단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

이 프로토콜의 전반적인 목표는 마우스 착상 전 배아의 제자리 단백질 수준을 정량화하는 것입니다. 따라서 이 방법을 사용하면 반자동 방식으로 단일 세포 해상도로 컨포칼 현미경 이미지의 고처리량 분석을 수행할 수 있습니다. 이 방법은 핵 밀도가 높고 세포 집단 내의 이질성을 연구하려는 경우 컨포칼 이미지에서 단백질 농도를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.

시작하려면 유리 파스퇴르 피펫에 화염을 사용하여 끝에 모세관 끝을 그립니다. 피펫의 반대쪽 끝을 모세관에 부드럽게 문질러 모세관을 부수면서 뭉툭한 끝을 만듭니다. 원하는 배아 발달일에 임신한 암컷 마우스를 희생한 후, 텍스트 프로토콜에 따라 복부 내장을 노출시키고 자궁을 찾습니다.

경추 끝을 잡고 자궁경부를 잘라낸 다음 양쪽 자궁 뿔을 늘리기 위해 부드럽게 위로 당깁니다. 자궁 벽을 뚫지 않도록 주의하면서 지방을 잘라냅니다. 난관 위, 난소 아래를 잘라 자궁 전체를 분리하고 페트리 접시에 놓습니다.

다음으로, PBS로 자궁을 덮고 자궁경부 양쪽의 근위부 끝을 잘라 양쪽 자궁 뿔을 분리합니다. 그런 다음 자궁에서 각 난관을 연결하는 협부 아래를 잘라 분리합니다. 해부 현미경에서 피하 주사바늘이 달린 1mL 주사기를 사용하여 경추 구멍에서 각 뿔을 통해 0.5-1mL의 배지를 밀어 넣어 배반포를 자궁 밖으로 내보내고 조작 배지로 밀어 넣습니다.

세척 후 배반포가 접시 바닥으로 가라앉을 때까지 최대 1-2분 정도 기다립니다. 그런 다음 배반포를 찾고 모세관 끝이 있는 입으로 조절되는 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 배반포를 수집하고 새로운 배지 방울로 옮깁니다. 배반포를 헹군 후 Acidic Tyrode's Solution을 사용하여 배아를 잠시 씻어 투명대를 제거합니다.

구역이 더 이상 보이지 않게 되는 즉시 배반포를 조작 배지로 다시 옮기십시오. 배반포를 실온 PBS에서 세척한 후 실온에서 10분간 PBS에 4%PFA로 옮겨 고정합니다. 고정 후 배반포를 PBS로 다시 옮겨 섭씨 4도에서 보관합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 면역형광을 수행한 후 미세한 입 피펫을 사용하여 35mm 유리 바닥 접시의 유리 표면에 PBS 또는 핵 염색 용액의 마이크로드롭을 만들고 미네랄 오일로 덮습니다. 배아를 마이크로드롭에 넣고 일관된 방식으로, 가급적이면 ICM 캐비티 접근이 유리 표면과 평행하도록 배열한 다음 현미경 홀더에 접시를 설정합니다. 컨포칼 이미징을 수행하려면 형광단을 표백하지 않고 강력한 신호 대 잡음비를 제공하는 가장 낮은 레이저 출력을 사용하십시오.

게인과 오프 세트를 조정하여 샘플을 과도하게 노출하지 않고 가장 넓은 다이내믹 레인지를 얻을 수 있습니다. 그레이스케일 범위의 대부분 또는 전체를 캡처하면 이미지 간의 작은 강도 차이를 쉽게 감지할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 추가 세부 정보를 따라 전체 Z축에 걸쳐 배아를 이미지화합니다.

MATLAB 기반 분할 툴인 MINS(Modular Interactive Nuclear Segmentation)의 그래픽 사용자 인터페이스를 따라 컨포칼 이미지 또는 현미경으로 생성된 원시 데이터의 전체 Z 스택을 불러올 수 있습니다. 각 단계의 결과를 보려면 해당 보기"버튼을 클릭하십시오. 버튼 위의 노란색 태그는 진행 중인 작업을 나타냅니다.

녹색 태그는 작업이 완료되었음을 나타냅니다. 세분화를 진행하기 전에 감지 단계의 결과를 평가합니다. 만족스럽지 않으면 감지 매개변수를 수정하고 다시 실행하십시오.

