추가합니다. </li><li> 10 초 동안 20,000 rpm에서 기계적 균질기를 사용하여 샘​​플을 균질화. 2 분 동안 얼음에 냉각. 이 단계에서 세 시간을 반복에스. 주 : 균질화 동안 샘플 가열되지 않도록이 행해진 다. </li><li> 4 ℃에서 5 분 동안 1,000 XG에서 원심 분리하여 명확히. 비 균질 재료의 펠렛을 폐기하십시오. </li><li> 상층 액 (원유 균질)를 가지고, (튜브의 크기는 로터의 크기에 따라 달라집니다) 원심 분리기 튜브 폴리 카보네이트 조심스럽게 균형을 추가 할 수 있습니다. 4 ℃에서 1 시간 동안 100,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 이 TBS 분획 그대로 뜨는을 유지. </li><li> 워시는 4 ℃에서 15 분 동안 10 만 XG에 1X TBS 버퍼와 원심 분리기마다의 5 권에 두 번 펠렛. 상층 액을 버린다. <ol><li> 실온에서 1X TBS-SDS의 약 5 볼륨에서 20 kHz에서 10 초 동안 펠렛을 초음파 처리하여 최종 펠렛을 재현 탁. 주 : SDS 함유 완충액 샘플 첨가 SDS 침전을 방지하기 위해 10 ℃에서 가져온되어야 전에. </li><li> 25 ° C에서 30 분 동안 10 만 XG에 초 원심 분리기. </li></ol></li><li> 이 일 같이 뜨는 유지전자는 가용성 분획을 SDS. <ol><li> 워시 실온에서 1X TBS-SDS 버퍼의 두 번에 5 볼륨을 펠렛. 원심 분리기 25 ° C에서 15 분 동안 10 만 XG에 때마다. </li><li> 완전한 용해를 달성하기 위해 10 초 동안 20 kHz로 설정 초음파기를 사용하여 1X TBS-SDS 우레아 완충액 50 μL에 최종 펠렛을 용해; 이것은 우레아 가용성 분획으로 불린다. </li></ol></li><li> 제조사의 프로토콜에 따라 상업적 단백질 분석 키트를 사용하여 총 단백질 함량에 대한 각각의 분획을 분석. 단백질 분석 시약과의 호환성을 허용하는 1X TBS 완충액으로 1 : SDS-TBS 우레아 샘플 1 희석. -80 ° C에서 작은 분액 (20 μL)에 동결 샘플을 동결 - 해동 사이클을 감소시킨다. 주의 : 샘플을 10 % 글리세롤을 추가하면 -80 ° C에서 장기간 저장을 위해 권장된다. </li></ol> 샘플 및 분석 결과 3. 면역 블 롯팅 <ol><li> 10 웰 4~12% 비스 - 트리스 폴리 아크릴 아미드 겔에 TBS, TBS-SDS와 TBS-SDS-우레아 추출물에서 실행 샘플표준 기술을 사용하여 버퍼를 실행하는 것과 함께 MOPS. 참조 갤러거와 Chakravarti (2008)에 대한 자세한 서양 얼룩 프로토콜 (29). </li><li> TBS와 SDS 및 요소 분획에 대한 분자량 마커와 함께 각 레인 위에로드 각 샘플에서 단백질의 10 μg의를. </li><li> 1 시간 동안 또는 로딩 버퍼로부터 청색 염료 겔의 바닥에 도달 할 때까지 200 V에서 젤을 실행. </li><li> 전기 영동 나일론 막 (28)에 젤에서 단백질을 이동, 20 % 메탄올을 포함하는 전송 버퍼에 처음으로 100 % 메탄올 다음 사전 젖은. 단백질 측과 분자량 크기 마커의 방향을 결정하기 위해 오점에 식별 표시를 제공한다. <ol><li> 젖은 종이 필터와 함께 막과 젤 샌드위치. 멤브레인의 정확한 위치는 겔과 양극 사이에 분리막으로 중요하다. V. 40에서 2 시간 동안 전송을 수행 </li><li> 1X PBS-트윈 (1X PBS-T) 버퍼 메이크업 : 200 ml의 PBS에 1 정을 녹여물은 0.01 M 인산염 완충액, 0.0027 M 염화칼륨 및 0.137 M 염화나트륨, pH가 7.4을 얻었다. </li><li> 70 rpm으로 진탕하면서 30 분 동안 1X PBS-T에서 5 % BSA 용액을 차단하는 멤브레인. 이 막에 차 항체의 결합 비특이적을 방지 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> (1X PBS-T와 세척 일련의 뒤에 (4 ° C에서 O / N) (750) 희석 : 1에서, α-SYN 차 항체 SYN-1 (마우스 단일 클론 항체 BD 바이오 사이언스) 6 mL를 단백질 얼룩을 프로브 3 × 5 분마다) 28. </li><li> 1 차 항체 결합 된 적절한 HRP와 얼룩을 품어 : 2,000 희석을 30 분 동안. 1X PBS-T와 세척 일련의 (3 × 5 분마다)을 수행합니다. <ol><li> 어두운 방에 15 초 동안 강화 된 화학 발광 솔루션의 말을 담근다. 빛 증거 카세트 단백질면이 위로와 얼룩에 대한 집착 필름과 장소자가 방사선 필름과 커버 말은 적절한 신호 (적절한 크기의 밴드)를 촬영합니다. </li><li> 자동화 된 개발자의자가 방사선 필름을 개발합니다. 참고 : 오도 자동화 개발 기계를 사용할 수없는 경우에는 상용 소스 개발자와 해결사를 사용하여 수동으로 개발 될 수있다. </li></ol></li><li> 웨스턴 블롯 6 ml의 상수 α-SYN 항체 신호의 얼룩을 제거하기 위해 진탕 10 분 동안 버퍼를 제거하여 웨스턴 블롯을 품어. 8,000 희석 : 1에서 베타 - 액틴 차 항체 (마우스 단일 클론)을 사용하여 3.6.2에 이르기까지 단계 3.43를 수행합니다. </li><li> 검사 및 정량을 위해 NIH ImageJ에 (무료로 다운로드 할 수있는 소프트웨어)를 사용하여 TIFF 이미지 및 측정 밀도에 최종 이미지를 변환 할 수 있습니다. 주 : 소프트웨어가 관심의 상대 영역 (적절한 크기의 밴드)의 밀도의 판독이 가능하고, 데이터가 하나의 임의 단위 또는 α-SYN 밀도 / β 액틴 (하우스 키핑 유전자)의 비율로 표현 될 수있다 집 유지 유전자 (우레아 - 가용성 샘플의 경우에서와 같이) 유효하지 않은 경우 자신. </li&gt; </ol>

