Name: 의 주문형 정량 분석을위한 미세 유체 기반 Electrotaxis Caenorhabditis의 엘레 로코 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 배우세요 미세유체 전기축성을 이용한 Caenorhabditis elegans의 정량적 운동 분석 방법입니다. 이 기술은 신경 및 근육계 이상을 신속하게 선별하여 신경퇴행성 질환 연구에 활용됩니다.

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저자는 재정 지원에 대한 자신의 조기 연구원 상 프로그램을 통해 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구 협의회, 캐나다 연구 의자 프로그램, 건강 연구의 캐나다 연구소, 그리고 연구와 혁신의 온타리오 교육부 감사드립니다.

1. 마스터 금형 제작을위한 포토 리소그래피 <ol><li> 30 초 후 30 초와 메탄올 아세톤 실리콘 웨이퍼 인치 3 목욕. 5 분 dH보다 2 0 물로 씻어. </li><li> N2 블로우 총으로 웨이퍼의 표면을 건조. 2 분 동안 140 ° C에서 뜨거운 접시에 웨이퍼를 가열한다. </li><li> 플라즈마 실리콘 웨이퍼 (1 분, 50 W)의 표면을 산화. </li><li> 3 ML SU-8 100 포토 레지스트 (; 1,750 rpm으로 40 초)을 스핀 코팅 웨이퍼의 표면. </li><li> 65 뜨거운 접시에 미리 구워 코팅 웨이퍼 ° C 10 분 후, 95 ° C 2 분 이상 온도를 진입로. 추가 1 시간이 설정을 유지합니다. </li><li> 원하는 채널 설계를 포함하는 포토 마스크를 맞 춥니 다. 550-600 UV 빛의 엠제이 / ㎠ (350-400 nm의)에 저항을 노출합니다. 포토 마스크는 AutoCAD에서 설계 및 고해상도 인쇄와 투명에 인쇄 할 수 있습니다. </li><li> T를 올렸에서 10 분 동안 1 분, 95 ° C, 65 ° C에서 뜨거운 접시에 웨이퍼 포스트 구워이전과 그 온도. </li><li> 15 분 SU-8 개발자 용액에 웨이퍼를 담가. 이소프로판올로 세척함으로써 개발 완료를 확인합니다. 백색의 침전이 나타나면, 계속 개발. 마스터 형은 그림 2A에 표시됩니다. </li></ol> 2. 마이크로 채널 제작 용 소프트 리소그래피 <ol><li> 3.5 ML PDMS 경화제와 함께 35 ML 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 탄성 중합체 기반을 섞는다. </li><li> 알루미늄 호일로 늘어선 페트리 접시에 제작 된 마스터 몰드 (모양이 위를 향하게)와 빈 실리콘 웨이퍼를 놓습니다. </li><li> 두 번째 접시에 마스터 금형 접시 15 ML에 20 ML PDMS의 프리폴리머를 붓는다. 부드럽게 일회용 나무 주걱으로 그들을 눌러 웨이퍼 아래에 공기 주머니를 제거합니다. </li><li> 두 접시를 커버하고 치료하는 일에 대해 따로 설정합니다. 또는 2, 빠른 치료를 위해, 진공 degasifier를 사용하여 PDMS에서 기포를 제거하고 80 뜨거운 접시에 요리를 남겨 ° C시간. </li><li> 웨이퍼에서 호일 PDMS 껍질을 제거합니다. </li><li> 채널의 양쪽 끝에서 유체 액세스 포트를 펀치 해리스 유니 코어 (2.5 mm)을 사용합니다. 비슷한 크기의 스트립에 채널과 빈 PDMS를 잘라. </li><li> 플라즈마 산화에 채널 빈 PDMS 스트립 유리 슬라이드 (75 × 25mm 2)로드 가능성 클린 룸에 위치해 있습니다. 40 W 전원에서 40 초 동안 산소 플라즈마에 노출. </li><li> 빈 스트립의 반대편에 채널 조각과 유리 슬라이드를 붙입니다. 결합을 완료하는 데 2​​ 시간 방치. </li><li> 120 핫 플레이트에 어셈블리를 배치 ° C. PDMS의 예비 중합체를 사용하여 구멍을 뚫은 저수지, 각 장기에 최소 6 in (내경 1 / 32 &quot;, 외경 3 / 32&quot;) 플라스틱 튜브를 연결합니다. 하나 또는 두 개의 튜브에 부착는 유체 플라스틱 커넥터 주사기 첨부를 허용하거나, 상업적으로 이용 가능한 피팅을 사용합니다. </li><li> PDMS는 치료하는 튜브를 확보 할 수 있습니다. EAC로 22 게이지 절연 구리 와이어의 3 &quot;길이를 삽입입구 관 및 채널과 PDMS 예비 중합체와 보안 사이의 시간 저수지. 완성 된 제품은 그림 2B에 표시됩니다. </li></ol> 3. Electrotaxis 실험 <ol><li> 모니터 (그림 1)에 연결 장착 된 카메라 현미경의 무대 (가급적 XY-이동)에 마이크로 놓습니다. </li><li> 의 마이크로 전극에 전원 공급 장치 또는 앰프의 출력 선을 연결합니다. 만 DC 신호가 필요한 경우 단순 DC 전원 공급 장치는 충분하지만, 함수 발생기에 연결된 앰프뿐만 아니라 펄스 DC 및 AC 신호의 응용 프로그램을 할 수 있습니다. </li><li> 일회용 주사기에의 마이크로 출력 튜브를 연결합니다. 잠수함 M9 생리 버퍼에있는 입구 관의 입과 부드럽게은 주사기 내부의 부압 (수동 또는 주사기 펌프를 사용)를 적용하여 채널에 액체를 열망. 입구와 출구 튜브 M9로 채워 둘 때, 주사기 F를 분리롬 관. 수압 구동 흐름을 방지하기 위해 같은 높이에 두 튜브를 수평. </li><li> 채널에 DC 전압을 적용하고 (R = V / I)이 (긴 50mm를위한 0.3 mm 폭 ~ 0.1 mm 깊이 마이크로) MΩ 0.6 주위에 그 저항을 확인합니다. </li><li> 채널의 무결성을 만족하는 경우, 채널에 희석 현탁액에서 웜을로드 위의 단계를 수행하십시오. </li><li> 주사기를 분리하고 수압 관 &#39;상대 높이를 조정하여 흐름을 조작 할 수 있습니다. 채널의 중심에있는 벌레를 놓고 같은 높이에 두 튜브가 평평하다이 방법을 사용합니다. </li><li> L3 단계 동물 용 4-12 V / cm의 L4S 4-10 V / cm, 2-4 V / 젊은 성인을위한 CM : 적절한 전압 전원 공급 장치를 설정합니다. 전기 신호를 활성화하고 현장에 순응하는 웜 사전 노출의 1 분을 허용합니다. 웜은 음극쪽으로 이동을 시작합니다. 분이 경과하면 녹음을 시작하려면 카메라를 사용합니다. </li><li> AC 및 펄스7, 8을 원하는대로 D DC 실험, 최대 반응 전계 신호의 이상과 주파수 및 듀티 사이클에서 채택 될 수 변조 할 수 있습니다. </li><li> 실험이 완료되면, 채널에서 모든 액체 (와 웜)를 제거, dH보다 2 0으로 헹굼 ° C 건조 125 핫 플레이트에 장치를 둡니다. </li><li> 수동으로 NIH ImageJ에 (사용 녹화 된 비디오에서 locomotory 데이터를 추출 <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) 또는 사용자 정의 MATLAB 기반의 웜 추적 소프트웨어입니다. </li></ol>

