의 주문형 정량 분석​​을위한 미세 유체 기반 Electrotaxis Caenorhabditis의 엘레 '로코

이 절차의 전반적인 목표는 화학적 노출 또는 유전자 조작 후 C Allergan's model organism에서 신경 및 신경근 신호의 이상을 식별하는 것입니다. 이는 먼저 마이크로채널 패턴을 설계하고 실리콘 웨이퍼에 에칭함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서는 실리콘 몰드를 사용하여 PDMS에서 하나 이상의 마이크로 채널을 주조합니다.

그런 다음 액세서리 구성 요소가 PDMS 금형에 부착됩니다. 다음으로, 마이크로 채널을 통해 수영하도록 자극을 받은 벌레의 행동을 현미경에 장착된 카메라를 사용하여 기록합니다. 궁극적으로, 전기 미세유체역학(electro microfluidics)은 선충류, 신경세포, 근육계의 변화를 측정하는 데 사용되며, 이동을 판독값으로 이용한 화학적 또는 유전적 조작으로 인한 것입니다.

따라서 기존 기술, 특히 플레이트 기반 행동 분석에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 기술을 사용하면 웜의 이동 방향을 엄격하게 제어할 수 있어 몸체 굽힘 빈도, 회전 시간 및 수영 속도와 같은 기관차 거동을 정확하게 정량화할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 신경 보호 특성을 가진 화학적 및 유전적 요인을 선별하는 데 사용할 수 있기 때문에 파킨슨병 및 알츠하이머병과 같은 신경퇴행성 질환 치료로 확장됩니다. 이 기술에 대한 아이디어는 메소드 이동 동작을 정량적으로 분석할 수 있는 방법이 부족하다는 것을 깨달았을 때 처음 떠올랐습니다.

움직임은 자발적이고 무작위적이며, 이를 규정하기 어렵습니다. 그래서 우리는 모든 사람이 배울 수 있는 쉬운 방법을 확립하고 싶었습니다: 마스터 몰드를 만드는 방법은 3인치 실리콘 웨이퍼에 아세톤을 바르고 메탄올을 각각 30초 동안 담그는 것으로 시작합니다. 그런 다음 웨이퍼를 탈이온수로 5분 동안 헹굽니다.

다음으로, 질소 블로우 건을 사용하여 웨이퍼 표면을 건조시킨 다음 2분 후에 섭씨 120도의 핫 플레이트에서 웨이퍼를 가열하고 1분 동안 50와트의 실리콘 웨이퍼 표면을 플라즈마로 산화합니다. 이제 3 밀리리터의 SU 8 100 포토 레지스트를 사용하여 웨이퍼 표면을 1, 750 RPM으로 40 초 동안 스핀 코팅 한 다음 코팅 된 웨이퍼를 섭씨 65도의 핫 플레이트에서 사전 베이킹합니다. 10분 후 2분에 걸쳐 온도를 섭씨 95도까지 높이고 웨이퍼를 한 시간 더 굽습니다.

핫 플레이트에서 웨이퍼를 제거한 후 웨이퍼 위에 원하는 디자인의 포토 마스크를 배치합니다. 포토 레지스트를 자외선에 95초 동안 노출시킵니다. 그런 다음 포스트 베이킹 후 사전 베이킹에 사용된 것과 동일한 온도 구배를 사용하여 핫 플레이트에서 웨이퍼를 포스트 베이킹합니다.

웨이퍼를 SU 8에 담그십시오. 10-15분 동안 솔루션을 개발합니다. 웨이퍼를 이소프로판올로 헹구어 설계 개발이 완료되었는지 확인합니다.

그런 다음 탈이온수로 30초 동안 헹굽니다. 마지막으로 질소 건으로 웨이퍼를 건조시키고 섭씨 120도에서 잠시 굽습니다. 이제 제작된 마스터 몰드와 빈 실리콘 웨이퍼를 알루미늄 호일이 늘어선 두 개의 별도 페트리 접시에 넣습니다.

20ml의 PDMS 프리 폴리머를 마스터 몰드 및 접시에 붓고 15ml를 빈 웨이퍼 접시에 붓습니다. 다음으로, 일회용 나무 애플리케이터로 웨이퍼를 부드럽게 눌러 웨이퍼 아래의 공기 주머니를 제거한 다음 두 접시를 모두 덮고 경화를 위해 하루 동안 따로 보관합니다. 웨이퍼가 경화된 후 호일을 제거하고 PDMS를 벗겨냅니다.

