디지털 바 코딩 플랫폼을 사용에 감염 미생물의 유전자 발현 프로파일 링

본 실험의 전반적인 목표는 병원체가 감염 환경에 어떻게 적응하고 숙주에게 손상을 입히는지 밝히기 위해 생체 내(in vivo) 병원체 유전자 발현을 정확하게 측정하는 것입니다. 이 기술은 감염병 분야의 연구자들이 다양한 조직 유형과 여러 시점에서 실제 감염 중의 병원체 유전자 발현 역동성을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 방법의 주요 장점은 민감도가 매우 높고 재현성이 극히 뛰어나다는 점입니다.

이 방법은 실제 감염된 극소량의 조직으로부터 병원체 유전자 발현량을 정량화하는 것을 가능하게 합니다. 시약 준비를 시작하려면, RLT 버퍼에 2-Mercaptoethanol을 첨가하고 잘 섞어줍니다. phenol-chloroform isoamyl alcohol 용액을 25:24:1 비율로 혼합하여 준비합니다.

M-타입 균질화 튜브에 라벨을 붙이고 얼음 위에 올려 냉각시킵니다. 2 mL 스크류 캡 튜브에 라벨을 붙이고 각 튜브에 지르코니아 비드를 약 300 µL씩 넣습니다. 조직 해리 장치, 비드 비터, 50 mL 튜브 및 96웰 플레이트용 어댑터가 장착된 탁상형 원심분리기, 광도계를 포함한 다음의 기기들을 사용할 수 있도록 준비합니다.

C.albicans에 감염된 마우스에서 분리하여 80°C 냉동고에 보관했던 신장을 꺼내 얼음 위에 둡니다. 각 신장에 RLT 완충액 1.2 mL를 첨가합니다. 그런 다음 완충액이 담긴 각 신장을 M-type 균질화 튜브에 붓습니다.

RLT 완충액의 사용량은 경험적으로 결정합니다. RLT 완충액을 너무 많이 사용하면 시료 농도가 희석되며, 너무 적게 사용하면 균질액의 점도가 매우 높아져 취급이 상당히 어려워집니다. 다음으로, RNA 2.01로 사전 설정된 조직 분쇄기를 사용하여 신장을 균질화합니다.

그 다음, 1000 x G에서 1분 동안 원심분리합니다. 각 균질액 600 µL를 지르코니아 비드가 들어 있는 스크류 캡 튜브로 옮기고, 남은 균질액은 얼음 위에 보관합니다. 각 튜브에 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올 600 µL를 첨가하고 뚜껑을 단단히 닫은 후, 비드 비터(bead beater)를 사용하여 4 °C에서 3분 동안 볼텍싱합니다.

4°C에서 15,000 G로 5분 동안 원심분리합니다. 수용액층을 새로운 1.5 mL 마이크로 튜브로 조심스럽게 옮기고, 동일한 부피의 70% ethanol을 첨가합니다. 그 다음 스핀 컬럼에 로딩하여 8,000 x G로 원심분리합니다. 700 µL의 buffer RW로 각 스핀 컬럼을 한 번 세척한 후, 500 µL의 buffer RPE로 두 번 더 세척합니다.

컬럼을 건조된 수집 튜브로 옮기고 1분 더 원심분리하여 남아있는 액체를 모두 제거합니다. 마지막으로 50 µL의 물을 사용하여 RNA를 용출합니다. 그 후 OD 216 nm에서 분광광도계를 사용하여 RNA 농도를 측정합니다.

디지털 바코딩을 이용한 유전자 발현 프로파일링을 수행하려면, 먼저 리포터 코드 세트와 캡처 코드 세트를 얼음 위에서 해동하십시오. 리포터 코드 세트에 하이브리다이제이션 버퍼 130 µL를 추가합니다. 뒤집어서 혼합한 후 원심 분리하여 용액을 모읍니다.

