효소 아세테이트 키나제의 아세테이트 - 형성 활동의 직접적인 탐지

이 실험은 아세테이트 키나아제의 아세테이트 형성 활성을 직접 측정하는 것을 목표로 합니다. 아세틸 포스페이트와 DP 기질을 함유하는 반응 혼합물에 효소를 첨가하여 반응을 시작합니다. 그런 다음 하이드록시 라민 하이드로클로라이드를 첨가하여 남은 아세틸 포스페이트를 아세틸 하이드록실레이트로 변환합니다.

개발 용액을 추가하여 아세틸 하이드록실레이트를 측정할 수 있는 착색된 수산화철 복합체로 변환합니다. 반응 결과에서 소비된 아세틸 인산염 기질의 양에 따라 Spectro 측광을 통해 효소 역학 파라미터를 측정할 수 있습니다. 기존 방법에 비해 이 기술의 장점은 TP 생산을 A DP의 감소와 결합하는 것이 아니라 아세틸 인산염 소비량의 직접 측정을 기반으로 한다는 것입니다. 이 분석은 TP 생산에 의존하지 않기 때문에 TP 대신 파워 포스페이트를 생성하는 새로운 아세테이트 키나아제 그룹에 사용할 수 있습니다.6 내지 8 포인트의 표준 곡선에 대해 100 밀리몰 트리스에서 아세틸 인산염 원액을 300 마이크로리터의 최종 샘플 부피로 희석하고 300 마이크로리터의 최종 샘플 부피로 아세틸 포스페이트가 없는 대조 샘플도 포함합니다. 일분.

이제 50 마이크로 리터의 2 몰 하이드 록시 라민 하이드로 클로라이드를 넣고 3 번 흔들어 섞은 다음 섭씨 60도 열 블록에서 5 분 동안 배양합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 현상 용액 혼합물을 3회 흔들어 넣고 실온에서 최소 1분 동안 색상이 발현되도록 합니다. 분광 광도계용 플라스틱 큐벳을 사용하여 샘플을 원심 분리합니다.

540나노미터에서 샘플을 측정합니다. 적절한 데이터 분석 및 그래프 작성 소프트웨어를 사용하여 마이크로몰의 아세틸 인산염에 대한 540나노미터의 표준 흡광도 곡선을 생성하십시오. r 제곱 값을 계산합니다.

300마이크로리터의 반응 혼합물 분취액을 마이크로 원심분리기 튜브에 분배합니다. 섭씨 37도에서 1분 동안 효소 평형 튜브가 없는 대조 반응을 포함하는 것을 잊지 마십시오. 여러 번 반응이 수행되는 경우 특정 시간 간격으로 튜브에 효소를 추가하고 즉시 각 튜브를 섭씨 37도의 열 블록으로 되돌립니다.

5 분 후, 50 마이크로 리터의 2 몰 하이드 록시 라민 하이드로 클로라이드를 넣고 혼합하여 섭씨 60도에서 5 분 동안 배양합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 현상 용액을 넣고 혼합하여 발색을 위해 실온에 놓습니다. 다음 18, 1 분 동안 000 시간 G에 분리기 표본.

540나노미터에서 흡광도 측정을 진행합니다. 아세틸 인산염 표준 곡선과 비교하여 존재하는 아세틸 인산염의 양을 측정합니다. 데이터를 플로팅하고 운동 매개변수를 결정하기 위해 McKayla Cementin 방정식에 맞출 수 있습니다.

이 분석은 아세테이트 형성 방향에서 아세테이트 키나아제 활성을 측정하기 위해 아세틸 포스페이트 기질의 소비를 결정합니다. 효소 반응 중 일정 시간이 지난 후 잔류하는 아세틸 포스페이트는 아세틸 옥시베이트로 전환된 후 540나노미터에서 측정할 수 있는 적색을 띠는 히드록시 에이트 제이철 복합체로 전환됩니다. 마이크로몰 아세틸 인산염에 비해 540나노미터에서 흡광도를 표시하는 이 일반적인 표준 곡선은 마이크로몰 아세틸 인산염당 1.2332 흡광도 단위의 기울기를 갖습니다.

결과 r 제곱 값 0.99는 데이터가 여기에 표시된 선형 방정식과 잘 맞는다는 것을 나타냅니다. 이 분석은 다양한 효소 제제에 대한 아세틸 포스페이트의 KM을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 5 밀리몰에서 메탄올 Sarina 호열성 아미노산의 다양한 농도의 아세틸 포스페이트 정제 재조합 아세테이트 키나아제와 DP는 각 기질에 대한 표준 McKayla 세멘틴과 같은 동역학을 따르므로 0.27 플러스 또는 마이너스 0.01 밀리몰 아세틸 포스페이트의 겉보기 KM이 나타납니다.

표준 결합 분석법과 달리, 이 직접 분석법은 TP 이외의 기질을 활용하는 아세테이트 키나아제의 활성을 측정할 수 있습니다. 예를 들어, 인바 히스톨리티카 아세테이트 키나아제를 생성하는 피로인산에 의한 아세틸 포스페이트의 활용에서, 인산나트륨은 반응 혼합물에서 DP를 대체하였다. 결과 곡선은 0.50 플러스 마이너스 0.006 밀리몰 아세틸 포스페이트의 명백한 KM 값을 나타냅니다. 이 비디오를 시청한 후에는 소비된 아세틸 포스페이트의 양을 결정하여 아세테이트 키나아제 활성을 직접 측정하는 방법에 대해 잘 알게 될 것입니다.

재현 가능한 결과를 얻기 위한 핵심 요소는 각 단계, 특히 효소 첨가 및 혼합 단계에서 일관성을 유지하는 것입니다.