상기 표현형의 특성을 : 정량이 중요한 이유 초파리 애벌레 신경 근육 학 분기점

이 방법론의 전반적인 목표는 해부학적 형질의 정량적 분석을 수행하는 방법을 보여주는 것입니다. 초파리 유충의 줄무늬 근육과 함께 핵의 형태, 크기 및 위치에 영향을 미치는 표현형의 정량화가 입증되었습니다. 세포 내 소기관의 형태, 크기 및 분포를 제어하는 분자 메커니즘을 이해하는 것은 현대 생물학의 가장 중요한 질문 중 하나입니다.

과거에는 실험 집단 간 및 실험 집단 내의 형태학적 변이가 질적 분석의 대상으로만 이루어졌습니다. 여기에서는 초파리 유전학과 형태 측정 정량 분석을 결합하여 근육 내 핵의 크기, 모양 및 분포를 제어하는 유전자를 식별하는 정량 분석을 제안합니다. 절차 시연을 돕는 것은 제 연구실의 대학원생인 Leire Ledahawski입니다.

텍스트 프로토콜에 따라 유충 신경근 접합부를 해부하고 염색한 후 집게를 사용하여 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에서 샘플을 제거하고 처리 슬라이드에 놓습니다. 미세 해부 가위를 사용하여 필레에서 머리와 꼬리를 자르고 내부 표면을 위로 유지하십시오. 이제 1cm 떨어진 깨끗한 슬라이드에 세 개의 셀룰로오스 테이프 스트립을 감아 장착 슬라이드를 준비합니다.

제공된 이 틈 위에 덮개 슬립을 올려 놓으면 샘플이 평평해지지 않습니다. 그런 다음 셀룰로오스 테이프 스트립 사이에 약 20마이크로리터의 장착 매체를 놓고 깨끗한 집게로 매체를 펴 놓습니다. 이제 준비에서 여분의 조직을 제거합니다.

처리 슬라이드에서 절개된 유충을 장착 슬라이드와 장착 매체로 드래그하여 내부 표면을 위로 유지합니다. 다음으로, 공기가 갇히지 않도록 주의하면서 커버 슬립을 부드럽게 적용합니다. 그런 다음 투명 네일 바니시로 슬라이드를 밀봉하고 이미징하기 전에 슬라이드를 최소 10분 동안 건조시킵니다.

이 분석을 위해 DeVAP 항체, 라민 항체 및 핵 마커로 염색된 유충 체벽 근육을 표시하는 컨포칼 이미지를 사용합니다. 그런 다음 컨포칼 Z 스택 이미지를 경기장으로 끌어다 놓습니다. 이미지를 두 번 클릭하면 도구 모음 아이콘으로 액세스할 수 있는 Surpass 보기에서 자동으로 열립니다.

Surpass 보기에는 세 개의 기본 작업 공간 패널이 있습니다. 보기 영역, 개체 목록 및 개체 속성 영역. 그런 다음 3D 보기 아이콘을 클릭하여 볼륨으로 렌더링된 3채널 이미지를 만듭니다.

그런 다음 개체 도구 모음에서 새 측정 점 추가를 선택하고 개체 속성 영역에서 생성 마법사를 따릅니다. 먼저 Edit 탭을 선택한 다음 Specific Channel에서 핵 마커 또는 lamin 채널을 선택하여 핵을 강조 표시합니다. 그런 다음 Esc 탭을 눌러 포인터를 선택 모드로 설정한 다음 마우스 휠로 3D 커서 상자의 크기를 조정하여 이미지에 주어진 핵을 포함합니다.

Shift 키를 누른 상태에서 동일한 핵을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 측정 점을 추가합니다. 그런 다음 동일한 기술을 사용하여 동일한 근육의 가까운 핵에 두 번째 점을 추가합니다. 두 점 사이에 선이 자동으로 그려지고 두 핵 사이의 거리가 통계 변수로 표시되고 기록됩니다.

주어진 핵을 둘러싼 모든 핵에 대해 절차를 반복합니다. 그런 다음 Statistics Detailed Distance Data 아래에 있는 수집된 모든 측정 지점에서 최단 거리를 선택합니다. Object Properties(개체 속성) 영역에서 Export Statistics with Tab Display to File(탭 디스플레이를 파일로 사용 가능한 경우) 옵션을 선택합니다.