<ol><li>Kuwahara, T., Koyama, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Familial+Parkinson+mutant+%CE%B1-synuclein+causes+dopamine+neuron+dysfunction+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Familial Parkinson mutant α-synuclein causes dopamine neuron dysfunction in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> J. Biol. Chem. 281 (1), 334-340 (2006).</li>
<li>Kuwahara, T., Koyama, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+RNAi+screen+reveals+involvement+of+endocytic+pathway+in+neuronal+dysfunction+in+a-synuclein+transgenic%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A systematic RNAi screen reveals involvement of endocytic pathway in neuronal dysfunction in a-synuclein transgenic.</a> 17 (19), 2997-3009 (2008).</li>
<li>Su, L. J., Auluck, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compounds+from+an+unbiased+chemical+screen+reverse+both+ER-to-Golgi+trafficking+defects+and+mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models.</a> Dis. Model Mech. 3 (3-4), 194-208 (2010).</li>
<li>Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotaxis+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfluidic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Electrotaxis of Caenorhabditis elegans in a microfluidic environment.</a> Lab Chip. 10 (2), 220-226 (2010).</li>
<li>Salam, S., Ansari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidics+set+up+to+study+neuronal+degeneration+and+identification+of+neuroprotective+compounds+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A microfluidics set up to study neuronal degeneration and identification of neuroprotective compounds in C. elegans.</a> , Submitted (2013).</li>
<li>Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+sorting+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Electrical sorting of Caenorhabditis elegans.</a> Lab Chip. 12 (10), 1831-1840 (2012).</li>
<li>Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pulse+direct+current+signals+on+electrotactic+movement+of+nematodes+Caenorhabditis+elegans+and+Caenorhabditis+briggsae%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Effect of pulse direct current signals on electrotactic movement of nematodes Caenorhabditis elegans and Caenorhabditis briggsae.</a> Biomicrofluidics. 5 (4), 044116(2011).</li>
<li>Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+of+Caenorhabditis+elegans+in+alternating+electric+field+and+its+application+to+their+localization+and+control%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Behavior of Caenorhabditis elegans in alternating electric field and its application to their localization and control.</a> Appl. Phys. Lett. 96 (15), 153702(2010).</li>
<li>van Ham, T. J., Thijssen, K. L., Breitling, R., Hofstra, R. M., Plasterk, R. H., Nollen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+model+identifies+genetic+modifiers+of+alpha-synuclein+inclusion+formation+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">C. elegans model identifies genetic modifiers of alpha-synuclein inclusion formation during aging.</a> PLoS Genet. 4, e1000027(2008).</li>
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<li>Manière, X., Lebois, F., Matic, I., Ladoux, B., Meglio, J. -M. D. i, Hersen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Running+worms%3A+C.+elegans+self-sorting+by+electrotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Running worms: C. elegans self-sorting by electrotaxis.</a> PLoS One. 6 (2), e16637(2011).</li>
</ol>