그런 다음 2.5mm Harris 유니콘을 사용하여 마스터 몰드에서 PDMS의 채널 양쪽 끝에 있는 유체 액세스 포트를 펀칭합니다. 두 PDMS 디스크를 비슷한 크기의 스트립으로 자릅니다. 그런 다음 클린룸에서 채널, 빈 PDMS 스트립 및 유리 슬라이드를 플라즈마 산화제에 로드합니다.

재료를 40초 동안 40와트의 전력으로 산소 플라즈마에 노출시킵니다. 그런 다음 채널 조각과 유리 슬라이드를 블랭크 스트립의 반대쪽에 붙이고 재료를 따로 보관하여 접착을 완료합니다. 2시간 후 PDMS 프리폴리머를 사용하여 최소 6인치 길이의 플라스틱 튜브 두 개를 섭씨 120도의 핫플레이트에 펀칭된 저장소에 부착합니다.

계속하기 전에 PDMS가 경화되도록 합니다. 그런 다음 주사기를 부착할 수 있도록 튜브 중 하나에 유체 플라스틱 커넥터를 부착합니다. 이제 3인치 길이의 22게이지 절연 구리선을 입구 튜브와 채널 사이의 각 저장소에 삽입하여 더 많은 PDMS 프리 폴리머로 와이어를 고정합니다.

방금 조립된 마이크로채널을 모니터에 연결된 장착된 카메라가 있는 현미경의 XY 이동식 스테이지에 배치하고 전원 공급 장치를 마이크로채널 전극에 연결하여 이 단계를 시작합니다. 마이크로 채널의 저항이 약 0.6 메가 옴임을 확인한 후 마이크로 채널의 출력 튜브를 일회용 주사기에 부착합니다. 그런 다음 입구 튜브의 입을 M nine 생리학적 완충액에 현탁된 선충 용액에 담그십시오.

주사기 내부에 음압을 가하여 액체를 채널로 흡입합니다. 입구와 출구 튜브가 모두 채워지면 주사기와 정수식을 분리하십시오. 튜브의 상대적 높이를 조정하여 웜을 채널 중앙에 배치하여 흐름을 조작합니다.

그런 다음 두 튜브를 동일한 높이에 평평하게 놓아 마이크로 채널 내부의 흐름을 0으로 유지합니다. 일렉트로 택시 실험 중 웜 샘플을 전환할 때 두 흡입 튜브를 동일한 높이로 수평을 맞춘 후 여전히 흐름이 남아 있으면 서로에 대한 튜브의 높이를 약간 조정합니다. 흐름이 실제로 0인지 확신할 수 없는 경우 전기장의 극성을 변경한 다음 웜이 회전할 때 웜의 선형 속도를 평가하여 웜의 움직임을 역전시킬 수 있습니다.

이제 전원 공급 장치를 적절한 전압으로 설정하십시오. 전기 신호를 활성화하고 웜이 자기장에 적응할 때까지 1분 동안 사전 노출을 허용하며, 이 시간 동안 웜은 1분이 지나면 음극을 향해 움직이기 시작해야 합니다. 녹음을 시작합니다.

실험이 끝나면 채널에서 모든 액체와 벌레를 제거합니다. 챔버를 탈이온수로 헹구고 장치를 섭씨 125도의 핫 플레이트에 올려 건조시킵니다. 이 대표적인 비디오에서는 야생형 청년 성인 선충 전기축과 지렁이 추적 소프트웨어의 위치 및 속도 출력이 표시됩니다.

비디오는 오른쪽의 음극으로 시작됩니다. 유리 피펫의 출현은 임박한 반전, 피펫 신호의 후속 제거를 나타냅니다. 여기서 역전의 순간, 웜에 대한 맞춤형 웜 추적 프로그램의 위치 대 시간 및 순간 속도 대 시간 출력에 대한 데이터는 비디오에서 프로그램이 위치 시간 곡선에서 속도 곡선을 계산한 것으로 표시됩니다.

이 상자 그림에는 야생형 및 도랑 동물 집합의 전기 속도 데이터가 표시됩니다. T 형질전환 동물은 UNC 54 미오신 중쇄 유전자 프로모터의 통제하에 체벽 근육에서 인간 알파-시누클레인 유전자를 발현하며, 이는 단백질 응집을 일으키고 야생형 동물보다 느린 전기 전술 반응으로 나타납니다. 일단 숙달되면 전기 택시 실험이 제대로 수행되면 시간당 20개 이상의 벌레를 분석할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 운동 또는 전기 감각에 영향을 미치는 돌연변이와 화학 물질만이 전기 세금 분석으로 검출할 수 있는 표현형을 생성한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 실리콘을 패턴화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 우리는 미세유체 채널을 조립하고 axxis assay를 사용하여 N 방법의 이동을 분석하는 방법을 수집했습니다.