라이트 기반 효소 탈 카르 복 실화

이 실험의 전반적인 목표는 가시광선을 사용하여 효소 반응을 유도하는 것입니다. 이 접근 방식에서는 가벼운 반응 조건에서 지방산을 말단 알카인으로 변환하는 데 빛이 사용됩니다. 탈카르복실화는 CC 결합의 파괴를 필요로 합니다.

그리고 이 결합은 매우 안정적이어서 매우 어려운 반응입니다. 빛의 사용은 이러한 어려운 반응을 달성하기 위한 지속 가능한 접근 방식입니다. 이 방법에 대한 아이디어는 효소의 불활성화로 이어지는 과산화수소를 반응에 직접 첨가하려고 했을 때 처음 떠올랐습니다.

이 기술의 가장 큰 장점은 꾸준한 양의 과산화수소를 공급한다는 것입니다. 먼저, 효소를 특성화하기 위해 광 구동 바이오 촉매를 위해 정제된 OleT를 사용했습니다. 나중에 우리는 또한 산업 응용 프로그램의 개발에 중요할 미가공 추출물을 테스트했습니다.

텍스트 프로토콜에 기술된 바와 같이 합성 OleT 유전자를 발현 벡터에 클로닝하고 플라스미드를 E.Coli로 형질전환한 후, 3밀리리터의 LB 배지를 포함하는 2개의 시험관에 1밀리리터당 100마이크로그램의 암피실린을 접종합니다. 사전 배양을 셰이커에서 15시간 동안 배양합니다. 2 밀리리터의 배양액을 200 밀리리터의 LB로 희석하고 1 리터 플라스크 2 개에 암피실린을

배양물이 0.6에서 0.8 사이의 600나노미터에서 광학 밀도에 도달할 때까지 섭씨 37도 및 180RPM의 셰이커에서 플라스크를 배양합니다. 다음으로, 배양액에 0.5 밀리몰의 델타 아미노레불린산을 추가합니다. 그런 다음 테트라사이클린을 밀리리터당 0.2마이크로그램으로 플라스크에 첨가하여 세포를 유도합니다.

배양물을 섭씨 20도, 분당 180분에서 15시간 동안 배양합니다. 유도 후 배양물을 원심분리기 튜브에 넣고 튜브를 12000배 G와 섭씨 4도에서 20분 동안 원심분리합니다. 상등액을 버리십시오.

50ml의 얼음처럼 차가운 Tris 버퍼를 피펫팅하여 펠릿을 재현탁하고 현탁액을 원뿔형 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 4000회 G와 섭씨 4도에서 15분 동안 원심분리를 계속합니다. 상등액을 버리고 반복적인 피펫팅을 통해 각 펠릿을 3ml의 완충액에 재현탁합니다.

3 개의 30 초 사이클로 초음파 처리하여 세포를 용해시키고 사이클 사이에 1 분 동안 일시 중지하십시오. 다음으로, 15000 번 G와 섭씨 4도에서 20 분 동안 용해물을 원심 분리 한 다음 세포 프리 추출물을 원추형 원심 분리 튜브에 조심스럽게 피펫으로 넣으십시오. 광 구동 바이오 촉매를 위한 미처리 추출물을 준비하기 위해 1개의 무세포 추출물 3ml를 10킬로달톤 원심분리기 필터에 옮기고 섭씨 4도에서 4000배 G로 원심분리하여 저분자를 제거합니다.

단백질을 Tris 3ml에 재현탁합니다. 광 구동 바이오 촉매에서 OleT의 활성을 특성화하려면 단백질을 정제해야 합니다. 단백질 정제를 시작하려면 3ml의 무세포 추출물을 평형 니켈 NTA 스핀 컬럼에 로드합니다.

하단 플러그와 나사 캡으로 기둥을 밀봉합니다. 그리고 수지가 고르게 분포될 때까지 가볍게 흔듭니다. 오버헤드 셰이커에서 컬럼을 배양하여 계속합니다.

그런 다음 컬럼을 원심분리합니다. 다음으로, 세척 버퍼(Wash) 완충액 1ml를 추가하고 700배 G에서 2분 동안 원심분리하여 컬럼을 세척합니다. 세탁을 두 번 더 반복합니다.

