Name: 단백질 발현의 정량 분석은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: 학습하세요 마우스 착상 전 배아에서 단백질 발현을 정량 분석하는 방법을 공초점 현미경 이미지와 단일 세포 해상도를 활용하여 리니지 사양을 연구합니다. 이 기법은 발달 생물학 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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저자는 데이터 처리, 분석 및 표현에 대한 의견을 제시해 준 Stefano Di Talia, Alberto Puliafito, Venkatraman Seshan 및 Panagiotis Xenopoulos, 면역형광 프로토콜 설계 및 항체 검사에 도움을 준 Berenika Plusa, 원고와 이 프로토콜의 개발에 대해 의견을 제시한 Hadjantonakis 연구실 구성원에게 감사의 뜻을 전합니다. 우리 연구실의 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health) R01-HD052115 및 R01-DK084391과 NYSTEM N13G-236의 지원을 받고 있습니다.

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<li>Kang, M., Piliszek, A., Artus, J., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF4+is+required+for+lineage+restriction+and+salt-and-pepper+distribution+of+primitive+endoderm+factors+but+not+their+initial+expression+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF4 is required for lineage restriction and salt-and-pepper distribution of primitive endoderm factors but not their initial expression in the mouse.</a> Development. 140 (2), 267-279 (2013).</li>
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</ol>

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

본 프로토콜은 착상 전 단계 마우스 배아에서 전체 마운트 면역의 정량 분석​​을 수행하는 방법을 설명합니다. 강력한 면역 프로토콜 (22)는 고해상도의 뒤에, (4)의 소프트웨어 맞춤 부재를 사용하는 공 초점 이미지 및 이미지 분할을하여 전체를 실장. 면역 프로토콜의 선택은 중요하지 않지만, 우리는 빠르고 안정적으로 우리는 시험 한 항체의 많은 강력한 신호를 제공하기 위해 여기 22 제시 한 검색. 다음 될 수있는 다른 프로토콜, 애플리케이션은 동일 실험에서 일관 제공된다. 여러 가지 요소가 반드시 할 수 없습니다 실험 사이의 각 개별 실험의 결과와 직접 비교에 영향을 미치는 동안, 우리는 반복 일관성을 위해 노력하고 충분한 기술적 복제를 수행하는 큰 변동성을 줄일 것으로 나타났습니다. 따라서, 한 번 최적화, 고정 및 immunolabeling 시약 및 프로토콜뿐만 아니라, 촬상 조건이 동등 실험 간의 일정하게 유지되어야한다. <p class="jove_con...

