효소 아세테이트 키나제의 아세테이트 - 형성 활동의 직접적인 탐지

본 실험의 목적은 아세테이트 키나아제(acetate kinase)의 아세테이트 생성 활성을 직접 측정하는 것입니다. 아세틸 포스페이트(acetyl phosphate)와 DP 기질이 포함된 반응 혼합물에 효소를 첨가하여 반응을 개시합니다. 그 후 하이드록실아민 염산염(hydroxy lamine hydrochloride)을 첨가하여 남아 있는 아세틸 포스페이트를 아세틸 하이드록실레이트(acetyl hydroxylate)로 전환합니다.

아세틸 하이드록실레이트를 측정 가능한 색상의 제이철 하이드록실레이트 복합체로 전환하기 위해 현색액을 첨가하십시오. 반응에서 소비된 아세틸 인산 기질의 양을 기반으로 분광 광도법을 통해 효소 반응 속도 매개변수를 결정할 수 있습니다. 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 장점은 ATP 생성과 ADP 환원의 결합이 아닌, 아세틸 인산 소비를 직접 측정한다는 점입니다. 본 분석법은 ATP 생성에 의존하지 않으므로, ATP 대신 무기 인산(power phosphate)을 생성하는 새로운 그룹의 아세테이트 키나아제에도 사용할 수 있습니다. 6~8개 지점의 표준 곡선을 작성하려면, 100 mM Tris 버퍼로 아세틸 인산 스톡 용액을 희석하여 최종 시료 부피를 300 µL로 맞추십시오. 또한 아세틸 인산이 포함되지 않은 대조군 시료를 포함하십시오. 모든 시료를 37 °C 가열 블록에서 1분 동안 평형화하십시오.

이제 2 M 하이드록실아민 하이드로클로라이드(hydroxy lamine hydrochloride) 50 µL를 첨가하고, 세 번 흔들어 섞은 후 60 °C 가열 블록에서 5분 동안 배양합니다. 그 다음 발색액 100 µL를 첨가하고 세 번 흔들어 섞은 후, 상온에서 최소 1분 동안 색이 발색되도록 둡니다. 분광광도계용 플라스틱 큐벳을 사용하여 샘플을 원심 분리합니다.

샘플을 540 nanometers에서 측정하십시오. 적절한 데이터 분석 및 그래프 소프트웨어를 사용하여 540 nanometers에서의 흡광도 대 acetyl phosphate의 micromoles에 대한 표준 곡선을 생성하십시오. r squared 값을 계산하십시오.

반응 혼합물을 300 µL씩 마이크로 원심분리 튜브에 분주합니다. 효소를 넣지 않은 대조군 반응을 반드시 포함하십시오. 튜브를 37 °C에서 1분 동안 평형화합니다. 여러 반응을 수행하는 경우, 특정 시간 간격으로 튜브에 효소를 첨가하고 각 튜브를 즉시 37 °C 히트 블록으로 되돌려 놓습니다.

5분 후, 2 M hydroxylamine hydrochloride 50 µL를 첨가하여 혼합하고 60 °C에서 5분 동안 배양합니다. 그다음 발색 용액 100 µL를 첨가하여 혼합하고, 발색을 위해 상온에 둡니다. 이후 시료를 18,000 ×g에서 1분 동안 원심 분리합니다.

540 nanometers에서 흡광도를 측정하십시오. 아세틸 인산 표준 곡선과 비교하여 존재하는 아세틸 인산의 양을 결정합니다. 데이터는 플롯을 그리고 McKayla Cementin 방정식에 맞추어 반응 속도 매개변수를 결정할 수 있습니다.

본 분석법은 아세틸 인산 기질의 소비량을 결정하여 아세테이트 형성 방향의 아세테이트 키나아제 활성을 측정합니다. 효소 반응 중 일정 시간이 지난 후 남아 있는 아세틸 인산은 아세틸 Oxybate로 전환되고, 이후 540 nm에서 측정 가능한 붉은색의 ferric hydroxy ate 복합체로 전환됩니다. 540 nm에서의 흡광도 대 아세틸 인산 마이크로몰 수치를 나타내는 전형적인 표준 곡선의 기울기는 아세틸 인산 1 µmol당 1.2332 흡광도 단위입니다.

결과적으로 도출된 0.99의 r squared 값은 데이터가 여기에 묘사된 선형 방정식에 잘 부합함을 나타냅니다. 이 분석법은 다양한 효소 표본에 대한 acetyl phosphate의 KM 값을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 5 millimolar의 DP와 다양한 농도의 acetyl phosphate 조건에서, methanol Sarina thermophilic으로부터 정제된 recombinant acetate kinase는 각 기질에 대해 표준 McKayla cementin 유사 역학을 따르며, 그 결과 acetyl phosphate의 겉보기 KM 값은 0.27 ± 0.01 millimolar로 나타났습니다.

표준 결합 분석법과 달리, 이 직접 분석법은 TP 이외의 기질을 이용하는 아세테이트 키나아제의 활성을 측정할 수 있습니다. 예를 들어, 피로인산 생산성 Entamoeba histolytica 아세테이트 키나아제에 의한 acetyl phosphate 이용 시, 반응 혼합물에서 DP 대신 인산나트륨을 대체하여 사용하였습니다. 그 결과 얻은 곡선은 0.50 ± 0.006 mM의 겉보기 KM 값을 나타냅니다. 이 영상을 시청하고 나면, 소비된 acetyl phosphate의 양을 결정함으로써 아세테이트 키나아제 활성을 직접 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

재현 가능한 결과를 얻기 위한 핵심 요인은 각 단계, 특히 효소 첨가 및 혼합 단계에서 일관성을 유지하는 것입니다.