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이 문서에서는 변성 겔 실행 조건을 사용하여 병에 걸린 뇌에서 추출 및 모노머, 올리고머의 차동 용해도 특성 검사 및 집계 α-SYN에 대한 생화학 적 프로토콜을 설명합니다. 이것은 공부 잘 확립 된 기술이다 집계 α-SYN 17, 18, ​​20, 21의 기본 형태로 일반적으로 용해 될 수 있지만, 질병의 진행 또는 유전 적 돌연변이 아밀로이드 나 증가 집계 특성을 얻을 단백질. 그럼에도 불구하고, 일부 그룹은 (8 % 또는 10 % 대신 5 %) 21, 22, 30. SDS는 α-SYN의 막 결합 된 형태를 포함 할 수 올리고머 음이온 세제와 solubilises을 그들의 버퍼에 SDS 농도에 약간의 차이를 사용했다 α-가 SYN, 요소 반면, 카오 트로픽 시약은 α-SYN (20)의 불용성 집계 및 원 섬유 또는 아밀로이드 형태의 변성. 이와 관련 Paleologou 등의 알 (31)에 의해 체계적인 연구는 안정성을 조사α-SYN 올리고머 및 요소의 다양한 농도와 섬유의 (6.5-8 M) 또는 SDS (0.25-2 %)하고 있음을보고 요소의 높은 농도 SDS 농도 안정하지만 올리고머. α-SYN 올리고머 및 섬유에 대한 특정 그들의 FILA-1 항체는, 비 변성 조건에서 6.5 M 요소 농도에서 섬유의 높은 농도를 감지했습니다. 이 프로토콜에서 사용하는 버퍼의 농도는 밀접한 Culvenor 동부 알에 설명 된 내용을 반영한다. (1999) 32. 불용성 α-SYN의 생화학 추출을위한 해부학 적 뇌 영역은 신중하게 선택해야하고이 질병의 진행 (33, 34)에 따라 α-SYN LB 및 LN 부하를 반영해야한다. 여기에 사용되는 경우가 McKeith에 따라 PD의 진행의 말과 중간 단계를 반영하는 PD의 신피질과 변연계 아형에서 기저핵 샘플 (34) ctriteria 있습니다. 여왕 광장 두뇌 은행, 뇌의 절반이다일상적으로 조직 화학적 분석을 위해 포르말린에 고정하고, 나머지 절반은 신중하게 다른 해부학 적 영역으로 해부하고 플래시가 냉동 생화학 추가 및 DNA / RNA 분석 연구에 -80 오 C의 냉동고에 보관. neuropathologists에 의해 뇌와 절개의 포르말린 고정에 이어, 면역 보관 α-SYN 항체 및 결과를 사용하여 수행됩니다. 또한 루틴 절차로서, 뇌 조직의 pH는 뇌 조직의 agonal 상태의 척도로서 도착시 측정된다. 이 생화학 적 분석을위한 조직 보존의 품질에 대한 확고한 기초를 형성한다. 여기에 우리의 데이터는 더 SDS에게 컨트롤에 비해 PD의 경우에 용해 α-SYN 단량체가 있음을 보여줍니다; 특히 신피질 PD의 경우는 변연 PD의 다양한에 비해 높은 α-SYN 부하가 있습니다. 신피질의 경우는 전두엽과 두정엽 고전으로 신피질 지역에서 PD α-SYN 병리의 큰 진행을 나타냅니다33, 34을 tices. 변연 PD의 경우는 편도, transentorhinal과에 cingulate 영역과 기초 전뇌 / 변연 지역의 지역에서 더 높은 LB 점수를 가지고있다. 의미있는 데이터 및 통계 분석을 위해, 하나는 각 코호트에서 최소 4 케이스를 실행해야합니다. 마찬가지로 우리는 여기에 제시된 오점 데이터의 통계 분석을 시도하지 않았습니다. 또 다른 항체가 서로 다른 형태 / 고차 α-SYN 올리고머 조성물을 인식 할 수 있고, 각각은 자신의 상대적인 감도 및 선호도를 가질 수 있다는 것을 유의해야한다. 