마우스 착상 전 배아 세포 운명 명세서 및 포유 동물에서 상피 새로이 연구 출현 생체 능성의 유지뿐만 아니라, 모델을 학습하는 패러다임이다. 두 배외 (extraembryonic) 계통, trophectoderm (TE)와 - 대부분의 체세포 조직 및 생식 세포에 상승을 제공 - 포유류 개발의 착상 전 단계는 배반포, 즉 만능 epiblast을 구성하는 세 가지 세포 계통의 확립에 최선을 다하고 있습니다 원시 내배엽 (예정) (그림 1A) 1,2. 이 프로토콜은, (2), 관심의 단백질을 라벨 면역 형광을 수행 (3) Z-절편 기능과 함께 공 초점 현미경을 사용하여 이미지를 마운트 전체 수행 (1) 수확 및 수정 착상 전 단계 마우스 배아에 대한 절차를 설명 (4) 공 초점 이미지와 이후의 양적 이미지 분석의 핵 분할을 수행합니다. 이 파이프 라인은 t 수 있습니다그 자리에서 세포의 개체군을 특성화 셀 아이덴티티 할당을 위해 단백질 수준을 측정 바이어스. 데이터 분석 (도 1b)에 배아 컬렉션 (일반적으로 10 마우스 배아까지) 한 쓰레기 4 일 -이 프로토콜은 적은 3로 수행 될 수있다. 여러 리터의​​ 동시 분석에 따라서 프로토콜의 전체 길이를 연장하는, 촬상 데이터 분석 시간 부담을 증가시킨다. 착상 전 단계 마우스 배아는 작은 크기와 진부한 형태 3 제공, 단일 셀 해상도 세포 과정의 토토 영상에 적합하다, 실험적으로 다루기 쉬운 시스템입니다. 배아의 통계적으로 중요한 수의 편향, 시스템 레벨 분석을 수행하는, 자동화 된 정량 분석​​ 파이프 바람직하다. 그러나, 내부 세포괴 높은 핵 밀도의 배반포 (ICM)에 의한 ( <st룽&gt;도 1a,도 2D), 종래의 이미지 분할 플랫폼은 자동화 또는 반 자동화 된 작업 흐름을 확립하기에 충분한 정확도를 제공하지 못한다. 한편, 수동 세분화 정확하면서 세포 및 배아 큰 집단의 처리를 허용하지 않으며, 셀 아이덴티티 재현성 편향 판에 적합 - 발달 단계를 연구 할 때 특히 중요 여기서 마커 패턴 표현은 완전히 (예를 들면, 인구에 걸쳐 진 분포를 나타내지 않는다)가 해결되지. 최소한의 사용자 입력 4-8을 필요로하는 동안 우리는 최근에, 마우스 착상 전 단계의 배아과 높은 정확도를 달성 마우스 배아 줄기 세포 (는 ESC)에 맞춰 이미지 분할 방법을 개발하고 검증했다. 여기에 제시된 분석 파이프 라인은 MATLAB 기반의 영상 분할 도구 모듈 형 인터랙티브 핵 분할 (분) (4)를 중심으로 돌아 가지. MINS 피사용자는 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI) (표 1) (4)를 이용하여, 이미지 속성의 최소 수를 설정 한 후 촛점 Z-스택 대규모 배치에서 자율 핵 분할 erforms. 이 파이프 라인은 모두 야생형 단백질의 발현 및 세포 국산화 높은 처리량 데이터의 생성 효율이 입증 된 실험적 치료 및 유전자 배아는 ESC 5-7 변성. 본 프로토콜에서, 우리는 착상 전 단계의 배아 이미지의 분할에 MINS의 응용 프로그램을 설명합니다. 는 ESC에 MINS 성능의 예를 들어 4,7 참조하십시오. 자동화 핵 분할 단계는 크게 공간 형광 세기 측정은 배아 세포 아이덴티티 바이어스 결정 및 유전자 발현 도메인 및 셀 위치의 3 차원지도를 생성 할 수있는 반면 (도를 셀 구분 처리시의 부담을 줄일 1C </strong&gt;). 또한,이 워크 플로의 확장 성을 실험적으로 처리 된 배아, 또는 다른 유전 적 배경 5,6의 배아의 큰 집단을 통해 개별 새끼의 분석은 적용한다. 분 (소프트웨어 MATLAB 라이센스가 필요합니다) http://katlab-tools.org에서 자유롭게 사용할 수 있습니다. 현재까지 개발 된 어떤 접근 방식은 마우스 착상 전 배아의 단백질 발현 및 세포 현지화에 같은 깊이있는 데이터의 생성을 허용하지 않습니다. 모든 시도는 지금까지 이러한 유형의 데이터를 정량화 수동 판정 다른 집단에 대한 세포 수를 정량 배아 (전체가 수동으로, 또는 소프트웨어 보조 식) 9-19로 제한되어왔다. (MINS 소프트웨어를 포함)이 접근 방식에 맞춰 마우스 착상 전 배아와는 ESC에서 테스트되었습니다; 그럼에도 불구하고 높은 핵 밀도가 다른 시스템의 성능은 아직 검증되지 않은 있지만, 상당 할 것으로 예상된다.

