자기 마이크로 비드 폐색 모델 마우스의 녹내장 안구 고혈압 종속 유도합니다

이 수술 절차의 전반적인 목표는 쥐 눈의 전방에 자기 마이크로 비즈를 주입하여 안구 고혈압 의존성 녹내장을 유도하는 것입니다. 이 방법은 명백한 망막 신경절 세포가 죽기 전에 눈에서 어떤 초기 병리학적 변화가 발생하는지와 같은 녹내장 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 안압을 시술 중 눈의 손상을 최소화하는 곳까지 안정적으로 상승할 수 있다는 것입니다.

이 방법을 처음 접하는 사람들은 주사 중 각막에 구멍을 뚫고 부적절하게 준비된 마이크로 니들 또는 마이크로 니들의 잘못된 위치로 인해 렌즈와 같은 주변 구조를 손상시키는 데 어려움을 겪을 것입니다. 시작하려면 모세관 풀러를 사용하여 Bohr 규산염 유리 모세관에서 마이크로 니들을 당깁니다. 현미경으로 현미경으로 날카로운 날을 사용하여 마이크로 바늘 끝에 조심스럽게 구멍을 만들어 팁이 장축 및 단축 직경이 각각 약 190마이크로미터와 70마이크로미터인 타원형 모양이 되도록 합니다.

마이크로 피펫 베벨링 시스템에서 마이크로 바늘을 베벨링 플레이트에 대해 20도 각도로 배치하여 마이크로 바늘 개구부가 플레이트에 닿도록 합니다. 가장자리가 평평하고 매끄러워질 때까지 물방울을 사용하여 약 10분 동안 수세를 긋습니다. 그런 다음 바늘 끝이 날카로워질 때까지 바늘을 회전하여 구멍을 둘러싼 두 가장자리를 비스

그런 다음 에어로졸 먼지떨이를 사용하여 마이크로 바늘 끝 구멍에서 모든 이물질과 물을 청소합니다. 완성된 마이크로 바늘을 현미경으로 주의 깊게 검사합니다. 골절된 마이크로 바늘은 버리십시오.

다음 절차를 수행하려면 두 사람이 완료해야 합니다. 특정 사람이 특정 작업을 수행해야 하는 경우, 작업을 수행할 사람은 사람 1" 또는 사람 2"로 표시됩니다.텍스트 프로토콜에 따라 마그네틱 마이크로 비드 용액을 준비합니다. 깨어 있는 마우스에서 기준선 안압 또는 IOP를 측정하려면 귀 사이의 피부를 잡고 마우스를 부드럽게 제지합니다.

동물이 편안하고 눈이 접근할 수 있도록 벤치 상단에 마우스를 놓습니다. 프로파라카인 하이드로클로라이드 한 방울을 각막에 바르고, 안압계를 각막 표면에 수직으로 유지하고, 안압 평균을 얻기 위해 눈당 최소 3세트의 10회 연속 판독값을 취합니다. 다음으로, 텍스트 프로토콜에 따라 마우스를 마취한 후 부프레노르핀을 체중 1kg당 0.05mg을 피하로 투여합니다.

그런 다음 트로피카마이드 점안액으로 눈을 치료하여 동공 확장을 유도하여 주사 중 마이크로 바늘의 위치를 시각화하는 데 도움을 줍니다. 시술 중 각막이 건조해지는 것을 방지하기 위해 반대쪽 눈에 국소 연고를 바르십시오. 이제 멸균 마이크로 바늘을 마이크로 주사기 펌프의 주입 어셈블리에 부착합니다.

그런 다음 마취된 마우스를 작동 플랫폼으로 옮깁니다. 현미경으로 사람 1이 동공이 완전히 확장되고 안구 근육이 이완되어 안구 움직임이 없도록 하여 절차 중 안정성을 보장하도록 합니다. 흡수성 면봉을 사용하여 눈에서 트로피카마이드 점안액을 부드럽게 닦아냅니다.

사람 2가 위아래로 피펫팅하여 마그네틱 마이크로비드 용액을 혼합하도록 합니다. 그런 다음 마이크로 주사기 펌프를 사용하여 마이크로 바늘에 1.5마이크로리터의 균질화된 자성 마이크로 비드 용액을 로드합니다. 마이크로 바늘 끝에 기포가 없는지 확인하십시오.

