Name: 높은 처리량 및 다중 파라 메트릭 정량화를위한 두 알고리즘 초파리 신경 근육 접합 형태학 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: 배우세요 Drosophila NMJ Morphometrics 알고리즘을 사용하여 초파리 신경근육접합 형태를 자동 정량화하는 방법을 익히세요. 이 기술은 고처리량 분석을 통해 시냅스 발달 조절인자를 효율적으로 식별하는 데 활용됩니다.

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우리는 초파리 균주를 제공하기 위해 비엔나 초파리 리소스 센터 및 블루밍턴 초파리 재고 센터 (NIH P40OD018537)을 인정합니다. 우리는 영상 전문가 지원을 위해 대한 현미경 이미징 센터에서 잭 프랜슨합니다. 이 연구는 독일의 정신 지체 네트워크에 의해, 두 DCN / Radboud 대학 의료 센터의 박사 장학금으로, VIDI 및 과학 연구에 대한 네덜란드기구 (NWO)에서 TOP 보조금 (917-96-346, 912-12-109)에 의해 지원되었다 교육 및 연구 (BMBF)의 독일 연방 정부의 NGFN + 프로그램 및 AS에 대한 유럽 연합의 FP7 대규모 통합 네트워크 Gencodys (건강-241995)에 의해 투자. 자금 제공자는 연구 설계, 자료 수집 및 분석, 게시하는 결정, 또는 원고의 준비를 전혀 역할을 없었다.

