디지털 바 코딩 플랫폼을 사용에 감염 미생물의 유전자 발현 프로파일 링

이 실험의 전반적인 목표는 병원체가 감염 환경에 어떻게 적응하고 숙주에 손상을 입히는지를 밝히기 위해 생체 내에서 병원체 유전자 발현을 정확하게 측정하는 것입니다. 이 기술은 감염성 질환 분야의 연구자들이 다양한 조직 유형과 여러 시점에서 실제 감염 중에 병원체 유전자 발현 역학을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 방법의 주요 장점은 매우 민감하고 재현성이 매우 높다는 것입니다.

이 방법을 사용하면 실제 감염의 극소량 조직에서 병원체 유전자 발현을 정량화할 수 있습니다. 시약 준비를 시작하려면 2-메르캅토에탄올을 첨가하여 RLT를 완충시키고 잘 혼합합니다. 페놀-클로로포름 이소아밀 알코올 용액의 25:24:1 혼합물을 준비합니다.

M형 균질화 튜브에 라벨을 붙이고 얼음에서 식힙니다. 두 개의 밀리리터 스크류 캡 튜브에 라벨을 붙이고 각 튜브에 약 300마이크로리터의 지르코니아 비드를 추가합니다. 조직 해리기, 비드 비터, 50밀리리터 튜브용 어댑터가 있는 탁상용 원심분리기 및 96웰 플레이트, 광도계를 포함하여 다음 기기를 사용할 수 있도록 준비합니다.

C.albicans에 감염된 쥐에서 분리한 이전에 냉동된 신장을 섭씨 80도의 냉동고에서 꺼내 얼음 위에 올려 놓습니다. 각 신장에 1.2ml의 완충액 RLT를 추가합니다. 그런 다음 완충액이 있는 각 신장을 M형 균질화 튜브에 디캔팅합니다.

사용된 버퍼 RLT의 양은 경험적으로 결정됩니다. 완충액 RLT가 너무 많으면 시료 농도가 희석되고 너무 적으면 균질화의 점성이 매우 높아져 취급하기가 매우 어려워집니다. 다음으로, 사전 로드된 설정 RNA 2.01에서 조직 해리기를 사용하여 신장을 균질화합니다.

그런 다음 1000 x G에서 1분 동안 원심분리합니다. 각 균질액 600마이크로리터를 지르코니아 비드가 들어 있는 나사 캡 튜브로 옮기고 나머지 균질액을 얼음에 저장합니다. 각 튜브에 600마이크로리터의 페놀-클로로포름 이소아밀 알코올을 넣고 뚜껑을 단단히 닫은 다음 섭씨 4도에서 3분 동안 비드 비터를 소용돌이칩니다.

15, 000G에서 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리기. 수성상을 새로운 1.5ml 마이크로분리 튜브로 조심스럽게 옮기고 동일한 부피의 70% 에탄올을 추가합니다. 그런 다음 스핀 컬럼에 로드하고 8, 000 x G.With 700 마이크로리터의 버퍼 RW에서 회전하고, 각 스핀 컬럼을 한 번 세척한 다음 500 마이크로리터의 버퍼 RPE를 가진 두 번의 세척을 합니다.

컬럼을 건식 수집 튜브로 옮기고 1분 더 돌려 남아 있는 액체를 제거합니다. 마지막으로 50마이크로리터의 물을 사용하여 RNA를 용리합니다. 그런 다음 OD 216 animeter에서 분광 광도계를 사용하여 RNA 농도를 측정합니다.

디지털 바코드를 사용하여 유전자 발현 프로파일링을 수행하려면 먼저 리포터 코드 세트와 캡처 코드 세트를 얼음 위에서 해동합니다. 130마이크로리터의 혼성화 버퍼를 리포터 코드 세트에 추가합니다. 반전하여 혼합하고 스핀 다운합니다.

그런 다음 20개의 반응 튜브 각각에 12마이크로리터의 혼합물을 추가합니다. 그런 다음 각 튜브에 총 조직 RNA 10마이크로그램을 추가하고 피펫팅으로 혼합합니다. 감염 모델, 접종 크기 및 사용된 병원체 균주에 따라 전체 RNA 중 병원체 RNA의 비율은 0에서 2%로 다양하므로 각각에 대해 추가해야 하는 RNA의 총량은 경험적으로 최적화되어야 합니다.

이제 각 튜브에 5마이크로리터의 캡처 코드 세트를 추가합니다. 튜브를 뒤집어서 섞고 빠르게 회전시킵니다. 그런 다음 가열된 뚜껑을 사용하여 섭씨 65도의 열 순환기에서 약 18시간 동안 반응을 배양합니다.

섭씨 20도에서 샘플 카트리지 하나를 제거하고 실온으로 데웁니다. 섭씨 4도에서 시약 플레이트 2개를 제거하고 670 x G의 테이블탑 원심분리기에서 2분 동안 회전시킵니다. 그런 다음 화면의 단계별 지침에 따라 고감도 옵션을 선택하여 준비 스테이션을 설정합니다.

그런 다음 열 순환기에서 반응을 제거하고 즉시 준비 스테이션에 로드합니다. 3시간 고감도 프로그램을 실행한 후 카트리지를 제거하고 투명 테이프를 사용하여 레인을 밀봉합니다. 필요한 경우 카트리지 바닥에 미네랄 오일을 바르십시오.

그런 다음 카트리지를 디지털 분석기에 로드합니다. 화면의 단계별 지침에 따라 고해상도 스캔 옵션을 선택하여 디지털 분석기를 설정합니다. 스캔 프로그램을 실행한 후 결과를 다운로드하거나 이메일로 받도록 선택하고 원시 데이터를 제조업체의 소프트웨어로 가져옵니다.

텍스트 프로토콜에 따라 데이터를 분석합니다. 이 비디오에서 시연된 프로토콜은 capture probe와 report probe를 모두 사용하여 특이성을 높이고 host RNA의 noise를 줄인다는 점에서 고유한 이점이 있습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 감염되지 않은 조직 샘플의 배경 원시 수는 모두 10 미만인 반면, 감염된 두 조직 샘플의 원시 수는 모두 10 이상이었습니다.

두 생물학적 샘플의 원시 계수는 R 제곱 값 0.945와 매우 좋은 상관 관계를 보였습니다. 이 플랫폼은 또한 자연스러운 생물학적 발현 수준을 포괄하는 충분한 동적 범위를 제공합니다. 248개의 환경 반응 유전자를 지정하는 프로브 세트를 사용하여 병원체 유전자 발현의 두 단계를 측정했습니다.

초기 유전자 발현 반응은 접종물과 감염 후 12시간 샘플 간에 RNA 수치가 크게 다른 유전자로 구성됩니다. 감염 후 12시간 시점과 48시간 시점 사이에 현저히 다른 RNA 수준을 가진 유전자로 구성된 늦은 유전자 발현 반응도 발견되었습니다. 이러한 결과는 C.albicans의 유전자 발현이 포유류 숙주의 침습성 감염 중에 동적으로 조절된다는 것을 나타냅니다.

이 방법은 쉽고 빠릅니다. 조직 채취부터 데이터 발현까지 전 과정은 48시간 미만이 소요됩니다. 실습 시간은 12개의 샘플에 대해 약 4시간입니다.

이 방법은 in vivo에서 병원체 유전자 발현을 포착하기 위해 개발되었지만, 숙주 유전자 발현에 응답하는 데에도 동일한 방법을 사용할 수 있습니다. 따라서 연구원들은 감염의 양쪽에서 동시에 유용한 정보를 얻을 수 있습니다.