그들은 4 개의 α-SYN 항체 (SYN-1, SS, Onco 및 LB509)은 α-SYN 올리고머 / 집계를 위해 적어도 변경 결과를 보여 곳 통 등. 29의 결과에서 알 수있다. 이러한 α-SYN 항체 항원 중 N- 말단 또는 C에 위치하는지 여부에 따라 변동이있을 수 있지만, α-SYN 단량체는 4 항체 유사 범위에 인식하고 있었다29 말단. 종 (20, 21)을 synuclein의 α-마찬가지로, 포스 알파에 대한 특정 항체는 synuclein의 고유 한 고 분자량을 결정합니다. 여기에 기술 된 프로토콜로, 고도로 특징 SYN-1 항체는 19-21 사용되고있다. 그러나, 세포 또한 단백질의 과발현 및 최저 항체 preabsorption 실험을 통해 서양 말에 새로운 항체를 검증하고 고려하는 것이 중요합니다. 그것은 α-SYN과 불안정한 사량의 α-SYN 형태의 작은 조각을 결정하기 위해 연구자들에 의해 적용된 다른 변화를 고려하는 것이 중요합니다. 이 사량 (36)을 안정화 α-SYN (35) 또는 크로스 링커 샘플 균질의 치료의 절단 형태를 유지하기 위해 PBS에 0.4 % PFA와 세포막의 온화한 고정을 포함 할 수있다. 사후 TI를 사용하여 단백질의 정확한 생화학 적 평가ssue는 효소 단백질 분해 및 수정의 최소화가 필요합니다. 이 경우 코호트 내에서 일치하는 샘플을 최단 사후 ​​지연으로 조직을 사용 및 / 또는 선택하는 것이 좋습니다. α-SYN의 표준 면역 항체를 사용하여 면역 조직 화학 법은 분리 프로토콜을 시작하기 전에 수행되어야한다. α-SYN 병리의 정도는 매우 다양하고 선택한 지역에 따라 달라질 수 있습니다. 그것은 모든 실행 최적의 수율에 대한 양성 대조군으로 풍부한 병리와 지역을 선택하는 것이 좋습니다. 필요한 포스파타제 억제제, 프로테아제 억제제 및 만약 사용 세포 용해 중에 발생하고 4 ℃에서 시료를 유지하는 세포 내 단백질 분해 효소 또는 포스 파타 아제의 방출 후에 중요 효소 불필요한 저하를 방지 할 수있다. 이 실험의 배치 내의 모든 샘플 내 사용자 변동을 피하기 위해 균일하고 일관성있게 처리하는 것이 중요하다; 여러 FRE이것은 잠재적으로 인산화 같은 번역 후 변형을 후퇴 있으므로 에즈 - 해동 사이클은 피해야한다. 많은 수의 샘플을 검사하는 면역 블롯에서 데이터 겔상의 다른 모든 샘플 및 해당 시료에 참조 된 모든 데이터를 병렬로 실행해야 하나의 샘플로 정규화되어야한다고 때 중요한 점은 유념. 이것은 여러 면역 블롯 사이에 데이터의 정규화를 보장하기 위해 수행된다. 이것은 우리의 최근의 연구 22 년에 채택 된 방법이다. 이는 낮은 배경 ECL을 유지하기 위하여, 블롯 웨스턴 블롯 프로토콜 중 언제든지 건조하도록 허용되지 않는 것을 주목해야한다. 이 ECL 신호의 포화로 이어질 것입니다 및 부정확 한 정량으로 이어질 것 같이 또한,자가 방사선 필름에 매우 장시간 노출 (&gt; 10 분)은 피해야한다. 이 프로토콜은 상술 한 일반적인 실험실 시약을 사용하고 비교적 간단한 기술이다악기로 및 PD의 연구에서 α-SYN 단백질의 병태 생리를 조사하는 유용한 도구가 될 수 있습니다. 이 방법은 α-SYN 형질 전환 동물의 α-SYN 생물학의 연구에 적절한 수정뿐만 아니라, 광고, MSA, 루이체 치매, HD 및 frontotemporaldementias으로 집계 된 단백질의 이상 예금을 특징으로 다른 신경 퇴행성 질환으로 확장 할 수 없습니다. 그러나 여기에 설명 된 웨스턴 블랏 데이터는 α-SYN (31)의 특정 형태에 대한 항체를 사용하여 효소 면역 분석법을 이용하여 확인 될 수있다.