세척 후 컬럼을 원뿔형 원심분리기 튜브에 넣고 각 컬럼에 1ml의 용리 완충액을 추가합니다. 700배 G에서 튜브를 2분 동안 원심분리하고 용출을 두 번 더 반복합니다. 결합된 컬럼 추출물을 10킬로달톤 원심분리기 필터에 넣고 G 4000배와 섭씨 4도에서 원심분리하여 효소에서 용리에 사용되는 이미다졸을 분리합니다.

마지막으로, 텍스트 프로토콜에 표시된 대로 단백질의 순도와 농도를 측정합니다. 바이오 형질전환 절차를 시작하려면 먼저 증류수에 테르지톨과 같은 계면활성제 10%와 스테아르산 28.4mg을 첨가하여 10밀리리터의 10밀리몰 원액을 만듭니다. 스테아르산이 완전히 용해될 때까지 섭씨 60도의 가열 챔버에서 용액을 가열합니다.

이 용액을 사용하여 다음 프로토콜에 따라 반응 혼합물을 준비합니다. FMN, EDTA, 완충액 및 스테아르산을 두 개의 투명 유리관에 넣고 섭씨 25도의 수조에서 저어줍니다. 계속해서 정제된 효소 또는 미처리 추출물을 밀리리터당 200마이크로그램을 튜브에 추가합니다.

그리고 2cm 거리에서 투명한 LED 전구로 조명을 비춥니다. 다음으로, 200마이크로리터의 37% 염산이 미리 채워진 튜브에 넣어 특정 시점에 200마이크로리터 샘플을 채취하여 반응을 중지합니다. 그런 다음 5마이크로리터의 10밀리몰 미리스틱 산 용액을 각 샘플에 내부 표준물질로 추가합니다.

반응 생성물을 분석하려면 튜브에 500 마이크로 리터의 에틸 아세테이트를 두 번 첨가하십시오. 그(것)들을 섞기 위하여 관을 거꾸로 하고 13, 000 시간 G.Next에, 극농액의 400 마이크로리터를 마이크로 분리기 관으로 옮기고 압축공기를 가진 관에 온화하게 불어서 그(것)들을 증발시키십시오. 튜브에 200마이크로리터의 MSTFA를 추가합니다.

그리고 혼합물을 섭씨 60도에서 30분 동안 배양하여 분석 전에 샘플을 유도체화합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 온도 프로파일을 사용하여 화염 이온화 검출기가 장착된 가스 크로마토그래프에 4마이크로리터 샘플을 주입하여 반응 생성물을 분석합니다. 다음으로, 질량 분석기에 연결된 가스 크로마토그래프를 사용하여 각 반응 샘플에서 형성된 하나의 헵타데칸과 베타 하이드록시산의 비율을 결정합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 오븐 온도 및 질량 분석기 설정을 사용합니다. 각 시료를 1마이크로리터씩 가스 크로마토그래프에 주입하고 크로마토그램을 기록합니다. 마지막으로, 각 샘플에 대한 GCMS 크로마토그램을 모니터링하고 제조업체의 프로토콜에 따라 분석합니다.

효소 반응으로 인한 생성물의 분자량은 질량 분석기에 연결된 가스 크로마토그래프를 사용하여 측정되었습니다. 더 긴 아실 사슬을 가진 지방산의 경우, 효소 OleT는 길이가 다른 올레핀으로 탈카르복실화를 우선적으로 촉매합니다. 생물 변형 반응의 샘플은 화염 이온화 검출기가 장착된 가스 크로마토그래프로 분석되었습니다.

스테아르산의 탈카르복실화는 1개의 헵타데칸을 2-하이드록시 스테아르산으로 3.3:1 혼합물로 전환한 99%의 스테아르산과 함께 하이드록실화 반응보다 3배 빠르게 발생하는 것으로 나타났습니다. 일단 마스터하면 빛에 의한 생체 촉매는 내가 제대로 수행한다고 말하면 몇 시간 안에 완료할 수 있습니다. 광 촉매 작용에서 과제는 유용한 반응을 빛의 수확과 연결하는 것입니다.

우리의 경우, 우리는 FMN 분자 내의 빛을 광감작제로 가지고 있으며 과산화수소인 전달 분자를 통해 이를 효소에 연결합니다.