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&quot;초파리 NMJ Morphometrics&quot;와 &quot;초파리 NMJ 부통 Morphometrics은&quot;시냅스 형태의 평가에 관심이 연구자를위한 강력한 도구입니다. NMJ 매개 변수의 수동 평가는 힘든 것입니다; 이 매크로는 15 분에 숙련 된 연구원을 절약 할 것으로 추정된다 / NMJ 수동 영상 분할에 보냈다. 조건 또는 유전자형에 따라 평가 시냅스 1 ~ 2 수십, 이것은 신속하게 아주 작은 규모의 연구에서, 저장 시간의 상당한 양을 요약한다. 대형 화면을 수행 할 때, 수동 평가 및 정량화에 비해 높은 처리량 분석을 사용할 때의 이득은 엄청난 수있다. 증가 된 처리량에 더하여, 매크로 용이 객관적인 분석을 제공한다; 그들은 그렇지 않으면 눈을 멀게 실험뿐만 아니라 여러 연구자가 분석에 관여 할 때 발생하는 대인 관계의 차이를 필요로 개인 편견을 제외 할 수 있습니다. 마지막으로, 매크로는 민감하고 정확한을 제공극적인 NMJ 결함보다는 미묘한 원인이 지금까지 연구자의 눈에 의해 진가를 인정받지 못한 남아있는 시냅스 규제의 식별을 허용 NMJ 기능 alysis. 검증 절차 및 매크로에 사용되는 알고리즘에 대한 자세한 정보는 게시 Nijhof 등의 알에서 발견된다. (17). 매크로의 기능을 적절하게 근육이어서 4에 초파리 melanogaster의 NMJs의 형태 적 특징을 측정하기 위해 확인 된, 상기 매크로이 유기체의 다른 근육에 시냅스를 분석하기에 적합 있다고 입증되었다. 이 매크로는 다른 초파리 종과 더 곤충을 포함한 다른 종의 유사한 구조와 NMJ의 형태 학적 매개 변수를 측정 할 수있는 가능성이 높습니다. 진화에 매우 먼 심지어 NMJs는, 예를 들면, 마우스의 NMJs는 매우 유사한 구조 형태를 보여 (29). 매크로는 다른 종에서 NMJ 준비에 테스트하지 않은 있지만, 잠재적 인 사용자는 이러한 목적으로 매크로를 테스트하는 것이 좋습니다. 사용자가 / 정의 이미지에 가장 적합한 매크로 설정을 선택할 수있는 다양한 자동 임계 값 및 알고리즘을 탐구하는 것이 매우 중요합니다. 매크로 평가는 수동 평가 비교할 때 이러한 설정으로, 약 95 %의 정확도가 얻어진다. 매크로 설정을 조정하면 제대로 세그먼트는 이미지의 100 %가 매우 힘든 또는 불가능 절차가 될 수 있습니다. 그들의 수는 5 % 이하 경우에 따라서 적절하게 분할되지 이미지를 배제하는 것이 좋습니다. 이미지의 품질이 낮 으면 분명히, 매크로는 만족스럽지 못한 영상 분할의 높은 비율을 생성합니다. 낮은 품질의 이미지는 유사하게 수동 평가에 영향을 미칠 것이다, 따라서 매크로의 성능에 링크 할 수 없습니다. 그들은 이미지 설계된대로 그럼에도 불구하고 매크로 오히려 견고높은 함량 현미경 (17) (샘플의 다수의 이미지를 허용하는 자동 형광 현미경) s의 생성. 중요한 점은 사용자가 시각적으로 매크로에 의해 생성 된 모든 결과의 이미지를 검사한다는 것이다. 이것은 감지하고 만족스럽지 분할로 사진을 제외 할 수 있습니다. 이 프로토콜 (6)에서, 사용자는 &quot;분석&quot;서브 매크로 실행시 정확한 이미지 분할의 설정을 조정하는 방법에 대해 안내된다. 빠르게 매크로의 요구 사항 및 방법 매크로 설정 &quot;매크로 설정을 Examples_adjusting&quot;라는 폴더를 조정하는 방법에 익숙해 매크로 저장소 https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a에 포함되어 있습니다. 예제 (고 함량 / 촛점 / 형광 현미경) 다른 현미경 플랫폼에서 얻어진 화상과 다른 immunostainings 열세 하위 각각이 제공된다. PDF 파일 권리 &quot;예 가이드는&quot;동일한에 포함되어 있습니다각 예제에 필요한 설정이 예상 결과와 결과 이미지를 제공하는 텍스트 문서와 함께 제공되는 폴더. 매크로는 티파니 파일을 분리로 저장된 이미지를 처리하도록 설계되었습니다, 그럼에도 불구하고 일부 사용자는 다른 형식으로 자신의 이미지를 저장 한 수 있습니다. 상세한 지침 문서 &quot;예 안내서&quot;어떻게 매크로로 이미지를 가져 - 다음 웹 사이트 https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a (21)는 세 개의 예제 파일 (3 예 1) &quot;초파리 NMJ&quot;라는 이름의 폴더가 티파니 분리 된 파일로 저장되지 않은 경우도 같은 폴더에서 찾을 수 있습니다. NMJ 지역, NMJ 주변, 튼스의 수, NMJ의 부통 지역, NMJ 길이, NMJ 긴 지점의 길이, 이슬라 번호 : 함께 &quot;초파리 NMJ Morphometrics&quot;와 &quot;초파리 NMJ 부통 Morphometrics&quot;매크로는 10 개 개의 다른 NMJ 기능을 정량화NDS, 지점의 수, 분기점의 수 및 활성 영역의 수. 이것은 단지 하나 또는 몇 시냅스 기능 (30), (31)을 평가할 수 있습니다 지금까지 사용 가능한 도구를 통해 큰 장점을 제공한다. Multiparametric 정량 분석은 시냅스 생물학의 여러 측면까지를 제어하는 새로운 규제를 식별하기 위해 새로운 발견, 예를 들어,에 대한 큰 잠재력을 맺는다. 또한 동일 또는 중복 NMJ 기능을 coregulate 따라서 일반적인 분자 경로에서 작동 할 가능성이 유전자를 결정하는 데 필요한 해상도를 제공합니다. 마지막으로, 유전자 시냅스 파라미터는 조정 된 형태 학적 상관 관계를 확인 교란 조건 (17)으로 서로 상호 얼마나 다른지 조사 할 수있는 가능성을 연다. 함께 찍은,이 프로토콜은 &quot;초파리 NMJ Morphometrics&quot;두 매크로를 사용하는 방법을 보여줍니다 및고 처리량 방법으로 열 개 형태 NMJ 기능 대물 민감한 정량화를 수행 &quot;초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics&quot;.