몇 가지 신경 퇴행성 질환 사이 공통 키 병적 특징 중 하나는 단백질 / 질병 특정 방법 1에서 발생 비정상적인 단백질 응집체의 형성이다. 따라서, 알츠하이머 병 (AD)의 신경 세포 내의 특성 extraneuronal 아밀로이드 베타 플라크 집계 hyperphosphorylated 타우 예금이있​​다; 루이 기관 intraneuronal 흠도 있습니다 (LBS), 및 또한 루이 신경 돌기 (림프절) 루이 기관 (DLBS) 2-4와 PD, PD 치매와 치매에라는 이영 신경 프로세스 내에서 집계 된 α-SYN 예금. 이상 α-SYN 예금은 MSA 5 아교 세포질 흠도의 특징 병변에서 볼 수 있습니다. 헌팅턴의 질병에서,이 특성 폴리-Q 예금이 있고, 비정상적인 타르 DNA는 단백질-43 및 육종 단백질 (FUS)의 융합이 전 측두엽 치매에 증착 바인딩. 중요한 것은 PD에 대해, α-SYN 유전자 돌연변이는 CAU에 발견되었다PD 6-11 지배적 자체의 염색체. 또한, α-SYN 유전자 삼배 (12)과 중복 (13)도 따라서 PD의 pathomechanisms 증가 α-SYN 식을 연결하는 가족 PD가 발생합니다. 특히, 산발적과 가족 모두 PD의 경우는 α-SYN 병리 (14)의 이상 예금을 항구. PD의 현재 가능한 치료는 완화 적 전용이며 불변 중지 또는 질병의 진행을 지연에 영향을 미치지 않는다. α-SYN가 풍부 인간의 뇌에서 발현 및 뇌 총 단백질의 약 1 %를 차지하게된다. 이 신경 세포 내에서보다 구체적으로 존재하지만 아교 세포 내에서 낮은 금액에 불구하고 존재할 수 있습니다. 논쟁 점은 임의의 모노머 (15) 또는 접힌 사량 (16)로 존재할 수 α-SYN의 기본 구조입니다. 질병 중에 α-SYN은 잘못 폴딩을 얻을 수 있도록 그 형태를 변경하고,이 프로세스는 pathoge 질환의 원인으로 생각된다nesis. α-SYN과 질병의 병태 생리 학적 측면으로 조사 몇 년간에도 불구하고, 질병 메커니즘의 정확한 원인은 14 애매 남아있다. 파킨슨 두뇌의 사후 분석을 사용하여 연구는 지금까지 α-SYN 산발적 PD와도 모두 LRRK2 유전자 17 ~ 22의 돌연변이와 관련된 PD의 정상 및 비정상 생물학에 관한 중요한 단서를 제공하고 있습니다. 여기에, 다양한 수준에 α-SYN 집계 항구 인간의 사후 PD의 뇌 조직에서 점점 불용성 α-SYN 예금 생화학 추출 프로토콜 (참조 방식은 그림 1에 제시) 기술되었다. 이 기술은 또한 다른 신경 퇴행성 질환 (23, 24)에서 총 단백질을 연구하는 버퍼 조성물에 수정 또한 형질 전환 동물의 뇌 조직 25-27에서 적용 할 수 있습니다. 적응에 대한 주요 고려 사항은 solubi의 차이입니다lity과 중 일부 각각의 단백질의 총 금액은 주로 핵이며, FUS 28과 같이 최적의 추출 높은 소금 버퍼를해야 할 수도 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Tris-HCL</td><td>Sigma</td><td>T5912</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>VWR</td><td>27800.291</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fluka</td><td>71727</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 정제&nbsp;</td><td>Roche</td><td>04 693 116001</td><td></td></tr><tr><td>인산가수분해효소 억제제 정제&nbsp;</td><td>로슈&nbsp;</td><td>04 906 837001</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수&nbsp;</td><td>시그마&nbsp;</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>트윈-20&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS 실행 버퍼</td><td>Invitrogen</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 전송 버퍼</td><td>Invitrogen</td><td>NP0006-1</td><td></td></tr><tr><td>Hybond-P membrane&nbsp;</td><td>GE 헬스케어</td><td>RPN303F</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 3MM 여과지</td><td>시그마</td><td>WHA30306185</td><td></td></tr><tr><td>비스-트리스 젤 4-12%&nbsp;</td><td>인비트로젠&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NP0322BOX Supersignal West Pico 화학발광 기판</td><td>Pierce</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>Bio-RAD DC 단백질 분석 키트&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0112</td><td></td></tr><tr><td>Thickwall Beckman 폴리카보네이트 튜브</td><td>Beckman</td><td>355630</td><td></td></tr><tr><td>웨스턴 블롯 스트리핑 버퍼</td><td>Thermo scientific</td><td>46430</td><td></td></tr><tr><td>Syn-1 일차 항체 (마우스 단클론)</td><td>BD Biosciences</td><td>610786</td><td></td></tr><tr><td>beta-actin 일차 항체 (마우스 단클론&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>HRP 코활용 염소 안티-마우스 2차 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2031</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Instrument</td><td>Company</td><td>Rotor/ 모델 번호&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>벤치 탑 초원심 분리기 Optima Max</td><td>Beckman</td><td>MLA-80</td><td></td></tr><tr><td>초음파 발생기</td><td>열 시스템</td><td>XL20-20</td><td></td></tr><tr><td>균질기</td><td>Jenke 및 Kunkel</td><td>TP18 / 10</td><td></td></tr></tbody></table>

