의 주문형 정량 분석​​을위한 미세 유체 기반 Electrotaxis

본 절차의 전반적인 목표는 화학 물질 노출 또는 유전자 조작 후 C Allergan의 모델 생물체에서 나타나는 신경 및 신경근 신호 전달의 이상을 식별하는 것입니다. 이는 먼저 실리콘 웨이퍼에 마이크로채널 패턴을 설계하고 식각함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 실리콘 몰드를 사용하여 PDMS로 하나 이상의 마이크로채널을 성형합니다.

그 다음으로 PDMS 몰드에 보조 부품들을 부착합니다. 이어서, 미세유로(microchannel)를 통해 수영하도록 자극받은 벌레들의 행동을 현미경 장착 카메라를 사용하여 기록합니다. 최종적으로, 전기 미세유체 기술(electro microfluidics)을 이용하여 화학적 또는 유전적 조작에 따른 선충의 신경계 및 근육계 변화를 이동성(locomotion) 판독값으로 측정합니다.

기존 기술, 특히 플레이트 기반 행동 분석법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 벌레의 이동 방향을 엄격하게 제어할 수 있어 신체 굴곡 빈도, 회전 시간, 유영 속도와 같은 운동 행동을 정밀하게 정량화할 수 있다는 점입니다. 이 기술은 신경 보호 특성을 가진 화학적 및 유전적 요인을 스크린하는 데 사용될 수 있으므로, 파킨슨병 및 알츠하이머병과 같은 신경 퇴행성 질환의 치료로 그 응용 범위가 확장될 수 있습니다. 우리는 운동 행동을 정량적인 방식으로 분석할 수 있는 방법이 부족하다는 점을 깨달았을 때 처음으로 이 기술에 대한 아이디어를 얻었습니다.

움직임은 자발적이고 무작위적이어서 특성을 정의하기 어렵습니다. 따라서 누구나 쉽게 배울 수 있는 간편한 방법을 확립하고자 했습니다. 마스터 몰드를 제작하려면 먼저 3인치 실리콘 웨이퍼를 아세톤과 메탄올에 각각 30초 동안 담급니다. 그 후 웨이퍼를 탈이온수로 5분 동안 헹굽니다.

다음으로, 질소 블로우 건을 사용하여 웨이퍼 표면을 건조시킨 후, 핫플레이트에서 120 °C로 2분 동안 가열하고, 실리콘 웨이퍼 표면을 50 W에서 1분 동안 플라즈마 산화시킵니다. 이제 3 mL의 SU-8 100 포토레지스트를 사용하여 웨이퍼 표면을 1,750 RPM으로 40초 동안 스핀 코팅한 후, 코팅된 웨이퍼를 핫플레이트에서 65 °C로 프리베이크합니다. 10분 후, 2분에 걸쳐 온도를 95 °C로 높이고 웨이퍼를 1시간 동안 추가로 베이크합니다.

핫 플레이트에서 웨이퍼를 꺼낸 후, 원하는 디자인의 포토마스크를 웨이퍼 위에 배치합니다. 포토레지스트를 UV 광원에 95초 동안 노광시킵니다. 그다음, 프리베이크(pre-bake) 시 사용했던 것과 동일한 온도 구배를 사용하여 핫 플레이트에서 웨이퍼를 포스트베이크(post-bake)합니다.

웨이퍼를 SU-8에 담급니다. 현상액으로 10~15분 동안 현상합니다. 웨이퍼를 이소프로판올로 헹구어 도안 현상이 완료되었는지 확인합니다.

그 후 탈이온수로 30초 동안 헹굽니다. 마지막으로, 질소 건으로 웨이퍼를 건조시키고 120 °C에서 짧게 베이킹합니다. 이제 제작된 마스터 몰드와 빈 실리콘 웨이퍼를 알루미늄 호일이 깔린 두 개의 별도 페트리 접시에 넣습니다.

PDMS 프리폴리머 20 milliliters를 마스터 몰드와 디쉬에 붓고, 15 milliliters를 블랭크 웨이퍼 디쉬에 붓습니다. 그다음, 일회용 나무 어플리케이터로 웨이퍼를 가볍게 눌러 웨이퍼 아래의 기포를 제거한 후, 두 디쉬를 모두 덮고 하루 동안 그대로 두어 경화시킵니다. 웨이퍼가 경화되면 호일을 제거하고 PDMS를 떼어냅니다.

그런 다음 2.5 millimeter Harris unicorn을 사용하여 마스터 몰드에서 제작한 PDMS 채널의 양 끝에 유체 액세스 포트를 뚫습니다. 두 개의 PDMS 디스크를 비슷한 크기의 스트립으로 자릅니다. 그 후 클린룸에서 채널, 공백 PDMS 스트립, 유리 슬라이드를 플라스마 산화기에 넣습니다.