이러한 지적 장애, 자폐증 스펙트럼 장애와 같은인지 장애, 정신 분열증은 종종 비정상적인 시냅스 기능 1, 2, 3을 특징으로한다. 시냅스의 형태와 기능은 밀접하게 얽혀있다; 형태 적 결함이 시냅스 오작동을 일으킬 수 있고, 역으로, 비정상적인 시냅스 전달은 시냅스 성숙 및 형태 4, 5, 6에 영향을 미칠 것이다. 모델 생물의 수는 더 나은 시냅스 생물학을 이해하고 시냅스 변화가 건강과 질병 7, 8, 9의 뇌 기능에 미치는 영향을 밝혀하기 위해 사용되어왔다. 초파리 NMJ은 광범위하게 연구하고 글루타메이트 SY에 대한 생체 내 모델에서 잘 확립napse 생물학 10, 11. 지난 수십 년 동안,이 모델은 NMJs 사이의 형태 학적 차이를 감지 할 목적으로,뿐만 아니라 대규모 유전 화면에 대한 생리 학적 유전자에 초점을 맞춘 연구에 사용되어왔다. 특히, 순방향 유전자 스크린 시냅스 개발 기초 많은 중요한 레귤레이터 및 메커니즘을 식별하여 12, 13, 14, 15, 16를 작동 하였다. 그러나, 이러한 화면의 대부분 NMJ 단말기 형태의 시각적 평가 및 정성 시냅스 이상 검출 또는 몇몇 형태 적 특징의 반 정량적 점수에 의존. 결과적으로, 인간의 눈에 비 명백하다 오히려 미묘한 시냅스 형태 학적 이상이 간과하기 쉬운. 위해서하는 것은 포괄적으로 양적 차이는 감지 할 수 있어야합니다NMJ 정확하게 관심의 형태 학적 매개 변수의 체계적인 정량화에 의해 평가되어야한다. 수동으로 NMJ 기능을 측정하는 것은 여러 NMJ 관심의 기능 및 / 또는 대규모 유전 검사를 수행 할 때이있다, 특히 힘든입니다. multiparametric 높은 처리량 형태소 해석을 지원하기 위해 객관적 정량을 달성하기 위해, 두 매크로 &quot;초파리 NMJ Morphometrics&quot;및 &quot;초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics는&quot;17 개발되었다. 두 매크로는 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어 피지 (18)에서 실행, 모두 공 초점 및 nonconfocal 이미지를 정량화 할 수 있습니다. &quot;초파리 NMJ Morphometrics&quot;방안은 큰 1 시냅스 마커 디스크 (굴림-1) 또는 연접 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)로 면역 염색 NMJ 단자는 활성 영역 마커 bruchpilot (BRP)와 CO는 표지. 그것은 구 형태 parame을 정량화TERS (이하에서 설명) NMJ 영역 NMJ 경계, 튼스 수, NMJ 길이 NMJ 긴 분기 길이, 섬의 수, 지점의 수, 분기점 및 시냅스 말단 활성 영역 번호의 수 (도 1) . 튼스의 수를 결정하는 알고리즘이 매크로에 존재하지만, 정확성 (17)에 대한 기준을 충족하지 않았다. 적절 튼스의 수를 평가하기 위해, 특별히 반대 Synaptotagmin (SYT를) 또는 항 시스테인 문자열 단백질 (CSP)으로 면역 염색 NMJ 제제를 사용 튼스 정량화하도록 설계된 &quot;초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics&quot;매크로를 사용할 필요가있다, 및 BRP와 공동 immunolabeled. 은 &quot;초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics&quot;매크로는 다음과 같은 매개 변수를 정량화 : 활성 ZO의 튼스의 수, NMJ의 부통 지역, NMJ 길이, NMJ 긴 지점의 길이, 섬의 수, 지점 수, 분기 지점의 수와 수를NES (도 2). 매크로 3 서브 매크로 구성 : (I)는 &quot;스택 변환&quot;모든 가능한 이미지 파일을 식별하고, Z-hyperstacks 두 채널의 최대 강도 예측을 생성한다. 출력으로,이 매크로는 &quot;stack_image_name&quot;와 &quot;flatstack_image_name&quot;라고 시냅스 당 두 개의 새로운 파일을 생성합니다. II) &quot;ROI 정의&quot;를 연속하여 모두 최대 투영 화상 &quot;flatstack_image_name을&quot;수동으로 열어 관심의 특정 시냅스 단말이 존재하는 관심 (ROI)의 영역을 정의하는 요청들을 제공한다. 이것은 이미지 (11)에 존재할 수있는 인접한 근육 및 / 또는 (예를 들면 1 초 등) 시냅스 말단 다른 유형의 시냅스 연결의 배제를 허용하도록 구현 하였다. (III) &quot;분석&quot;완전히 ROI의 경계 내에서 이미지의 모든 지역에 분석을 자동으로 적용합니다. 같이모든 측정 수치가 주석 될 &quot;RESULTS.TXT&quot;및 매크로에 의해 생성 된 원본 영상 분할이 설명 될 것이다 &quot;res_image_name.tif&quot;이 단계의 결과, 사용자는 두 개의 새로운 파일을 구하는 것이다. NMJ 윤곽은 NMJ 골격과 BRP-양극 활성 영역의 수 : 화상 분석 중에 세 구조는 각각의 시냅스 말단으로부터 유도된다. NMJ 개요는 NMJ 영역과 경계를 결정하기 위해 사용되며, 후속 유역 분리 튼스의 수를 제공한다. 골격에서 다섯 개 NMJ 기능이 도출된다 : 총 NMJ 길이, 두 끝점을 연결하는 가장 긴 연속 경로의 길이의 합 (긴 가지 길이), NMJ 당 연결되지 않은 구획의 수를 ( &quot;섬&quot;이라 ), 브랜치 수 및 분기점 (하나 개의 분기점이 세 개 이상의 분기 접속)의 수. 활성 영역의 수를 카운트하여 BRP 채널의 판단BRP 양성 명소. (주석 NMJ 윤곽 (황색 선)은 NMJ 골격 (청색 라인) 및 (백색 병소로 표시) BRP-양극 활성 영역의 개수는 결과 영상에 표시되는 상기 파라미터의 측정은로 처리된다. TXT) 출력 파일 (도 3). 초파리 NMJ Morphometrics &quot;및&quot;초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics 초파리 NMJ Morphometrics &quot;및&quot;초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics &quot;&quot;제 설명 광범위 Nijhof 외. (17)에 의해 확인되었다.이 논문은 매크로를 사용 NMJ 형태를 분석하는 방법에 초점을 맞추고있다. &quot; 그럼에도 불구하고, 매크로를 이용한 분석에 앞서, NMJ 해부 및 immunostainings은 이러한 중요한 단계이다. 수행해야하고, 면역 조직 화학에 사용되는 마커의 조합은 매크로 분석에 적합 할 필요가있다. 이러한 단계를 간략하게 언급되어있는 SE이 프로토콜 ction 1, 이러한 절차를 실행하도록 상세히 설명 프로토콜을 참조로 사용자를 안내.