파킨슨 뇌에서, 수용성 알파 시누 클레인의 순차 추출

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

알파 - 시누 클레인 (α-SYN) 단백질이 풍부 주로 신경 세포 내에서 발현, 그리고 다른 형태의 다수 존재한다 - 단량체, 테트라, 올리고머 및 섬유. 질병 중에 α-SYN은 불용성 단백질이 더 만드는 경향 올리고머 및 고 분자량의 응집체를 형성하는 구조적인 변화를 겪는다. 비정상적 응집 α-SYN 파킨슨 병 (PD), 루이체 복수 시스템 위축증 (MSA)와 치매의 신경 병리학 적 특징이다. 생화학 적 특성 및 강도 증가 세제 고속 초 원심 불용성 α-SYN하여 버퍼의 분석은 질병 진행과 연관된 α-SYN 병리의 개발을 결정하는 강력한 도구를 제공한다. 이 프로토콜은 사후 인간의 뇌 조직에서 점점 불용성 / 집계 α-SYN의 분리에 대해 설명합니다. 이 방법은 정상 및 비정상 α의 연구에 수정을 적용 할 수있다다른 α-SYN 돌연변이를 보유하는 형질 전환 동물 모델에서뿐만 아니라 각각의 병리와 관련된 단백질의 비정상적인 섬유의 예금을 특징으로 다른 신경 퇴행성 질환에서 -syn 생물학.

TBS, SDS와 그림 1의 프로토콜 다음 기저핵에서 추출 우레아 수용성 단백질은 젤에서 실행 α-SYN SYN-1 마우스 단일 클론 차 항체 immunoblotted했다. TBS 수용성 분획 검사 PD 제어의 경우 단량체 α-SYN (~ 14 KDa의 종) (그림 2A)의 존재를 표시. SDS 수용성 분획 또한 낮은 노출 오 (그림 2C)에 표시되는 연구의 경우 세 가지 아형에 풍부한 단량체 α-SYN을 보였다. PD의 경우에는 올리고머 (도 2C)이 될 가능성이 높은 노광 블롯에 표시되는 더 높은 분자량 (MW) α-SYN 종을 나타내었다. PD의 경우와 우레아 수용성 분획을 α-SYN 모노머, 올리고머 및 케이스를 대조군에 비해 증가 된 응집 종의 양을 나타내었다. 신피질 특발성 PD의 경우는 aggreg 더 많은 양을 보여<html> 변연계의 경우는 불용성 α-SYN의 중간 수준을 표시하는 동안 ated의, 종 α는-SYN. 모두 특발성 PD의 경우에서 SDS 및 요소 분획 변수 12 kDa의에서 절단 된 α-SYN 제품의 수준과 6 kDa의 20 설명한대로를 보여줍니다. 대조적으로, 제어 케이스 불용 또는 응집 SYN-α ​​(도 2e)을 나타내지 않았다. 세미 양적 밀도 측정은 신피질과 변연계 PD의 경우 집계 α-SYN의 녹지 자연 (그림 2B, 2D, 2 층)를 보여 α-SYN의 면역 조직 화학 염색을 사용 categoriesd으로 LB 부하의 양을 반영한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53415/53415fig1.jpg" /> 그림 1. 불용성 α -syn 추출 과정의 개략도.rget = &quot;_ 빈&quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53415/53415fig2.jpg" /> 그림 2. PD에서 α -syn 수준의 대표적인 면역 블롯 및 인체 조직을 제어 할 수 있습니다. TBS, SDS 및 요소 수용성 분획 기저핵 (제어) 특발성 PD 사례 및 신경 학적으로 정상 (PD의 경우 α-SYN 병리 항만 지역)에서 뇌는 웨스턴 면역 블롯을 이용하여 α-SYN의 존재에 대해 분석 하였다. 단백질 10 μg의 각 레인에로드했습니다. TBS 분획 (A)에서, 주로 α-SYN 단량체는 모든 경우에 존재한다. SDS 분획 (C)에서, α-SYN 올리고머의 일부는 주로 PD 조직에서 단량체와 함께 보인다. 우레아 분획 (C), 모노머, 올리고머 및 응집 α-SYN 가변적 PD 케이스을 reflectin 표현된다G 각각의 LB로드. 신경 학적으로 정상 샘플 단량체 α-SYN의 소량의 존재를 보여줍니다. 높은 LB 부하의 경우 일부에서 볼 수 있습니다 α-SYN 가능한 해산물을 유의하시기 바랍니다. 고체 화살표 머리 α-SYN의 단량체 형태를 나타냅니다. *이 아마도 이전에 20, 26 설명 된대로 α-SYN의 C 말단 절단 된 형태를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53415/53415fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 케이스 </td><td> 섹스 </td><td> 죽음의 세 연령 </td><td> 사후 지연 (시간) </td><td> 조직의 pH를 </td></tr><tr><td> 신피질 1 </td><td> 엠 </td><td> (82) </td><td> (40) </td><td> 6.3 </td></tr><tr><td> 신피질 2 </td><td> 에프</td><td> (75) </td><td> 35.3 </td><td> 6.4 </td></tr><tr><td> 변연 1 </td><td> 엠 </td><td> (81) </td><td> 28.5 </td><td> 6.2 </td></tr><tr><td> 변연 2 </td><td> 에프 </td><td> 79 </td><td> 36.5 </td><td> 6.2 </td></tr><tr><td> 제어 1 </td><td> 엠 </td><td> (80) </td><td> (38) </td><td> 6.1 </td></tr><tr><td> 제어 2 </td><td> 에프 </td><td> (83) </td><td> 32.5 </td><td> 6.3 </td></tr></tbody></table> 사용되는 경우 표 1. 제한 인구 통계