<table><tbody><tr><td>Embryo collection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blunt probe for plug check roboz</td><td></td><td>RS-9580</td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td>roboz</td><td>RS-4978</td><td></td></tr><tr><td>수술 가위</td><td>roboz</td><td>rs-5910</td><td></td></tr><tr><td>유리 파스퇴르 피펫</td><td>Fisher</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>사전 조립된 흡인기 튜브 & 마우스피스</td><td>Sigma</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>긴 고무 튜빙</td><td>Fisher</td><td>14-178-2AA&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>M2</td><td>Millipore</td><td>MR-015-D</td><td></td></tr><tr><td>FHM</td><td>Millipore</td><td>MR-024-D</td><td></td></tr><tr><td>Acid Tyrode의 용액</td><td>Millipore</td><td>MR-004-D</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>4-웰 플레이트</td><td>Nunc/Thermo-Fisher</td><td>12-566-300&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Immunofluorescence</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well U-bottom plates</td><td>Fisher</td><td>14-245-73</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G7403</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>Sigma</td><td>H0146</td><td></td></tr><tr><td>Primary antibodies</td><td></td><td></td><td><강한>농도</강한></td></tr><tr><td>CDX2</td><td>바이오제넥스</td><td>AM392-5M</td><td>1:200</td></tr><tr><td>GATA6</td><td>R& D</td><td>AF1700</td><td>1:100</td></tr><tr><td>GATA4</td><td>산타 크루즈</td><td>sc-9053</td><td>1:100, 10 분 고정</td></tr><tr><td>GATA4</td><td>산타 크루즈</td><td>sc-1237</td><td>1:100, O / N 고정</td></tr><tr><td>SOX17</td><td>R & D</td><td>AF1924</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Nanog</td><td>ReproCELL</td><td>RCAB0002P-F</td><td>1:500</td></tr><tr><td>OCT4</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td>1:100, O/N 고정까지 10분</td></tr><tr><td>DAB2</td><td>BD</td><td>BD-610464</td><td>1:200</td></tr><tr><td>2차 항체</td><td>Life Technologies</td><td>Various</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>이미징</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35mm 유리 바닥 접시</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Segmentation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computer running 64-bit Windows OS</td><td></td><td>n/a</td><td>http://katlab-tools.org 및 Lou et al., (2014) Stem Cell Reports</td></tr><tr><td>MATLAB (software)</td><td>에서 최소 시스템 요구 사항 확인Mathworks</td><td>해당 없음</td><td></td></tr><tr><td>MINS (소프트웨어)</td><td>무료</td><td>해당 없음</td><td>http://katlab-tools.org</td></tr></tbody></table>

단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

이 프로토콜은 방법은 정량적 수행하기 위해 제공, 현장에서 단일 셀 혈통 사양을 연구하는 단백질 발현 분석 마우스 착상 전 배아에서. 배아 수집, 면역, 공 초점 현미경 영상 및 이미지 세분화 및 분석에 필요한 절차를 설명한다. 이 방법은 여러 핵 마커의 발현 및 공간 (XYZ)의 정량은 태아의 모든 셀의 좌표를 허용한다. 그것은 MINS, 특히 착상 전 배아 및 배아 줄기 세포 (ESC) 식민지의 공 초점 이미지의 분석을 위해 개발 한 이미지 분할 소프트웨어 툴을 활용합니다. 분 X, Y 및 Z 차원 걸쳐 자율 핵 세그멘테이션을 수행하고, 최소한의 사용자 입력을 모든 채널에 대해 3 차원 공간에서 셀의 위치에 대한 정보뿐만 아니라, 핵 형광 레벨을 생성한다. 이 프로토콜은 화상의 분석을 위해 최적화되어 있지만착상 전 단계의 마우스 배아, 그것은 쉽게 양호한 신호 대 잡음비 및 여기서 높은 핵 밀도 (이미지 분할에 장애물 포즈 등., 배아 줄기 세포의 발현 분석을 나타내는 임의의 다른 시료의 분석 (ESC에 적용 할 수있다 ) 식민지 문화의 셀, 다른 종 또는 단계 등)의 배아를 차별화.