<table><tbody><tr><td>Immunostaining</td><td></td><td></td><td>Dilution</td></tr><tr><td>Mouse anti-discs large 1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>AFFN-DLG1-4D6</td><td>1/25 (zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit를 사용하여 결합)</td></tr><tr><td>Rabbit anti-horseradish peroxidase</td><td>Jackson</td><td>IR 323-005-021</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Synaptotagmin</td><td>Hugo Bellen</td><td></td>의 선물 <td>Jan-00</td></tr><tr><td>Mouse anti-Cysteine string protein</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>DCSP-1(ab49)</td><td>1/10 (zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit을 사용하여 결합)&nbsp;</td></tr><tr><td>마우스 안티 브루흐파일럿</td><td>발달 연구 Hybridoma Bank</td><td>nc82</td><td>Jan-50</td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 Alexa Fluor 488</td><td>Life technologies</td><td>A11029</td><td>1/200</td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 Alexa Fluor 568</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>A11011</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Zenon Alexa Fluor 568 마우스 IgG1 라벨링 키트</td><td>ThermoFisher</td><td>Z25006</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>ThermoFisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Material</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope or fluorescence microscope</td><td>Leica SP5</td> Zeiss Axio imager Leica SP5 <td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio imager</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>컴퓨터</td><td>Mac 또는 PC</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Material</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