여기에서는 사후 인간 뇌 조직에서 점점 더 불용성/응집된 알파-시누클레인(α-syn)을 분리하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 세제 강도가 증가하는 완충액과 고속 초원심분리 기술을 통해 병든 조직과 그렇지 않은 조직에서 α-syn 응집의 다양한 특성을 검사할 수 있습니다.

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

이 방법론의 전반적인 목표는 사후 파킨슨병 환자의 뇌에서 수용성 및 비수용성 알파-시누클레인을 추출하는 것입니다. 이 방법은 파킨슨병 연구의 주요 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 일반적인 실험실 시약과 기구를 사용하는 비교적 간단한 기술이라는 점입니다.필요한 용액과 완충액을 준비한 후, 0.5 g의 냉동 기저핵 조직 샘플을 작은 페트리 접시에 놓는 것으로 시작합니다. 멸균된 메스 날을 사용하여 1 mm 크기의 정사각형 조각으로 빠르게 다집니다. 다진 조직을 15 mL 튜브에 수집하고, 튜브에 10배 부피의 얼음처럼 차가운 1X TBS를 첨가합니다.기계식 균질기를 사용하여 20,000 rpm에서 10초 동안 시료를 균질화합니다. 그 후 얼음 위에서 2분간 냉각합니다. 균질화 과정을 3회 반복하며, 매회 얼음 위에서 냉각합니다.균질액을 4°C에서 10,000 gs로 5분 동안 원심분리합니다. 조균질액 상층액을 폴리카보네이트 원심분리 튜브로 옮기고, 4°C에서 100,000 gs로 1시간 동안 원심분리합니다. 상층액을 얼음 위에 놓인 냉각 튜브로 옮겨 TBS 가용 분획으로 보관합니다.1X TBS 버퍼 5배 부피로 세척한 후, 4°C에서 100,000 gs로 15분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 세척 과정을 반복합니다.초원심분리 단계 사이의 펠렛을 철저히 세척하는 것이 이 절차의 성공에 매우 중요합니다. SDS 침전을 방지하기 위해 시료가 10 °C에 도달하도록 한 후, 5배 부피의 1X TBS-SDS를 추가하고 실온에서 20 kHz로 10초 동안 초음파 처리하여 최종 펠렛을 재현탁합니다. 25 °C에서 100,000 g로 30분 동안 초원심분리합니다.초원심분리 후 상청액을 얼음 위에 놓인 냉각 튜브로 옮겨 SDS 가용 분획으로 보관하십시오. 펠릿에 실온의 1X TBS-SDS 완충액 5배 부피를 첨가하고, 25°C에서 100,000 gs로 15분 동안 원심분리하십시오. 세척 완충액을 제거하고 세척 과정을 반복하십시오.상층액을 제거한 후, 1X TBS-SDS-Urea 50 µL를 첨가하고 20 kHz로 설정된 초음파 분쇄기로 10초 동안 가용화합니다. 이 샘플을 urea 가용 분획으로 표시합니다. 이 과정에서 모든 불용성 단백질이 완전히 추출되었는지 철저히 확인하는 것이 필수적입니다.단백질 분석 시약과 호환되도록 TBS-SDS-Urea 샘플을 1X TBS 버퍼와 1:1 비율로 희석하고, 제조사의 프로토콜에 따라 상용 단백질 분석 키트를 사용하여 각 분획의 총 단백질 함량을 분석합니다. 향후 동결-해동 반복 횟수를 줄이기 위해 샘플을 10% glycerol이 포함된 20 µL씩의 소분량으로 나누어 -80 °C에 보관합니다. 표준 기술을 사용하여 TBS, TBS-SDS 및 TBS-SDS-Urea 추출물 10 µL와 분자량 마커를 MOPS를 러닝 버퍼로 사용하는 10-well, 4~12% Bis-Tris 폴리아크릴아마이드 겔에 로딩합니다.젤을 200V에서 1시간 동안 또는 로딩 버퍼의 청색 염료가 젤 바닥에 도달할 때까지 전기영동합니다. 나일론 막을 100% methanol에 적신 후, 20% methanol이 포함된 전사 버퍼에 담급니다. 단백질 쪽과 분자량 표준 마커의 방향을 확인하기 위해 블롯에 식별 표시를 합니다.젖은 여과지와 함께 멤브레인으로 젤을 샌드위치처럼 끼웁니다. 40V에서 2시간 동안 전이(transfer)를 수행합니다. 