미세 electrotaxis 분석 기술은 미국과 캐나다, 미국에 특허 출원되어 있습니다.

처음으로 추앙와 동료 11,12의 dielectrophoretic 조작 작업에 GABEL 및 동료와 건물에 의해 기술 된 행동 현상을 활용, 우리의 마이크로 유체 기반 electrotaxis 분석은 운동을 같이 사용하여 웜에 신경 활동을 조사하기 쉽고 강력하고 중요한 방법을 제공합니다 출력. 운동 매개 변수의 분석은 서로 다른 유전자형 사이의 정량적 인 비교를 할 수 있습니다. 함께 마이크로 제조 및 전기 분야의 응용 프로그램의 정밀도는 제어 환경 운동 제어를위한 웜과 통신 할 수있는 수단을 모두 제공합니다. 다른 전기 신호의 파형 모양 웜의 여러 행동 반사가 두 자극하고 운동을 억제하는 데 사용되었습니다. 현재 microfluidic 장치의 단일 채널 디자인은 하나의 웜이 시간에 득점해야합니다. 이를 위해, 웜 솔루션은 충분히 M9로 희석해야합니다채널에 벌레를로드하기 전에 버퍼입니다. 그것은 채널 작업이 기포와 수압에 영향을 미치는 다른 부정의 존재에 의...

<table><tbody><tr><td>아세톤</td><td>CALEDON Labs</td><td>1200-1-30</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>CALEDON Labs</td><td>6700-1-30</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>CALEDON Labs</td><td>8600-1-40</td><td></td></tr><tr><td>SU-8</td><td>Microchem Corp.</td><td>Y131273</td><td>SU-8 100</td></tr><tr><td>SU-8 개발자</td><td>Microchem Corp.</td><td></td><td></td>Y020100</tr><tr><td>92x16mm 페트리 접시</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.001</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>다우 코닝</td><td></td><td>엘라스토머 베이스 및 경화제 포함</td></tr><tr><td>기능 발생기</td><td>Tektronix Inc.</td><td></td><td>모델 AFG3022B</td></tr><tr><td>앰프</td><td>Trek Inc.</td><td></td><td>모델 2210-CE</td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>Harvard 장치</td><td>70-4506</td><td>모델 11 ELITE</td></tr><tr><td>핫플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>11675916Q</td><td>모델 HP131725Q</td></tr></tbody></table>