다음으로 혼합액 20 µL를 12개의 반응 튜브 각각에 첨가합니다. 그런 다음 각 튜브에 10 µg의 총 조직 RNA를 첨가하고 피펫팅하여 혼합합니다. 감염 모델, 접종량 및 사용된 병원체 균주에 따라 총 RNA 내 병원체 RNA의 비율은 0~2%까지 다양합니다. 따라서 각 경우에 첨가해야 할 총 RNA 양은 실험적으로 최적화해야 합니다.

이제 각 튜브에 5 µL의 캡처 코드 세트를 추가합니다. 튜브를 뒤집어 섞은 후 빠르게 원심 분리합니다. 그 다음, 가열 덮개가 장착된 열 순환기(thermal cycler)에서 65 °C로 약 18시간 동안 반응물을 배양합니다.

20 °C에서 샘플 카트리지 하나를 꺼내 실온으로 가온합니다. 4 °C에서 시약 플레이트 두 개를 꺼내 벤치탑 원심분리기에서 670 x g로 2분간 원심분리합니다. 다음으로, 화면의 단계별 지침에 따라 고감도 옵션을 선택하여 준비 스테이션을 설정합니다.

그 다음, 열 순환기에서 반응물을 꺼내어 즉시 prep station에 로딩합니다. 3시간의 고감도 프로그램을 실행한 후, 카트리지를 분리하고 투명 테이프를 사용하여 레인을 밀봉합니다. 필요한 경우 카트리지 바닥에 미네랄 오일을 도포합니다.

그다음 카트리지를 디지털 분석기에 장착합니다. 화면의 단계별 지침에 따라 디지털 분석기를 설정하고, 고해상도 스캔 옵션을 선택합니다. 스캔 프로그램을 실행한 후, 결과를 다운로드하거나 이메일로 수신하도록 선택하여 로우 데이터를 제조사 소프트웨어로 가져옵니다.

텍스트 프로토콜에 따라 데이터를 분석하십시오. 이 비디오에서 시연된 프로토콜은 캡처 프로브와 리포트 프로브를 모두 사용하여 특이성을 높이고 호스트 RNA로 인한 노이즈를 줄인다는 독특한 장점이 있습니다. 여기에서 보시는 바와 같이, 감염되지 않은 조직 샘플의 배경 raw count는 모두 10 미만이었으며, 감염된 두 조직 샘플의 raw count는 모두 10 이상이었습니다.

두 생물학적 샘플의 raw count는 R 제곱 값 0.945로 매우 높은 상관관계를 보였습니다. 또한, 이 플랫폼은 자연적인 생물학적 발현 수준을 포함할 수 있는 충분한 다이내믹 레인지를 제공합니다. 248개의 환경 반응 유전자를 지정하는 프로브 세트를 사용하여, 병원균 유전자 발현의 두 단계를 결정하였습니다.

초기 유전자 발현 반응은 접종 시점과 감염 후 12시간 샘플 간에 RNA 수준이 유의미하게 차이 나는 유전자들로 구성됩니다. 또한, 12시간 시점과 감염 후 48시간 샘플 간에 RNA 수준이 유의미하게 차이 나는 유전자들로 구성된 후기 유전자 발현 반응도 발견되었습니다. 이러한 결과는 포유류 숙주의 침습성 감염 과정 동안 C.albicans의 유전자 발현이 동적으로 조절됨을 나타냅니다.

이 방법은 쉽고 빠릅니다. 조직 수집부터 데이터 표현까지의 전체 과정은 48시간 미만이 소요됩니다. 샘플 12개당 실제 작업 시간은 약 4시간입니다.

이 방법은 생체 내(in vivo) 병원체 유전자 발현을 포착하기 위해 개발되었지만, 숙주 유전자 발현을 분석하는 데에도 동일하게 사용할 수 있습니다. 따라서 연구자는 감염의 양측 모두에서 유용한 정보를 동시에 얻을 수 있습니다.