1X PBS-T에 용해된 5% BSA 용액으로 70rpm으로 흔들어주며 30분 동안 블로킹하여, 1차 항체가 멤브레인에 비특이적으로 결합하는 것을 방지합니다.PBS-T에 1:750로 희석한 6 mL의 alpha-synuclein 1차 항체 Syn-1을 사용하여 4°C에서 하룻밤 동안 배양하여 단백질 블롯을 탐지합니다. 다음 날, 1X PBS-T로 5분씩 3회 막을 세척합니다. 그 후, PBS-T에 1:2,000로 희석한 적절한 HRP 결합 2차 항체와 함께 블롯을 30분 동안 배양합니다.이전과 동일하게 1X PBS-T로 멤브레인을 세척합니다. 암실에서 제조사의 지침에 따라 블롯을 강화 화학 발광 용액에 담급니다. 블롯을 클링 랩으로 덮고, 자동 방사선 촬영법을 사용하여 신호를 캡처합니다.이미징 후, western blot을 6 mL의 western blot stripping buffer와 함께 10분 동안 지속적으로 흔들어 알파-시누클레인(alpha-synuclein) 항체 신호를 제거합니다. western blot 과정을 반복하여 1:8,000로 희석한 beta-actin 1차 항체로 막을 탐지합니다. 최종 이미지를 스캔하여 Tiff 이미지로 변환하고, 정량화를 위해 NIH ImageJ를 사용하여 밀도를 측정합니다.다음 이미지는 PD 및 대조군 인간 기저핵 조직의 alpha-synuclein 수준을 나타내는 대표적인 면역블롯입니다. western 면역블롯을 사용하여 TBS, SDS 및 urea 가용 분획 내 alpha-synuclein의 존재 여부를 분석하였습니다. 각 레인에 10 milligrams의 단백질을 로딩하였습니다.TBS 분획에서는 모든 사례에서 alpha-synuclein 단량체가 관찰됩니다. 별표는 alpha-synuclein의 C-말단 절단 형태를 나타낼 가능성이 있습니다. SDS 분획에서는 PD 조직의 실선 화살표로 표시된 바와 같이, 단량체와 함께 일부 alpha-synuclein 올리고머가 관찰됩니다.요소 분획(urea fraction)에서 단량체(monomer), 올리고머(oligomer) 및 응집된 alpha-synuclein은 각각의 루이 소체(Lewy body) 부하를 반영하여 PD 사례마다 다양하게 발현됩니다. 신경학적으로 정상인 대조군 샘플에서는 소량의 단량체 alpha-synuclein만이 관찰됩니다. 이 단백질 추출 기술을 숙달하면, 적절히 수행했을 때 하루 만에 추출을 완료하고 다음 날 웨스턴 면역블롯(western immunoblot)을 진행할 수 있습니다.이 기술의 개발 이후, 루이 소체 생물학 분야의 연구자들은 병리적 인간 조직 및 생체 내 동물 모델에서 불용성 및 응집된 alpha-synuclein 종을 탐구할 수 있게 되었습니다. 고정되지 않은 인간 조직을 다룰 때는 예방 조치가 필요하며, 모든 취급 절차 동안 장갑과 실험복을 착용해야 함을 잊지 마십시오.

sequential-extraction-soluble-insoluble-alpha-synuclein-from

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 피부 생검 절편에서 신경퇴행성 질환 특이적 알파-시누클레인 응집체를 검출하기 위한 면역형광 분석을 보여줍니다. 자유 부유 면역 염색은 피부 뉴런의 카르복실 말단 가수분해효소와 알파-시누클레인 응집체를 형광 라벨링하는 데 사용됩니다. 컨포칼 현미경 하에서, 두 항체로부터 형광을 가진 세포는 진피 뉴런에 알파-시누클레인 응집체가 존재함을 나타냅니다.

피부 생검 절편에서 알파-시누클레인 응집체를 검출하기 위한 면역형광 분석

이 비디오는 알파-시누클레인 미리 형성된 섬유로 전처리된 배아 마우스 도파민 뉴런에서 알파-시누클레인 축적을 정량화하는 과정을 보여줍니다. 면역 형광을 사용하여 알파-시누클레인 응집체를 포함하는 도파민 뉴런을 고정, 염색 및 정량화하는 단계를 설명합니다.