의 주문형 정량 분석​​을위한 미세 유체 기반 electrotaxis<em&gt; caenorhabditis의 엘레</em&gt; &#39;로코

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

선충 Caenorhabditis의 elegans의 때문에 질병 관련 유전자와 경로뿐만 아니라 재배의 용이성 자사의 보존 생물 의학 연구를위한 다양한 모델 생물이다. 여러 C. 엘레 질병 모델은 같은 도파민 (DA) 뉴런 1의 변성을 포함 파킨슨 병 (PD)와 같은 퇴행성 신경 질환 등이보고되었다. 도입 유전자와 신경 독성 화학 물질을 모두 신경 변성 및 신경 유전자와 화합물을 2,3에 대한 화면의 기초로 조사를 허용, DA의 신경 퇴화 및 웜의 필연적 인 움직임 결함을 유도하는 데 사용되었습니다. C. 같은 낮은 진핵 생물의 화면 엘레은 신경 신호에 영향을 미치는 화합물 유전자를 식별 할 수있는 효율적이고 경제적 인 방법을 제공합니다. 기존의 스크린은 일반적으로 수동으로 수행하고 육안 검사에 의해 채점, 결과적으로, 그들은 시간이 단점입니다uming과 인간의 오류가 발생하기 쉬운. 또한, 세포 수준 분석에 대부분의 초점은 운동을 무시하면서, 이는 운동 장애를위한 특히 중요한 매개 변수입니다. 우리는 C.를 제어하고 정량화 새로운 마이크로 유체 심사 시스템 (그림 1) 개발 elegans의 &#39;운동은 마이크로 내부 전기장 자극을 사용하여. 우리는 직류 (DC) 필드가 견고 음극쪽으로 운동 ( &quot;electrotaxis&quot;4) 주문형 유도 할 수있는 것으로 나타났습니다. 필드의 극성을 반전하면 웜이 빠르게뿐만 아니라 방향을 반전됩니다. 우리는 또한 도파민과 다른 감각 뉴런에 결함이 수영 응답 5을 변경 것으로 나타났습니다. 따라서 신경 세포의 신호 전달에 이상이 읽기 아웃으로 운동을 사용하여 확인할 수 있습니다. 운동 반응은 정확히 같은 속도, 몸을 구부리는 주파수와 반전 시간을 수영과 같은 매개 변수의 범위를 사용하여 정량화 할 수있다. 4에 비해 더 빠르게 이동합니다. 이러한 연구 결과는 우리가 수동적으로 연령과 표현형 (6)에 의해 벌레를 정렬하는 새로운 microfluidic 장치를 설계했다. 우리는 또한 펄스 DC에 웜의 반응을 테스트하고 전류 (AC) 전기 분야를 교류했다. C. 둘 다에있는 다양한 듀티 사이클 펄스 DC 필드 효과적으로 생성 electrotaxis 엘레과 사촌 C. 7 briggsae. 또 다른 실험에서, 1 Hz에서에서 3 kHz의 주파수 범위 대칭 AC 필드는 8 채널 내부의 벌레를 고정. 미세 환경에서 전기장의 구현은 electrotaxis 분석의 신속하고 자동 실행을 할 수 있습니다. 이 방법은 요소에 대한 높은 처리량 유전 및 화학 화면을 촉진하기 위해 약속신경 세포의 기능과 생존에 영향을 미치는.

웜 추적 소프트웨어에서 야생형 젊은 성인 선충의 electrotaxis 그 위치와 속도 출력의 대표적인 비디오 보충 비디오 1과 그림 3에 나와 있습니다. 동작 분석 소프트웨어 자체 필드 극성의 방향 및 극성 반전의 시간을 인식하지 않고 오히려이 정보는 소스 비디오에서 얻을 수 있어야합니다. 이 동영상의 오디오 또는 시각적 신호를 사용하거나 실험 조건 및 조작을 작성 할 수 있습니다. 야생형 (N2) 및 형질 전환 동물 (NL5901)의 집합에서 Electrotaxis 속도 데이터는 그림 4에 표시됩니다. NL5901 동물 UNC-54 (마이 오신 중쇄 유전자) 발기인의 통제하에 인간 α-synuclein의 유전자를 가지고. 몸에 α-synuclein의 표현 벽 근육 집계 9 우리의 결과는 ELEC에 이상이 발생한다는 것을 보여trotactic 응답...