재료를 40 W 전력의 산소 플라스마에 40초 동안 노출시킵니다. 그 다음, 채널 조각과 유리 슬라이드를 블랭크 스트립의 반대편에 각각 부착하고, 결합이 완료될 때까지 재료를 그대로 둡니다. 2시간 후, 120 °C의 핫플레이트 위에서 PDMS 프리폴리머를 사용하여 최소 6인치 길이의 플라스틱 튜브 두 개를 펀칭된 리저버에 부착합니다.

다음 단계로 넘어가기 전 PDMS를 경화시킵니다. 그다음, 주사기를 연결할 수 있도록 플라스틱 유체 커넥터를 튜브 중 하나에 부착합니다. 이제 입구 튜브와 채널 사이의 각 리저버에 3인치 길이의 22게이지 절연 구리선을 삽입하고, 추가적인 PDMS 프리폴리머를 사용하여 와이어를 고정합니다.

방금 조립한 마이크로채널을 모니터에 연결된 카메라가 장착된 현미경의 XY 이동 스테이지 위에 놓는 것으로 이 단계를 시작하고, 마이크로채널 전극에 전원 공급 장치를 연결하십시오. 마이크로채널의 저항이 약 0.6 mega ohms인지 확인한 후, 마이크로채널의 출력 튜브를 일회용 주사기에 연결하십시오. 그런 다음 유입 튜브의 입구를 M nine 생리적 완충액에 부유된 선충 용액에 담그십시오.

시린지 내부에 음압을 가하여 채널 안으로 액체를 흡입합니다. 입구 및 출구 튜브가 모두 채워지면 시린지와 정수압 장치를 분리합니다. 튜브의 상대적인 높이를 조정하여 유량을 조절함으로써 벌레를 채널 중앙에 위치시킵니다.

그런 다음 마이크로채널 내부의 유량을 0으로 유지하기 위해 두 튜브를 동일한 높이로 평평하게 눕힙니다. 전기택시스 실험 중 벌레 샘플을 교체할 때, 두 입구 튜브의 높이를 동일하게 맞춘 후에도 여전히 흐름이 있다면 튜브 간의 높이를 미세하게 조정하십시오. 유량이 실제로 0인지 확실하지 않은 경우에는 전기장의 극성을 바꾸어 벌레의 이동 방향을 반전시킨 후, 벌레가 회전할 때의 선속도를 평가하여 확인할 수 있습니다.

이제 전원 공급 장치를 적절한 전압으로 설정하십시오. 전기 신호를 활성화하고 벌레가 전계에 적응할 수 있도록 1분 동안 사전 노출시키며, 1분이 지나면 벌레가 음극 쪽으로 이동하기 시작해야 합니다. 녹화를 시작하십시오.

실험이 완료되면 채널에서 모든 액체와 벌레를 제거하십시오. 챔버를 탈이온수로 헹구고, 장치를 125 °C의 핫플레이트 위에 올려 건조하십시오. 이 대표 영상에서는 야생형 성체 초기 단계의 선충의 전기축과 벌레 추적 소프트웨어에서 출력된 위치 및 속도 데이터가 표시됩니다.

비디오는 오른쪽에 음극이 배치된 상태로 시작됩니다. 유리 피펫이 나타나면 곧 방향 전환이 일어날 것임을 나타내며, 이후 피펫이 제거되면 신호를 보냅니다. 여기서 방향 전환이 일어나는 순간, 비디오 속 벌레에 대해 맞춤형 벌레 추적 프로그램이 출력한 시간 대비 위치 데이터와 시간 대비 순간 속도 데이터가 표시됩니다. 프로그램은 위치-시간 곡선으로부터 속도 곡선을 계산하였습니다.

이 상자 그림은 야생형 및 형질전환 동물의 전기 주성 속도 데이터를 나타냅니다. T 형질전환 동물은 UNC 54 미오신 중쇄 유전자 프로모터의 제어 하에 체벽 근육에서 인간 알파-시누클레인 유전자를 발현하며, 이는 단백질 응집을 유발하여 야생형 동물보다 느린 전기 주성 반응으로 나타납니다. 숙달되면 전기 주성 실험을 적절히 수행할 경우 매 시간 20마리 이상의 벌레를 분석할 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때, 운동 능력이나 전기 감각에 영향을 주는 돌연변이 및 화학 물질만이 전기 택시스 분석법으로 검출 가능한 표현형을 나타낸다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청한 후, 실리콘 패턴 형성 방법, 미세 유체 채널 조립 방법, 그리고 전기 택시스 분석법을 이용한 N. method의 운동 능력 분석 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.