이렇게 하면 데이터가 스프레드시트에 저장됩니다. 이 분석을 위해 라민과 핵 마커로 염색된 체벽 근육의 컨포칼 이미지를 사용하여 핵을 시각화합니다. 근핵의 모양을 평가하려면 핵 표면적을 동일한 부피를 가진 구의 표면적과 비교하는 구형도를 측정합니다.

또는 prolate, oblate 또는 ellipsoids 및 spheroid를 구별하는 타원도를 측정합니다. 앞에서 설명한 대로 이미지를 엽니다. 그런 다음 Objects 도구 모음 아이콘 Add New Surfaces를 클릭합니다.

Object Properties 영역에 나타나는 Creation Wizard에서 핵 마커 염색을 소스 채널로 선택하여 핵을 표시합니다. Absolute Intensity 옵션을 임계값으로 설정합니다. 대부분의 핵이 임계값 곡선의 값을 변경하여 매끄럽고 과부하되지 않은 렌더링을 보이는지 확인합니다.

동시에 핵의 구멍이나 불완전한 마스크가 있는 것을 피하십시오. 그런 다음 필터 도구를 사용하여 표면 렌더링에서 노이즈를 제거합니다. 새로 생성된 표면 레이어의 편집 탭에서 잘못 렌더링된 핵 표면을 분할합니다.

또 다른 옵션은 잘못 렌더링된 핵 표면을 병합하는 것입니다. 표면으로 렌더링된 핵의 ellipticity 및 sphericity 값은 Statistics 탭에서 사용할 수 있습니다. 분석을 위해 이 데이터를 내보냅니다.

이 프로토콜의 경우 핵 마커와 lamin 및 DeVAP에 특이적인 항체로 염색된 체벽 근육을 보고하는 컨포칼 이미지를 사용합니다. 메인 메뉴 항목인 Edit에서 관심 있는 이미지를 열고 Crop 3D를 엽니다. 이전 섹션에서 설명한 대로 lamin 채널을 사용하여 Surface Creation Wizard를 따릅니다.

표면이 생성되면 Objects Properties 영역에서 Edit를 클릭하고 Mask All을 선택하여 핵 내부의 신호를 분리합니다. 그런 다음 DeVAP 신호를 선택합니다. Select Channel 드롭다운 메뉴에서 Set Voxels Ouside the Surface 옵션을 클릭하고 해당 값을 0으로 만듭니다.

이렇게 하면 디스플레이 조정 창에서 사용할 수 있는 새 마스크 채널이 생성됩니다. 핵 내부의 신호 존재를 시각화하려면 Objects 도구 모음에서 Add New Clipping Plane 아이콘을 클릭하여 윤곽 평면을 만듭니다. 그런 다음, 클리핑 평면의 각도와 위치를 대화형 방식으로 조정하여 핵 내부의 신호 분포를 시각화합니다.

인간 VAMP 관련 단백질 B의 미스센스 돌연변이는 ALS 발병기전과 관련이 있습니다. 설명된 방법을 사용하여 ALS 유발 돌연변이 V2601을 보유한 파리 ortholog 유전자 DeVAP를 발현하는 줄무늬 근육을 대조군과 비교하여 유사한 수준의 야생형 DeVAP 또는 더 높은 수준의 야생형 DeVAP를 발현했습니다. 근섬유를 따라 핵의 분포를 평가하기 위해 최근접 이웃 분석이 사용되었습니다.

돌연변이된 DeVAP 전이유전자를 발현하는 대조군이나 야생형 단백질을 과도하게 발현하는 대조군과 비교했을 때, 관심 돌연변이는 핵 사이의 평균 최단 거리를 극적으로 감소시켰습니다. 다음으로, 핵의 구형도를 조사했습니다. 핵 간격을 감소시킨 전이유전자는 핵 부피도 확대하는 것으로 밝혀졌다.

핵의 3D 재구성 및 볼륨 렌더링은 관심 돌연변이를 표현하는 근육이 핵에 국한된 클러스터를 형성한다는 것을 보여주었습니다. 이 방법은 또한 미토콘드리아와 같은 다른 소기관과 관련된 형태학적 특징의 정량적 분석으로 확장될 수 있습니다. 핵 구조, 위치 및 크기의 변화는 노화 및 파킨슨병 및 ALS와 같은 여러 신경 퇴행성 질환과 관련이 있습니다.

실어증의 기저에 있는 분자 메커니즘을 이해하면 효과적인 치료 개입을 위한 새로운 약리학적 표적을 식별할 수 있습니다.