높은 처리량 및 다중 파라 메트릭 정량화를위한 ​​두 알고리즘 초파리 신경 근육 접합 형태학

이 절차의 전반적인 목표는 형태 측정 소프트웨어 매크로를 사용하여 Drosophila neuromuscular junction의 형태학적 특징을 자동으로 정량화하는 것입니다. 이 방법은 신경생물학의 핵심 질문인 시냅스 발달의 조절자를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 여러 NMJ 기능을 자동으로 정량화할 수 있다는 것입니다.

이를 통해 높은 처리량에서 NMJ 형태를 객관적으로 분석할 수 있습니다. 우리는 많은 양의 질병 모델에서 NMJ 형태학을 조사할 수 있도록 이 방법론을 개발하기로 결정했습니다. 우리는 개인적인 차이를 방지하는 방법과 정량화 과정을 크게 가속화하는 방법을 생각했습니다.

이 방법을 시각적으로 시연하면 매우 유용합니다. 적절한 매크로 설정이 중요하며, 특히 VT 소프트웨어에 익숙하지 않은 경우 신규 사용자에게 일부 단계가 어려울 수 있습니다. 이 프로토콜의 경우 NMJ의 이미지 스택을 생성하고 개별 TIFF 파일로 저장하며, 여기서 채널 1은 DLG1 염색 또는 유사한 마커를 표시하고 채널 2는 BRP 염색을 표시합니다.

시작하려면 NMJ 이미지 파일의 C 프로젝션 및 하이퍼 스택을 만듭니다. 플러그인 옵션을 열고 Drosophila NMJ Morphometrics를 선택합니다. 이제 현미경이 이미지 시리즈를 TIFF로 저장할 때 이미지 시리즈에 할당한 고유한 파일 문자열을 식별합니다.

이것은 이미지 이름의 끝에 있습니다. 가장 낮은 평면 및 채널 번호에 지정된 문자열을 복사하여 고유한 파일 문자열 설정 창에 붙여넣습니다. 그런 다음 sub 매크로 스택으로 변환을 선택하고 이미지가 있는 디렉토리 또는 폴더를 선택합니다.

각 이미지 파일에 대해 기본 이름인 stack과 flat stack, 그리고 원래 이미지 이름으로 두 개의 새 파일이 만들어집니다. 그런 다음 저장 공간을 절약하기 위해 원본 파일을 삭제할 수 있습니다. 다음으로, Drosophila NMJ Morphometrics 인터페이스에서 define ROI 하위 매크로를 선택하고 이미지 파일 디렉토리를 선택합니다.

첫 번째 투영이 열리면 자유형 선택 도구를 선택합니다. 그런 다음 마우스를 사용하여 관심 있는 완전한 NMJ 말단을 포함하는 영역을 정의합니다. 선택한 후 define terminal(터미널 정의) 창에서 OK(확인)를 클릭합니다.

NMJ 터미널이 모든 프로젝션에서 정의될 때까지 이 작업을 계속합니다. 매크로는 프로세스를 자동으로 진행합니다. 각 이미지 파일에 대해 기본 이름 ROI와 원래 이미지 이름으로 구성된 하나의 새 파일이 만들어집니다.

NMJ 기능을 정량화하려면 먼저 Drosophila NMJ Morphometrics 인터페이스로 이동하여 스케일을 설정합니다. 예를 들어 이미지의 한 픽셀이 0.72미크론에 해당하는 경우 배율 픽셀을 1로 설정하고 배율 거리를 0.072로 설정합니다. 그런 다음 하위 매크로 분석을 선택하고 두 개의 채널 이미지가 있는 경우 가중치도 토글합니다.

OK(확인)를 누르고 메시지가 표시되면 이미지 파일 디렉토리를 선택합니다. 처리 시간은 시냅스당 몇 분이 될 수 있습니다. 분석 후 분석된 각 시냅스에 대한 새 이미지 파일은 상위 폴더에 저장되고 정량적 측정이 결과입니다.

txt 파일. 모든 이미지를 검사하고 분할 오류가 있는 그림을 제외합니다. 예를 들어, 시냅스 말단의 일부는 노란색 윤곽선에 포함되지 않을 수 있습니다.

배경의 일부는 시냅스 말단에 포함될 수 있습니다. 파란색 골격선은 시냅스 말단 너머로 확장될 수 있습니다. 활성 영역이 너무 많거나 일부 활성 영역이 감지되지 않은 상태로 남아 있을 수 있습니다.

이미지의 5% 이상이 분할 오류가 있는 경우 다른 분석 알고리즘을 탐색하여 이미지 처리를 개선합니다. 다음 비디오 섹션에서는 이러한 매크로 분석 설정을 정의하는 방법에 대해 설명합니다. 매크로의 롤링 볼 반경 값을 조정하려면 이미지 데이터 세트를 나타내는 세 개의 NMJ Z 투영을 선택합니다.

결과 res 이미지 이름과 sub 매크로 analyze에서 이전에 생성한 두 개의 활성 영역 스택 이미지 이름을 삭제합니다. 선택한 각 이미지에 대한 스택 이미지 이름 파일을 연 다음 도구 모음에서 분할 채널을 선택하여 채널 1의 이미지와 채널 2의 이미지를 만들고 이러한 파일을 저장합니다. 채널 1에 속하는 이미지를 엽니다. 이 경우 DLG one immuno 라벨링에 해당합니다.

이제 프로세스 탭 아래에 있는 필터 빼기 배경을 실행합니다.롤링 볼 반경을 시냅스와 배경 사이의 대비를 증가시키는 값으로 설정합니다. 투영 유형을 최대 강도로 사용하여 Z 투영을 만들고 이미지를 저장합니다.