가능한 한 빨리 바늘을 변연을 기준으로 앞쪽으로 45도 각도로 놓습니다. 사람 1이 플라스틱 집게를 사용하여 눈을 지지하도록 하고 마이크로 바늘과 플라스틱 집게 사이의 각도를 약 90도로 유지합니다. 마이크로 주사기 펌프를 사용하여 사람 2가 장전된 마이크로 바늘로 각막에 부드럽게 구멍을 뚫어 마이크로 바늘의 끝이 수정체, 홍채 및 후방을 피하면서 전방으로 들어가도록 합니다.

마우스 헤드를 움직이지 않고 사람 1이 바늘 끝 맞은편에 있는 눈 옆에 자석을 놓도록 합니다. 자기 마이크로비즈를 전방으로 끌어들이고 비드와 각막의 내부 표면과의 접촉을 최소화합니다. 사람 1이 자석을 계속 잡고 있는 상태에서 사람 2가 마이크로 주사기 펌프를 사용하여 15-30초 동안 1.5마이크로리터의 자기 비드 용액을 전방으로 주입하도록 합니다.

구슬의 전체 부피가 주입되면 눈에서 마이크로 바늘을 천천히 빼냅니다. 마이크로 구슬의 역류를 방지하기 위해 사람 1이 추가로 30-60초 동안 자석을 눈 옆에 계속 잡고 구슬을 전방으로 끌어당기게 합니다. 그런 다음 자석을 사용하여 구슬을 홍채각막 각도로 끌어당기면서 구슬이 달라붙을 수 있는 각막 내부 표면으로 구슬을 끌어당기는 것을 피합니다.

구슬이 전방의 둘레에 고르게 분포된 고리를 형성하는지 확인합니다. 그 후, 수술한 안구를 항생제 점안액으로 치료하여 감염 위험을 최소화합니다. 감염을 방지하기 위해 수술한 눈이 위를 향하게 하고 각막 내부 표면에 구슬이 축적되는 것을 방지하기 위해 완전히 깨어날 때까지 마우스가 열 패드에서 회복되도록 합니다.

최소 이틀의 회복 후 비디오의 앞부분에서 설명한 대로 IOP를 측정하고 일주일에 한 번 이상 모니터링하거나 필요에 따라 하루 중 같은 시간에 모니터링합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 결과를 분석합니다. 이 프로토콜에 설명된 성체 마우스의 전방(anterior chamber)에 자성 마이크로 비드를 주입하면 견고하고 재현 가능한 안압 상승

여기에서 볼 수 있듯이, 시술 일주일 후, 안압은 고혈압 눈에서 수은 수치 0.6mm를 더하거나 뺀 평균 기준치인 10에서 19, 수은 수치를 더하거나 뺀 0.5mm로 증가했습니다. 이 표는 그 후 안압이 안정화되었고 이 연구에서 조사된 가장 긴 기간인 최소 6주 동안 평균 20mm의 수은으로 상승된 상태를 유지했음을 보여줍니다. 수술 후 2주, 3주, 6주에 마이크로 비드를 주입한 눈의 평균 최대 안압은 25mm의 수은이었습니다.

망막 신경절 세포 또는 망막 신경절 세포 손실을 평가하기 위해, 고안구 고혈압 유발 후 1주, 2주, 3주 및 6주에 망막의 편평한 마운트에서 BRN-3A 양성 세포의 수를 정량화했습니다. 1주일 후에 유의미한 안압 상승이 감지되었지만, 첫 2주 이내에 망막 신경절 세포종의 유의미한 손실은 관찰되지 않았다. 그러나 수술 후 3주와 6주에서 유의한 세포 사멸이 관찰되었습니다.

이 그림에서 톨루이딘 블루 염색 시신경 단면은 온전한 시신경에 비해 3주 및 6주에 망막 신경절 축삭돌기의 상당한 손실을 보여주며, 이는 이 작업이 녹내장에서 관찰되는 축삭 소실을 초래한다는 것을 나타냅니다. 일단 마스터하면 15 분 안에 한 마리의 마우스를 주입 할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 동일한 수의 마이크로 비드가 전방으로 주입되도록 적절한 조치를 취하는 것이 중요합니다.

이렇게 하면 동물 간에 발생할 수 있는 변동을 줄일 수 있습니다. 동영상을 시청한 후에는 쥐 눈의 전방에 자기 마이크로 비즈를 주입하여 안구 고혈압을 유발하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.