Primary Embryonic Mouse Dopamine Neurons에서 알파-시누클레인 축적 연구

출처: Bétemps, D., et al.,  Detection of Disease-associated α-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated α-synuclein. J. Vis. 특급 (2015). 이 비디오는 ELISA를 사용하여 형질전환 마우스의 뇌 조직에서 신경퇴행성 질환 관련 단백질 α-synuclein을 검출하는 절차를 보여줍니다. 단계에는 조직 균질화, 원심분리 및 α-synuclein 단백질의 ELISA 검출이 포함되어 질병 관련 형태를 정량화합니다.

ELISA를 사용하여 신경퇴행성 질환 관련 단백질 α-Synuclein 검출

바이오패닝 기술과 원자력 현미경을 사용하여 낮은 농도에서도 모든 생물학적 물질에 존재하는 질병 특이적 단백질 변이체에 대한 항체를 획득하는 음성 및 양성 바이오패닝 시스템을 만들었습니다.  우리는 근위축성 측삭 경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis)과 관련된 TDP-43 단백질 변이체에 대한 항체를 획득하는 데 성공했습니다.

루게릭 병에 TDP-43 변종 형태론 특정 시약의 분리에 대한 소설 원자 힘 현미경 기반 Biopanning

새로운 정량적 접근법을 제공하는 ELISA가 설명되었습니다. 이는 시누클레이노파시(synucleinopathy)의 형질전환 마우스 모델(M83)에서 질병 관련 α-시누클레인(αSD)을 특이적으로 검출하기 위해 인산화된 Ser129 αS 형태 또는 단백질의 C-말단 부분에 대한 여러 항체를 사용합니다.

인간 A53T를 과발현 형질 전환 마우스의 뇌에 강화 된 ELISA에 의한 질병 관련 α-synuclein의 검출은 α-synuclein의 돌연변이

이 프로토콜의 목표는 vivo에서집계 하는 알파 synuclein의 형성을 복제 하는 셀 기반 시스템을 제공 하는입니다. 세포내 알파 synuclein 포함은 국제화에 의해 주 뉴런에 시드는 고 세의 전파 관리 네이티브 microsomes 관련 알파 synuclein 집계 병 알파 synuclein 유전자 변형 쥐에서 분리.

소 대형의 강력한 셀 모델로 기본 신경 하 Microsomes 관련 알파 synuclein 집계의 외 인 관리

여기에서, 우리는 파킨슨 병및 파킨슨 병에 관여하는 알파 시누클레인의 질병 특정 형태 변이체의 식별을 허용하는 피부 생검 섹션에 자유 부동 간접 면역 형광 분석에 대한 프로토콜을 제시하고 말초 신경계.

자유 부동 면역 형광 분석에 의하여 절단 말초 신경 섬유에 있는 알파 Synuclein 응집체를 표적으로 하는

이 기사의 목표는 단량체 성 알파-sy뉴 클레 인, 후속 품질 관리 및 생체 내에서 미리 형성 된 섬유 소의 사용 으로부터 피 브 릴의 생성에 필요한 단계를 간략하게 설명 하는 것입니다.

모노 머 로부터 미리 형성 된 섬유 소의 알파-시 뉴 클레 인 생성 및 생체 내 사용

여기서, 우리는 1 차 마우스 도파민 뉴런에 신경 α-synuclein 축적을 연구하기 위하여 상세한 프로토콜을 제시합니다. 뉴런의 인광α-시뉴클레인 골재는 미리 형성된 α-시뉴클레인 피브릴로 유도된다. 면역형으로 표지된 세포와 편견없는 이미지 분석의 자동화된 이미징은 α-synuclein 축적을 억제하는 약물의 중간-고처리량 스크리닝에 적합한 강력한 프로토콜을 만듭니다.

1 차 배아 마우스 중뇌 도파민 뉴런에서 사전 형성 된 피브릴 유도 α-시뉴클레인 축적 연구

이 연구는 파킨슨 병의 전임상 모델에서 신경 염증, 신경 변성 및 운동 장애를 유도하는 데 필요한 벡터 용량과 노출 시간을 분석합니다. 인간 α시누클레인을 코딩하는 이들 벡터는 파킨슨병과 관련된 시누클레인 병리를 재분석하기 위해 흑질로 전달된다.

인간 α-시누클레인을 코딩하는 아데노 관련 바이러스 벡터에 의해 유도된 파킨슨병 마우스 모델 분석

본 프로토콜은 α-synuclein 응집체의 비강 내 투여 방법을 설명합니다. 이 방법은 파킨슨병에서 후각 점막에서 후각구까지 α-synuclein 전파에 대한 통찰력을 제공합니다.

α-Synuclein 응집체의 비강 내 투여 기법

배우세요 파킨슨병 뇌 조직에서 수용성 및 불용성 알파-시누클레인을 추출하는 방법을. 초고속 원심분리와 웨스턴 블롯팅을 활용하여 단백질 응집 특성을 분석하고 병리 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

파킨슨 뇌에서, 수용성 알파 시누 클레인의 순차 추출

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