그런 다음 모든 Z 투영에서 새 롤링 볼 반경으로 빼기 배경 알고리즘을 실행하고 결과를 저장합니다. 매크로에 가장 적합한 자동 임계값을 결정하려면 저장된 C 프로젝션을 열고 모두 시도 옵션을 사용하여 자동 임계값을 실행합니다. 결과 이미지에서 이미지에 가장 적합한 알고리즘을 찾고 추가 이미지에 대해 매크로를 실행할 때 해당 임계값 설정을 사용하여 진행합니다.

다양한 자동 임계값을 정의하는 것은 매크로에 의한 적절한 이미지 분할에 중요합니다. 이러한 이유로 8개의 사이니지 매개변수를 적절하게 정량화하려면 소프트웨어에서 제공하는 16개의 자동 임계값 옵션을 숙지하는 것이 중요합니다. 더하기 버튼을 눌러 자동 임계값의 결과 이미지를 확대합니다.

알고리즘 이름은 각 결과 이미지 아래에 있습니다. 이 예에서 NMJ 개요 임계값 설정에 가장 적합한 자동 임계값 알고리즘은 Huang입니다. 스켈레톤 임계값의 경우 가장 좋은 설정은 Li이고 활성 영역 임계값에 가장 적합한 설정은 Huang입니다.

매크로에 대한 미세한 최대 노이즈 허용 오차 값을 정의하려면 원래 대표 NMJ 이미지로 돌아갑니다. BRP 채널을 엽니다. 팝업 메뉴의 플러그인 탭으로 이동하여 최대 3D를 선택합니다.

잠시 후 새 이미지가 나타나고 원본 이미지를 닫습니다. 그런 다음 최소 3D 명령을 사용합니다. 그런 다음 최대 C2 스택 시냅스 하나의 이미지를 닫고 새로 생성된 이미지의 최소 최대 C2 스택 시냅스 1을 선택합니다.

이제 find maxima 명령을 사용합니다. 새 창에서 미리보기 포인트 선택을 선택하고 노이즈 허용 오차를 50으로 설정합니다. 그런 다음 최대 포인트는 시냅스 활성 영역만 포함해야 하는 작은 십자가로 표시됩니다.

크로스가 너무 많으면 노이즈 허용 오차 값을 높입니다. 일부 활성 영역에 주석이 추가되지 않으면 노이즈 허용 오차 값이 감소합니다. 매크로의 find maxima noise tolerance 필드에 대해 파생된 임계값을 사용합니다.

최대 노이즈 허용 오차 값을 선택하려면 활성 영역의 수를 적절하게 정량화하는 것이 중요합니다. 적절한 값을 정의하기 위해 다른 값을 시도해야 하는 경우가 있습니다. 이제 매크로 인터페이스의 임계값 알고리즘에서 파생된 모든 값을 조정하고 원래 매크로 설정을 정의하는 데 사용된 대표 이미지에 대해 하위 매크로 분석을 실행합니다.

흰색 점으로 표시된 활성 영역이 있는 새 파일이 생성됩니다. 이 파일을 도구 모음으로 끌어다 놓고 프로젝션 유형을 일부 슬라이스로 사용하여 Z 프로젝트를 선택하여 엽니다. 따라서 프로젝션 파일이 만들어집니다.

다음 단계는 임계값을 조정하는 것입니다. 새 임계값 창에서 위쪽 막대를 밀어 원하는 모든 초점을 읽을 수 있는 임계값을 선택합니다. 이것은 BRP 긍정적 인 지점입니다.

이 값을 BRP 푼크 하한 임계값으로 사용합니다. 이제 이전에 정의된 값, 알고리즘을 사용하여 원래 대표 NMJ 이미지에 대한 분석을 다시 실행한 다음 새 BRP puncta lower threshold 값을 사용합니다. 결과 이미지는 비판적 분석 기준을 충족해야 합니다.

이제 정의 설정을 사용하여 동일한 조건에서 얻은 모든 NMJ 이미지에 대해 매크로를 실행합니다. Drosophila NMJ 형태 측정 매크로는 세 가지 돌연변이 유전자형에서 서로 다른 알려진 시냅스 결함을 검증하는 데 사용되었습니다. 안키린 두 돌연변이는 부톤과 더 작은 NMJ를 융합한 것으로 알려져 있습니다.

매크로를 사용하여 panuronil 및 quirin two RNAI knock down NMJ의 면적과 둘레를 측정한 결과 대조군보다 훨씬 작은 것으로 나타났습니다. GTPase Rab3는 적절한 bruckpila 배포를 위해 필요합니다. 중단되면 활성 영역이 줄어듭니다.

매크로 panuronil Rab 3 knock down flys를 사용하면 NMJ 터미널당 평균 138개의 활성 영역이 있는 반면 대조군에서는 290개가 감지되었습니다. 높은 와이어는 NMJ 성장의 중요한 조절자이며 돌연변이가 발생하면 NMJ는 말단에서 분기를 확장했습니다. 매크로 panuronil high wire RNAI knock down lines를 사용하여 NMJ에서 총 길이, 가장 긴 분기 길이, 분기 수 및 분기점 수를 포함하여 여러 골격 파생 매개변수가 크게 증가한 것으로 나타났습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 Drosophila NMJ 형태 측정 매크로의 설정을 작동하고 조정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 일단 숙달되면 50개의 시냅스 분석을 1시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이를 통해 시냅스당 약 15분의 정량화 시간을 절약할

NMJ의 좋은 품질의 이미지를 획득하는 것이 중요합니다. 이미지가 좋을수록 매크로가 더 잘 수행됩니다. 이 기술은 신경생물학 분야의 연구자들이 초파리 NMJ의 형태학적 매개변수를 효율적으로 정량화하는 데 도움이 될 것입니다.