데이터 해석 및 프리젠 테이션을 용이하게하기 위해주의가 모든 세포의 상대적인 위치를 분석 할 수 있도록, 수집 및 조작시 배아를 손상시키지 않도록주의해야한다도 2a를 -. D는 팽창 캐비티와 다른 단계에서 그대로 포배의 예를 나타낸다. 발생하는 손상 경우, 별도의주의를 분석하고 결과를 해석 할 때주의해야한다. 이 프로토콜을 이용하여 생성 된 데이터의 품질과 신뢰성이 정착 품질에 대한 관심의 단백질을 검출하기 위해 사용 된 항체의 신호 대 잡음 비에 의존한다. 항상 신선한 정착액을 사용하여 실험 세트를 시작하기 전에, 적절한 양성 및 음성 컨트롤, 새로운 항체를 테스트합니다. 그림 2a는 핵 단백질의 수에 대한 좋은 항체의 예를 보여줍니다. 그림 2b는 exampl를 보여...

이 프로토콜은 마우스 착상 전 배아 계통 명세서를 연구하는 단백질 발현의 정량적 분석 시츄, 단일 셀을 수행하는 방법을 제시한다. 포배의 수집에 필요한 절차, 단백질의 면역 검출을 전체 마운트, 공 초점 현미경, 핵 세분화 및 이미지 분석에 샘플 영상은 설명한다.