배치 모드"실행 메뉴에서 파일 추가"를 클릭하고 처리할 모든 파일을 한 번에 로드합니다. 배치 모드 실행 시작을 클릭하십시오"소프트웨어가 파일을 처리할 시간을 허용합니다. 세분화 출력은 원본 파일과 동일한 디렉토리에 저장됩니다.

apoptotic vesicles 또는 온전한 핵은 아니지만 MINS에 의해 식별되었을 수 있는 기타 요소와 같은 거짓 긍정을 식별합니다. starstatistics에서 거짓 긍정에 해당하는 레코드를 삭제합니다. CSV 파일.

나중에 참조할 수 있도록 원본 starstatistics. csv 파일을 보존하고 복사본만 편집합니다. 핵이 과도하게 분절되어 두 개 이상의 핵으로 표시되는 경우, 강도 수준의 평균을 내어 기록을 병합하거나 해당 세포에 대한 기록 중 하나를 유지하고 나머지는 폐기합니다.

세분화 문제를 해결하려면 MINS가 두 개 이상의 핵 사이의 경계를 감지하지 못하고 단일 핵으로 분할한 이벤트 또는 핵을 완전히 감지하지 못한 이벤트를 식별합니다. ImageJ를 사용하여 언더 또는 세그먼트화되지 않은 셀의 각 채널에 대한 평균 그레이 레벨을 측정합니다. 다음으로, 자유형 선택 도구를 사용하여 DNA 채널에서 아래쪽 또는 분할되지 않은 핵의 내측 부분을 찾고 아래쪽 또는 분할되지 않은 핵의 둘레를 간략하게 설명합니다.

그런 다음 Control M"을 누르거나 분석" 메뉴로 이동하여 측정을 선택합니다."이렇게 하면 윤곽선 영역의 평균 회색 값이 기록되고 새 창에 표시됩니다. DNA 채널에서 방금 선택한 것과 동일한 윤곽선 영역을 사용하여 관심 있는 각 형광 채널의 측정을 반복합니다. 결과는 측정 결과 창에서 이전 결과로 뒤집힙니다.

그런 다음 얻은 측정값을 사용하여 starstatistics. csv 파일의 잘못된 레코드를 바꿉니다. 핵이 과소 분절된 경우 해당 행을 복제하고, 각각의 새 세포에 다른 세포 ID를 할당하고, ImageJ에서 얻은 값을 해당 열 아래에 도입합니다.

이 경우 두 셀은 공간 좌표를 공유합니다. 분석에서 유사분열 핵을 별도로 고려해야 하는 경우 수동으로 점수를 매기고 데이터 파일에 정보를 추가합니다. 추가 이미지 처리 지침은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오.

이 그림은 확장된 공동이 있는 여러 단계에서 온전한 배반포의 예를 보여줍니다. 다음은 CDX2, GATA4, GATA6, NANOG 및 OCT4를 포함한 여러 핵 단백질에 대한 우수한 항체의 예입니다. 이 샘플은 높은 신호 대 잡음비를 제공하는 세포질 단백질 DAB2로 표지되었습니다.

이 패널에서는 신호 대 잡음비가 낮은 GATA4에 대한 불량 염색의 예가 표시되며, 여기서 샘플은 10분 동안만 고정되었습니다. 이 특정 항-GATA4 항체는 강력한 신호를 제공하기 위해 하룻밤 동안 고정이 필요합니다. 이러한 배아는 NA 1.30 및 0.21mm working distance를 가진 40x 오일 이멀젼 대물렌즈로 이미지화되었으며, 중간 패널은 ICM 또는 개별 핵의 배율을 보여주며 이들 사이의 경계를 구별할 수 있습니다.

하단 패널은 배아가 더 발전할수록 핵 밀도가 높아지고 따라서 분할 오류의 가능성이 더 커지는 방법을 보여줍니다. 이러한 이미지는 MINS가 범할 수 있는 오류(예: apoptotic nuclei를 살아있는 세포로 감지, 과다 분할 또는 과소 분할)를 보여줍니다. 이 Z 슬라이스 시퀀스는 두 개의 세포가 하나로 식별된 과소 분할 이벤트를 나타냅니다.

일단 숙달되면 이 프로토콜은 처음부터 끝까지 3-4일 만에 수행할 수 있으며 하루에 2-4시간의 시간 부담이 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안 실험 조건, 즉 면역형광 프로토콜 및 이미징 매개변수와 매우 일관성을 유지하는 것이 중요합니다. 개발 후 이 기술은 마우스 발달 생물학 분야의 연구자들이 단일 세포에서 유전자 및 단백질 발현의 현장 정량 분석을 수행할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 정량적 in situ 발현 분석에 적합한 이미지 데이터를 획득하는 방법을 잘 이해할 수 있을 것입니다.