에 주문형 운동을 유도하는 반자동 마이크로 전기 유체 방법<em&gt; Caenorhabditis의 엘레</em&gt;이 설명되어 있습니다. 이 방법은 미세 유체 채널 내부에 약한 전기 필드 ( &quot;electrotaxis&quot;)에 응답 벌레의 neurophysiologic 현상을 기반으로합니다. 미세 electrotaxis는 신경 세포 건강에 영향을 미치는 요인 화면으로 신속하고 민감한, 낮은 비용, 확장 성이 뛰어난 기술로 제공합니다.

의 주문형 정량 분석​​을위한 미세 유체 기반 Electrotaxis<em&gt; Caenorhabditis의 엘레</em&gt; &#39;로코

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

본 절차의 전반적인 목표는 화학 물질 노출 또는 유전자 조작 후 C Allergan의 모델 생물체에서 나타나는 신경 및 신경근 신호 전달의 이상을 식별하는 것입니다. 이는 먼저 실리콘 웨이퍼에 마이크로채널 패턴을 설계하고 식각함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 실리콘 몰드를 사용하여 PDMS로 하나 이상의 마이크로채널을 성형합니다.그 다음으로 PDMS 몰드에 보조 부품들을 부착합니다. 이어서, 미세유로(microchannel)를 통해 수영하도록 자극받은 벌레들의 행동을 현미경 장착 카메라를 사용하여 기록합니다. 최종적으로, 전기 미세유체 기술(electro microfluidics)을 이용하여 화학적 또는 유전적 조작에 따른 선충의 신경계 및 근육계 변화를 이동성(locomotion) 판독값으로 측정합니다.기존 기술, 특히 플레이트 기반 행동 분석법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 벌레의 이동 방향을 엄격하게 제어할 수 있어 신체 굴곡 빈도, 회전 시간, 유영 속도와 같은 운동 행동을 정밀하게 정량화할 수 있다는 점입니다. 이 기술은 신경 보호 특성을 가진 화학적 및 유전적 요인을 스크린하는 데 사용될 수 있으므로, 파킨슨병 및 알츠하이머병과 같은 신경 퇴행성 질환의 치료로 그 응용 범위가 확장될 수 있습니다. 우리는 운동 행동을 정량적인 방식으로 분석할 수 있는 방법이 부족하다는 점을 깨달았을 때 처음으로 이 기술에 대한 아이디어를 얻었습니다.움직임은 자발적이고 무작위적이어서 특성을 정의하기 어렵습니다. 따라서 누구나 쉽게 배울 수 있는 간편한 방법을 확립하고자 했습니다. 마스터 몰드를 제작하려면 먼저 3인치 실리콘 웨이퍼를 아세톤과 메탄올에 각각 30초 동안 담급니다. 그 후 웨이퍼를 탈이온수로 5분 동안 헹굽니다.다음으로, 질소 블로우 건을 사용하여 웨이퍼 표면을 건조시킨 후, 핫플레이트에서 120 °C로 2분 동안 가열하고, 실리콘 웨이퍼 표면을 50 W에서 1분 동안 플라즈마 산화시킵니다. 이제 3 mL의 SU-8 100 포토레지스트를 사용하여 웨이퍼 표면을 1,750 RPM으로 40초 동안 스핀 코팅한 후, 코팅된 웨이퍼를 핫플레이트에서 65 °C로 프리베이크합니다. 10분 후, 2분에 걸쳐 온도를 95 °C로 높이고 웨이퍼를 1시간 동안 추가로 베이크합니다.핫 플레이트에서 웨이퍼를 꺼낸 후, 원하는 디자인의 포토마스크를 웨이퍼 위에 배치합니다. 포토레지스트를 UV 광원에 95초 동안 노광시킵니다. 그다음, 프리베이크(pre-bake) 시 사용했던 것과 동일한 온도 구배를 사용하여 핫 플레이트에서 웨이퍼를 포스트베이크(post-bake)합니다.웨이퍼를 SU-8에 담급니다. 현상액으로 10~15분 동안 현상합니다. 웨이퍼를 이소프로판올로 헹구어 도안 현상이 완료되었는지 확인합니다.그 후 탈이온수로 30초 동안 헹굽니다. 마지막으로, 질소 건으로 웨이퍼를 건조시키고 120 °C에서 짧게 베이킹합니다. 이제 제작된 마스터 몰드와 빈 실리콘 웨이퍼를 알루미늄 호일이 깔린 두 개의 별도 페트리 접시에 넣습니다.PDMS 프리폴리머 20 milliliters를 마스터 몰드와 디쉬에 붓고, 15 milliliters를 블랭크 웨이퍼 디쉬에 붓습니다. 그다음, 일회용 나무 어플리케이터로 웨이퍼를 가볍게 눌러 웨이퍼 아래의 기포를 제거한 후, 두 디쉬를 모두 덮고 하루 동안 그대로 두어 경화시킵니다. 웨이퍼가 경화되면 호일을 제거하고 PDMS를 떼어냅니다.그런 다음 2.5 millimeter Harris unicorn을 사용하여 마스터 몰드에서 제작한 PDMS 채널의 양 끝에 유체 액세스 포트를 뚫습니다. 