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 마우스 착상 전 배아의 제자리 단백질 수준을 정량화하는 것입니다. 따라서 이 방법을 사용하면 반자동 방식으로 단일 세포 해상도로 컨포칼 현미경 이미지의 고처리량 분석을 수행할 수 있습니다. 이 방법은 핵 밀도가 높고 세포 집단 내의 이질성을 연구하려는 경우 컨포칼 이미지에서 단백질 농도를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.시작하려면 유리 파스퇴르 피펫에 화염을 사용하여 끝에 모세관 끝을 그립니다. 피펫의 반대쪽 끝을 모세관에 부드럽게 문질러 모세관을 부수면서 뭉툭한 끝을 만듭니다. 원하는 배아 발달일에 임신한 암컷 마우스를 희생한 후, 텍스트 프로토콜에 따라 복부 내장을 노출시키고 자궁을 찾습니다.경추 끝을 잡고 자궁경부를 잘라낸 다음 양쪽 자궁 뿔을 늘리기 위해 부드럽게 위로 당깁니다. 자궁 벽을 뚫지 않도록 주의하면서 지방을 잘라냅니다. 난관 위, 난소 아래를 잘라 자궁 전체를 분리하고 페트리 접시에 놓습니다.다음으로, PBS로 자궁을 덮고 자궁경부 양쪽의 근위부 끝을 잘라 양쪽 자궁 뿔을 분리합니다. 그런 다음 자궁에서 각 난관을 연결하는 협부 아래를 잘라 분리합니다. 해부 현미경에서 피하 주사바늘이 달린 1mL 주사기를 사용하여 경추 구멍에서 각 뿔을 통해 0.5-1mL의 배지를 밀어 넣어 배반포를 자궁 밖으로 내보내고 조작 배지로 밀어 넣습니다.세척 후 배반포가 접시 바닥으로 가라앉을 때까지 최대 1-2분 정도 기다립니다. 그런 다음 배반포를 찾고 모세관 끝이 있는 입으로 조절되는 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 배반포를 수집하고 새로운 배지 방울로 옮깁니다. 배반포를 헹군 후 Acidic Tyrode's Solution을 사용하여 배아를 잠시 씻어 투명대를 제거합니다.구역이 더 이상 보이지 않게 되는 즉시 배반포를 조작 배지로 다시 옮기십시오. 배반포를 실온 PBS에서 세척한 후 실온에서 10분간 PBS에 4%PFA로 옮겨 고정합니다. 고정 후 배반포를 PBS로 다시 옮겨 섭씨 4도에서 보관합니다.텍스트 프로토콜에 따라 면역형광을 수행한 후 미세한 입 피펫을 사용하여 35mm 유리 바닥 접시의 유리 표면에 PBS 또는 핵 염색 용액의 마이크로드롭을 만들고 미네랄 오일로 덮습니다. 배아를 마이크로드롭에 넣고 일관된 방식으로, 가급적이면 ICM 캐비티 접근이 유리 표면과 평행하도록 배열한 다음 현미경 홀더에 접시를 설정합니다. 컨포칼 이미징을 수행하려면 형광단을 표백하지 않고 강력한 신호 대 잡음비를 제공하는 가장 낮은 레이저 출력을 사용하십시오.게인과 오프 세트를 조정하여 샘플을 과도하게 노출하지 않고 가장 넓은 다이내믹 레인지를 얻을 수 있습니다. 그레이스케일 범위의 대부분 또는 전체를 캡처하면 이미지 간의 작은 강도 차이를 쉽게 감지할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 추가 세부 정보를 따라 전체 Z축에 걸쳐 배아를 이미지화합니다.MATLAB 기반 분할 툴인 MINS(Modular Interactive Nuclear Segmentation)의 그래픽 사용자 인터페이스를 따라 컨포칼 이미지 또는 현미경으로 생성된 원시 데이터의 전체 Z 스택을 불러올 수 있습니다. 각 단계의 결과를 보려면 해당 보기"버튼을 클릭하십시오. 버튼 위의 노란색 태그는 진행 중인 작업을 나타냅니다.녹색 태그는 작업이 완료되었음을 나타냅니다. 세분화를 진행하기 전에 감지 단계의 결과를 평가합니다. 만족스럽지 않으면 감지 매개변수를 수정하고 다시 실행하십시오.배치 모드"실행 메뉴에서 파일 추가"를 클릭하고 처리할 모든 파일을 한 번에 로드합니다. 배치 모드 실행 시작을 클릭하십시오"소프트웨어가 파일을 처리할 시간을 허용합니다. 