파킨슨 뇌에서, 수용성 알파 시누 클레인의 순차 추출

이 방법론의 전반적인 목표는 사후 파킨슨병 뇌에서 용해성 및 불용성 알파-시누클레인을 추출하는 것입니다. 이 방법은 파킨슨병 연구의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 일반적인 실험실 시약과 기기를 사용하는 비교적 간단한 기술이라는 것입니다.

필요한 용액과 완충액을 준비한 후 0.5g의 냉동 기저핵 조직 샘플을 작은 페트리 접시에 올려 놓는 것으로 시작합니다. 멸균 메스 날을 사용하여 1mm 정사각형 조각으로 빠르게 다집니다. 다진 조직을 15ml 튜브에 모으고 튜브에 얼음처럼 차가운 10X TBS 10볼륨을 추가합니다.

20, 10 초 동안 000 rpm에서 기계식 균질화기를 사용하여 샘플을 균질화하십시오. 그런 다음 얼음에서 2분 동안 식힙니다. 균질화를 세 번 반복하고 매번 얼음에서 식힙니다.

10, 섭씨 4도에 5 분 동안 000 GS에 균질산물을 분리기로 만드십시오. 조잡한 균질산염 상등액을 폴리탄산염 분리기 관으로 옮기고, 100, 4 섭씨 온도에 1 시간 동안 000 GS에 분리기. 상층액을 얼음 위의 냉각된 튜브로 옮기고 이를 TBS 용해성 분획으로 유지합니다.

1X TBS 완충액의 5개 양에서 세척하고, 100, 4 섭씨 온도에 15 분 동안 000 GS에 분리기를 세척하십시오. 상층액을 흡인하고 버립니다. 그런 다음 세탁을 반복하십시오.

초원심분리 단계 사이에 펠릿을 철저히 세척하는 것은 이 절차의 성공에 매우 중요합니다. SDS 침전을 피하기 위해 샘플이 섭씨 10도의 온도에 도달하도록 한 후 1X TBS-SDS를 5 부피로 추가하고 실온에서 20 킬로 헤르츠에서 10 초 동안 초음파 처리하여 최종 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 100, 25 섭씨 온도에 30 분 동안 000 GS에 Ultracentrifuge.

초원심분리 후, 상등액을 얼음 위의 냉각된 튜브로 옮기고 SDS 용해성 분획으로 유지합니다. 펠릿에 실온 1X TBS-SDS 버퍼 5 부피를 추가하고 섭씨 25도에서 15 분 동안 100, 000gs에서 원심 분리합니다. 세척 버퍼를 버리고 세탁을 반복하십시오.

상등액을 버린 후 50 마이크로 리터의 1X TBS-SDS-Urea를 넣고 20 킬로 헤르츠로 설정된 초음파 처리기를 사용하여 10 초 동안 용해시킵니다. 이 샘플을 요소 용해성 분획으로 표시합니다. 절차에서 모든 불용성 단백질이 추출되었는지 철저히 확인하는 것이 중요합니다.

단백질 분석 시약과의 호환성을 허용하기 위해 1X TBS 버퍼와 일대일로 TBS-SDS-Urea 샘플을 희석하고 제조업체의 프로토콜에 따라 상용 단백질 분석 키트를 사용하여 총 단백질 함량에 대해 각 분획을 분석합니다. 향후 동결-해동 주기를 줄이기 위해 10%글리세롤이 포함된 20마이크로리터 분취액으로 샘플을 분취하고 섭씨 마이너스 80도에서 보관합니다. 표준 기술을 사용하여 10마이크로리터의 TBS, TBS-SDS 및 TBS-SDS-Urea 추출물을 10웰, 4-12% Bis-Tris 폴리아크릴아미드 겔에 분자량 마커로 로드하고 MOPS를 러닝 버퍼로 사용합니다.

200볼트에서 1시간 동안 또는 로딩 버퍼의 파란색 염료가 젤 바닥에 도달할 때까지 젤을 실행합니다. 나일론 멤브레인을 100% 메탄올에 적신 다음 20% 메탄올을 함유한 전달 버퍼에 담그십시오. 단백질 측면과 분자량 크기 마커의 방향을 결정하기 위해 블롯에 식별 표시를 만듭니다.

젖은 여과지와 함께 멤브레인이 있는 젤을 끼웁니다. 40볼트에서 2시간 동안 전송을 수행합니다. 1X PBS-T에서 5%BSA 용액을 70rpm으로 진탕하여 30분 동안 차단하여 1차 항체가 멤브레인에 비특이적으로 결합하는 것을 방지합니다.

알파-시누클레인 1차 항체 Syn-1을 6밀리리터로 희석하여 섭씨 4도에서 하룻밤 사이에 PBS-T에 750으로 배양하여 단백질 블롯을 조사합니다. 다음날, 1X PBS-T로 멤브레인을 5분 동안 3회 세척합니다. 그런 다음 PBS-T에서 1 내지 2, 000으로 희석된 적절한 HRP 접합 2차 항체로 블롯을 30분 동안 배양합니다.

이전과 같이 1X PBS-T로 멤브레인을 세척합니다. 어두운 방에서 제조업체의 지침에 따라 향상된 화학발광 용액에 블롯을 담그십시오. 접착 필름으로 얼룩을 덮고 자동 방사선 촬영을 사용하여 신호를 캡처합니다.

이미징 후, 6ml의 웨스턴 블롯 스트리핑 버퍼로 웨스턴 블롯을 10분 동안 지속적으로 흔들어 블롯을 배양하여 알파-시누클레인 항체 신호의 블롯을 제거합니다. 웨스턴 블롯 절차를 반복하여 1 - 8, 000 희석에서 beta-actin 1차 항체로 멤브레인을 프로브합니다. 최종 이미지를 스캔하여 Tiff 이미지로 변환하고 정량 분석을 위해 NIH ImageJ를 사용하여 밀도를 측정합니다.

다음 이미지는 PD에서 알파-시누클레인 수치의 대표적인 면역 블롯이며 인간 기저핵 조직을 제어합니다. TBS, SDS 및 우레아 용해성 분획은 서부 면역 블롯을 사용하여 알파 시누클레인의 존재를 분석하였다. 10mg의 단백질이 각 레인에 적재되었습니다.

TBS 분획에서는, 알파 synuclein 단위체는 모든 케이스에서 출석합니다. 별표는 아마도 알파-시누클레인의 C-말단이 잘린 형태를 나타낼 수 있습니다. SDS 분획에서는, 알파 synuclein의 몇몇 oligomers는 PD 조직에 있는 단단한 화살촉에 의해 표시된 단량체와 함께 보입니다.

요소 분획에서 단량체, 올리고머 및 응집된 알파-시누클레인은 PD 사례에서 다양하게 발현되어 각각의 루이소체 부하를 반영합니다. 신경학적으로 정상적인 대조군 샘플은 소량의 단량체 알파-시누클레인만 존재함을 보여줍니다. 이 단백질 추출 기법을 숙달하면 근무일 하루 내에 완료할 수 있으며, 제대로 수행되면 다음 날 웨스턴 면역블롯을 사용할 수 있습니다.

그것의 발달 후에, 이 기술은 병리학적인 인간적인 조직 그리고 생체 내 동물성 모형에서 불용해성 및 집합된 알파 synuclein 종을 탐구하기 위하여 Lewy 몸 생물학의 분야에 있는 연구원을 위한 길을 닦았습니다. 고정되지 않은 인체 조직으로 작업하려면 예방 조치가 필요하며 모든 취급 절차를 위해 장갑과 실험실 가운을 착용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.