두 개의 PDMS 디스크를 비슷한 크기의 스트립으로 자릅니다. 그 후 클린룸에서 채널, 공백 PDMS 스트립, 유리 슬라이드를 플라스마 산화기에 넣습니다.재료를 40 W 전력의 산소 플라스마에 40초 동안 노출시킵니다. 그 다음, 채널 조각과 유리 슬라이드를 블랭크 스트립의 반대편에 각각 부착하고, 결합이 완료될 때까지 재료를 그대로 둡니다. 2시간 후, 120 °C의 핫플레이트 위에서 PDMS 프리폴리머를 사용하여 최소 6인치 길이의 플라스틱 튜브 두 개를 펀칭된 리저버에 부착합니다.다음 단계로 넘어가기 전 PDMS를 경화시킵니다. 그다음, 주사기를 연결할 수 있도록 플라스틱 유체 커넥터를 튜브 중 하나에 부착합니다. 이제 입구 튜브와 채널 사이의 각 리저버에 3인치 길이의 22게이지 절연 구리선을 삽입하고, 추가적인 PDMS 프리폴리머를 사용하여 와이어를 고정합니다.방금 조립한 마이크로채널을 모니터에 연결된 카메라가 장착된 현미경의 XY 이동 스테이지 위에 놓는 것으로 이 단계를 시작하고, 마이크로채널 전극에 전원 공급 장치를 연결하십시오. 마이크로채널의 저항이 약 0.6 mega ohms인지 확인한 후, 마이크로채널의 출력 튜브를 일회용 주사기에 연결하십시오. 그런 다음 유입 튜브의 입구를 M nine 생리적 완충액에 부유된 선충 용액에 담그십시오.시린지 내부에 음압을 가하여 채널 안으로 액체를 흡입합니다. 입구 및 출구 튜브가 모두 채워지면 시린지와 정수압 장치를 분리합니다. 튜브의 상대적인 높이를 조정하여 유량을 조절함으로써 벌레를 채널 중앙에 위치시킵니다.그런 다음 마이크로채널 내부의 유량을 0으로 유지하기 위해 두 튜브를 동일한 높이로 평평하게 눕힙니다. 전기택시스 실험 중 벌레 샘플을 교체할 때, 두 입구 튜브의 높이를 동일하게 맞춘 후에도 여전히 흐름이 있다면 튜브 간의 높이를 미세하게 조정하십시오. 유량이 실제로 0인지 확실하지 않은 경우에는 전기장의 극성을 바꾸어 벌레의 이동 방향을 반전시킨 후, 벌레가 회전할 때의 선속도를 평가하여 확인할 수 있습니다.이제 전원 공급 장치를 적절한 전압으로 설정하십시오. 전기 신호를 활성화하고 벌레가 전계에 적응할 수 있도록 1분 동안 사전 노출시키며, 1분이 지나면 벌레가 음극 쪽으로 이동하기 시작해야 합니다. 녹화를 시작하십시오.실험이 완료되면 채널에서 모든 액체와 벌레를 제거하십시오. 챔버를 탈이온수로 헹구고, 장치를 125 °C의 핫플레이트 위에 올려 건조하십시오. 이 대표 영상에서는 야생형 성체 초기 단계의 선충의 전기축과 벌레 추적 소프트웨어에서 출력된 위치 및 속도 데이터가 표시됩니다.비디오는 오른쪽에 음극이 배치된 상태로 시작됩니다. 유리 피펫이 나타나면 곧 방향 전환이 일어날 것임을 나타내며, 이후 피펫이 제거되면 신호를 보냅니다. 여기서 방향 전환이 일어나는 순간, 비디오 속 벌레에 대해 맞춤형 벌레 추적 프로그램이 출력한 시간 대비 위치 데이터와 시간 대비 순간 속도 데이터가 표시됩니다. 프로그램은 위치-시간 곡선으로부터 속도 곡선을 계산하였습니다.이 상자 그림은 야생형 및 형질전환 동물의 전기 주성 속도 데이터를 나타냅니다. T 형질전환 동물은 UNC 54 미오신 중쇄 유전자 프로모터의 제어 하에 체벽 근육에서 인간 알파-시누클레인 유전자를 발현하며, 이는 단백질 응집을 유발하여 야생형 동물보다 느린 전기 주성 반응으로 나타납니다. 숙달되면 전기 주성 실험을 적절히 수행할 경우 매 시간 20마리 이상의 벌레를 분석할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때, 운동 능력이나 전기 감각에 영향을 주는 돌연변이 및 화학 물질만이 전기 택시스 분석법으로 검출 가능한 표현형을 나타낸다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청한 후, 실리콘 패턴 형성 방법, 미세 유체 채널 조립 방법, 그리고 전기 택시스 분석법을 이용한 N. method의 운동 능력 분석 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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연구원들은 벌레가 감지하고 반응하는 전기장을 적용하여 예쁜꼬마선충에서 주문형 움직임을 유발할 수 있습니다. 이 비디오는 전기 전술 거동을 소개하고 미세 유체 장치에서 수행되는 샘플 프로토콜을 보여줍니다.