세분화 출력은 원본 파일과 동일한 디렉토리에 저장됩니다.apoptotic vesicles 또는 온전한 핵은 아니지만 MINS에 의해 식별되었을 수 있는 기타 요소와 같은 거짓 긍정을 식별합니다. starstatistics에서 거짓 긍정에 해당하는 레코드를 삭제합니다. CSV 파일.나중에 참조할 수 있도록 원본 starstatistics. csv 파일을 보존하고 복사본만 편집합니다. 핵이 과도하게 분절되어 두 개 이상의 핵으로 표시되는 경우, 강도 수준의 평균을 내어 기록을 병합하거나 해당 세포에 대한 기록 중 하나를 유지하고 나머지는 폐기합니다.세분화 문제를 해결하려면 MINS가 두 개 이상의 핵 사이의 경계를 감지하지 못하고 단일 핵으로 분할한 이벤트 또는 핵을 완전히 감지하지 못한 이벤트를 식별합니다. ImageJ를 사용하여 언더 또는 세그먼트화되지 않은 셀의 각 채널에 대한 평균 그레이 레벨을 측정합니다. 다음으로, 자유형 선택 도구를 사용하여 DNA 채널에서 아래쪽 또는 분할되지 않은 핵의 내측 부분을 찾고 아래쪽 또는 분할되지 않은 핵의 둘레를 간략하게 설명합니다.그런 다음 Control M"을 누르거나 분석" 메뉴로 이동하여 측정을 선택합니다."이렇게 하면 윤곽선 영역의 평균 회색 값이 기록되고 새 창에 표시됩니다. DNA 채널에서 방금 선택한 것과 동일한 윤곽선 영역을 사용하여 관심 있는 각 형광 채널의 측정을 반복합니다. 결과는 측정 결과 창에서 이전 결과로 뒤집힙니다.그런 다음 얻은 측정값을 사용하여 starstatistics. csv 파일의 잘못된 레코드를 바꿉니다. 핵이 과소 분절된 경우 해당 행을 복제하고, 각각의 새 세포에 다른 세포 ID를 할당하고, ImageJ에서 얻은 값을 해당 열 아래에 도입합니다.이 경우 두 셀은 공간 좌표를 공유합니다. 분석에서 유사분열 핵을 별도로 고려해야 하는 경우 수동으로 점수를 매기고 데이터 파일에 정보를 추가합니다. 추가 이미지 처리 지침은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오.이 그림은 확장된 공동이 있는 여러 단계에서 온전한 배반포의 예를 보여줍니다. 다음은 CDX2, GATA4, GATA6, NANOG 및 OCT4를 포함한 여러 핵 단백질에 대한 우수한 항체의 예입니다. 이 샘플은 높은 신호 대 잡음비를 제공하는 세포질 단백질 DAB2로 표지되었습니다.이 패널에서는 신호 대 잡음비가 낮은 GATA4에 대한 불량 염색의 예가 표시되며, 여기서 샘플은 10분 동안만 고정되었습니다. 이 특정 항-GATA4 항체는 강력한 신호를 제공하기 위해 하룻밤 동안 고정이 필요합니다. 이러한 배아는 NA 1.30 및 0.21mm working distance를 가진 40x 오일 이멀젼 대물렌즈로 이미지화되었으며, 중간 패널은 ICM 또는 개별 핵의 배율을 보여주며 이들 사이의 경계를 구별할 수 있습니다.하단 패널은 배아가 더 발전할수록 핵 밀도가 높아지고 따라서 분할 오류의 가능성이 더 커지는 방법을 보여줍니다. 이러한 이미지는 MINS가 범할 수 있는 오류(예: apoptotic nuclei를 살아있는 세포로 감지, 과다 분할 또는 과소 분할)를 보여줍니다. 이 Z 슬라이스 시퀀스는 두 개의 세포가 하나로 식별된 과소 분할 이벤트를 나타냅니다.일단 숙달되면 이 프로토콜은 처음부터 끝까지 3-4일 만에 수행할 수 있으며 하루에 2-4시간의 시간 부담이 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안 실험 조건, 즉 면역형광 프로토콜 및 이미징 매개변수와 매우 일관성을 유지하는 것이 중요합니다. 개발 후 이 기술은 마우스 발달 생물학 분야의 연구자들이 단일 세포에서 유전자 및 단백질 발현의 현장 정량 분석을 수행할 수 있는 길을 열었습니다.이 비디오를 시청한 후에는 정량적 in situ 발현 분석에 적합한 이미지 데이터를 획득하는 방법을 잘 이해할 수 있을 것입니다.

quantitative-analysis-protein-expression-to-study-lineage

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 마우스 배아 조직에서 조직 특정 유전자 발현의 시작하는 동안이나 이후에 조직 특정 유전자의 상호 작용 요소를 식별하는 방법은 염색질의 immunoprecipitation (칩)을 보여줍니다. 그것이 정상적인 배아 발달 동안 발생으로이 프로토콜은 조직 특정 유전자 활성화의 연구에 대해 광범위하게 적용되어야합니다.

초기 마우스 배아를 사용하는 조직 특정 유전자에 대한 염색질의 Immunoprecipitation 분석

어린 배아 마우스 판막의 단백질 발현 분석은 이용 가능한 조직의 한계로 인해 방해를 받았습니다. 이 원고는 웨스턴 블롯 분석을 위해 발달 중인 배아 마우스 판막 영역에서 단백질을 준비하기 위한 프로토콜을 제공합니다.

개발 배아 마우스 심장 밸브 지역에서 단백질 분리

이 프로토콜의 목표는 loss-을 설명하고 이득의 trophectoderm 및 착상 마우스 배아의 내부 세포 덩어리 분화에 이르게 무대 특정 수용체​​로 neogenin 확인할 적용 기능 방법입니다.

착상 전의 마우스 배아의 초기 세포 운명 결정 요인을 조사 할 Loss- 및 이득 -의 - 기능 접근

segmentation clock는 PSM(pre-somitic mesoderm)에서 진동 유전자 발현을 구동합니다. Dynamic Notch 활동은 이 프로세스의 핵심입니다. 우리는 이미징 및 컴퓨터 분석을 사용하여 공간 표현 데이터에서 시간 역학을 추출하여 델타 리간드와 노치 수용체 발현이 척추동물 PSM에서 진동한다는 것을 입증합니다.

자세한 공간 식지도에서 동적 식 데이터의 시간적 순서

이 방법은 단백질 레벨과 다른 조직에서 표준화 된 양적 서쪽 더 럽 히 접근을 사용 하 여 다른 발달 timepoints에서의 비교에 대 한 강력 하 고 재현 가능한 방식을 설명 합니다.

단백질 수준 및 개발 표준화 양적 부 럽을 사용 하 여 전체 조직에 걸쳐 강력한 비교

이 작품은 한 번의 하룻밤 실행에 80-100 C. 예쁜 꼬마 배아에서 배아의 동시 3D 시간 경과 영상을 허용하는 반 높은 처리량 프로토콜을 설명합니다. 또한 데이터 분석을 간소화하기 위해 이미지 처리 및 시각화 도구가 포함되어 있습니다. 사용자 정의 리포터 균주와 이러한 방법의 조합은 배아 발생의 상세한 모니터링을 가능하게.

C. elegans 배아 개발을 분석하는 세미 고처리량 이미징 방법 및 데이터 시각화 툴킷

여기에서 우리는 마우스 배아 조직에서 유전자 발현을 프로파일링하는 다중단일 세포 mRNA 염기서열 분석방법을 제시했다. 멀티플렉싱 전략과 결합된 액적 기반 단일 세포 mRNA 염기서열 분석(scRNA-Seq) 방법은 여러 샘플에서 단일 세포를 동시에 프로파일링할 수 있어 시약 비용을 크게 줄이고 실험 배치 효과를 최소화합니다.

마우스 배아 세포의 다중화 단세포 mRNA 염기서열 분석

우리는 초기 마우스 배아에 있는 microRNAs를 프로파일링하기 위한 기술을 기술합니다. 이 프로토콜은 낮은 세포 입력 및 작은 RNA 농축의 도전을 극복합니다. 이 분석은 초기 마우스 배아의 상이한 세포 계보에서 시간이 지남에 따라 miRNA 발현의 변화를 분석하기 위하여 이용될 수 있다.

초기 마우스 배아에서 시퀀싱을 위한 작은 RNA 라이브러리 의 준비

여기에서 우리는 척추동물 Xenopus laevis 배아에서 알려진 조직 운명을 가진 세포 계통의 질량 분석 기반 단백질체 특성 분석을 설명합니다.

발달 중인 (개구리) 배아의 세포 계통 유도 질량 분석법 단백질체학

이 논문은 단일 세포 및 핵의 염기서열 분석을 위한 gastrulating mouse embryos의 고품질 single-cell 및 nuclei suspensions를 위한 파이프라인을 설정합니다.

돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지

이 프로토콜은 초기 인핸서 전사체를 정량화하기 위한 간소화된 계산 파이프라인을 제공합니다. 염색질 접근성, 염색질 특징 및 전사 데이터를 통합함으로써 복잡한 유전자 내 영역에서 인핸서 활성에 대한 정확한 검출 및 가닥 특이적 분석을 가능하게 하는 동시에 광범위한 생물정보학 교육 없이도 연구자가 접근할 수 있습니다.

마우스 배아 줄기 세포에서 유전자 간/유전자 내 인핸서 RNA 정량화를 위한 계산 파이프라인

학습하세요 마우스 착상 전 배아에서 단백질 발현을 정량 분석하는 방법을 공초점 현미경 이미지와 단일 세포 해상도를 활용하여 리니지 사양을 연구합니다. 이 기법은 발달 생물학 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

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