Electrotaxis Assay: 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 이동을 관찰하는 방법

이 비디오는 경기장에서 웜의 움직임을 기록하기 위해 비디오 및 추적 소프트웨어를 사용하는 방법을 설명합니다. 예제 프로토콜은 에탄올 노출이 웜 이동에 미치는 영향을 측정합니다.

C. 예쁜꼬마선충 이동 추적: 웜의 이동을 평가하는 방법

여기에 제시된 기술은 자유롭게 단일 파장의 노출을 사용하여 미세한 종 수영의 경로를 측정한다. C. 엘레은 비용이 많이 드는 현미경에 저렴한 대안으로 그림자 영상을 보여주기 위해 사용된다. 이 기술은 방향, 속도, 가속도 및 힘을 측정하기 위하여 다양한 방향, 환경 및 종을 수용하도록 구성 될 수있다.

단일 파장 그림자 영상<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 로코 모션을 포함하여 강제 추정

C. 선 충 수 컷의 효율적인 칼슘 이미징에 대 한 적응된 "후 각 칩"를 사용 하 여 여기에 설명 되어 있습니다. 글리세롤과 페로몬에 남성 노출의 연구도 표시 됩니다.

남성 선 충 C. 머리 신경에 있는 페로몬에 대 한 응답에서 신경 활동의 이미징에 대 한 적응된 미세 후 각 칩을 사용 하 여

Mechanobiology 연구에 대 한 새로운 도구 어떻게 기계적 스트레스를 이해 하는 데 필요한 생화학 경로 활성화 하 고 elicits 생물학 응답. 여기, 우리 세포 응답의 고해상도 이미지를 수 있도록 미세 트랩으로 움직이지 동물의 선택적 기계적 자극에 대 한 새로운 방법을 전시.

기계적 자극 및 높은 해상도 C. 선 충 의 이미징에 대 한 마이크로 장치를 사용 하 여

이 문서에서는 사용자 지정 미세 장치를 채용 하는 개별 벌레의 라이브 이미징을 설명 합니다. 장치에서 여러 벌레는 개별적으로 별도 챔버, 다양 한 생물 학적 과정의 다중화 경도 감시 허용에 국한 됩니다.

꼬마 선 충 에 경도 이미징을 위한 미세 플랫폼

일련의 동원 정지 메서드를 라이브 꼬마 선 충 의 대상된 조사 수 있도록 설립 되었습니다 최근 개발한 초박형입니다 미세를 사용 하 여 개인 물 유지와 칩. 이 새로운 칩에 동원 정지 관측 이미징에 대 한 적절 한 이기도 합니다. 자세한 치료 및 칩의 응용 프로그램 예제는 설명 했다.

물 유지와 울트라입니다 미세 칩을 사용 하 여 라이브 꼬마 선 충 의 동원 정지

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미토콘드리아 질환의 카노르하비티스 예르간 모델에서 동물 활동을 정량화하는 실험 방법의 비교 분석

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Caenorhabditis elegans의 운동의 연령 의존적 역학: Lyapunov 지수 분석

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