높은 처리량 및 다중 파라 메트릭 정량화를위한 ​​두 알고리즘<em&gt; 초파리</em&gt; 신경 근육 접합 형태학

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

시냅틱 형태는 시냅스 효능에 밀접하게 관련되어, 많은 경우에 형태 학적 시냅스 결함은 궁극적으로 시냅스 오작동을 초래할. 초파리 애벌레 신경 근육 접합부 (NMJ), 글루타메이트 시냅스에 대한 잘 확립 된 모델은 광범위하게 수십 년 동안 연구되어왔다. NMJ 형태 학적 결함을 일으키는 돌연변이의 식별 시냅스 개발 및 기능을 조절하는 유전자의 레퍼토리를 한 것으로 밝혀졌습니다. 이들의 대부분은 초파리 NMJ의 형태 학적 이상을 감지하는 질적 접근 방식에 초점을 맞춘 대규모 연구에서 확인되었다. 질적 분석의 단점은 NMJ 형태에 기여 미묘한 플레이어 가능성이 주목 남아 있다는 것입니다. 정량 분석은 형태 학적 미묘한 차이를 검출하는 데 필요한 반면, 수고가 있기 때문에, 이러한 분석은 일반적으로 아직 수행되지 않는다. 이 프로토콜은 두 상세 이미지 분석 알고리즘의 설명 &quot;초파리 </em초파리 NMJ의 정량적 정확하고 객관적인 형태 학적 분석을 위해 피지 대응 매크로로서 사용할&gt; NMJ Morphometrics &quot;및&quot;초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics &quot;이.이 방법은 일반적으로 사용되는 마커 immunolabeled NMJ 단자를 분석하기 위해 개발 굴림-1 . BRP는 또한, 같은 HRP CSP의 및 SYT를 다른 마커의 폭 넓은 응용 프로그램이 프로토콜에 표시되는 매크로는 구 개 형태 NMJ 기능을 평가할 수 있습니다. NMJ 지역, NMJ 주변, 튼스의 수, NMJ 길이를 NMJ 긴 지점 길이, 섬의 수, 지점의 수 및 분기점 NMJ 단말의 활성 영역의 수의 수.

두 이미지 분석 알고리즘, &quot;초파리 NMJ Morphometrics&quot;및 &quot;초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics&quot;가 자동 초파리 신경근 접합부 (NMJ)의 구 개 형태 적 특징을 정량화하기 위해 만들어졌다.

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

이 절차의 전반적인 목표는 형태 측정 소프트웨어 매크로를 사용하여 Drosophila neuromuscular junction의 형태학적 특징을 자동으로 정량화하는 것입니다. 이 방법은 신경생물학의 핵심 질문인 시냅스 발달의 조절자를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 여러 NMJ 기능을 자동으로 정량화할 수 있다는 것입니다.이를 통해 높은 처리량에서 NMJ 형태를 객관적으로 분석할 수 있습니다. 우리는 많은 양의 질병 모델에서 NMJ 형태학을 조사할 수 있도록 이 방법론을 개발하기로 결정했습니다. 우리는 개인적인 차이를 방지하는 방법과 정량화 과정을 크게 가속화하는 방법을 생각했습니다.이 방법을 시각적으로 시연하면 매우 유용합니다. 적절한 매크로 설정이 중요하며, 특히 VT 소프트웨어에 익숙하지 않은 경우 신규 사용자에게 일부 단계가 어려울 수 있습니다. 이 프로토콜의 경우 NMJ의 이미지 스택을 생성하고 개별 TIFF 파일로 저장하며, 여기서 채널 1은 DLG1 염색 또는 유사한 마커를 표시하고 채널 2는 BRP 염색을 표시합니다.시작하려면 NMJ 이미지 파일의 C 프로젝션 및 하이퍼 스택을 만듭니다. 플러그인 옵션을 열고 Drosophila NMJ Morphometrics를 선택합니다. 이제 현미경이 이미지 시리즈를 TIFF로 저장할 때 이미지 시리즈에 할당한 고유한 파일 문자열을 식별합니다.이것은 이미지 이름의 끝에 있습니다. 가장 낮은 평면 및 채널 번호에 지정된 문자열을 복사하여 고유한 파일 문자열 설정 창에 붙여넣습니다. 그런 다음 sub 매크로 스택으로 변환을 선택하고 이미지가 있는 디렉토리 또는 폴더를 선택합니다.각 이미지 파일에 대해 기본 이름인 stack과 flat stack, 그리고 원래 이미지 이름으로 두 개의 새 파일이 만들어집니다. 그런 다음 저장 공간을 절약하기 위해 원본 파일을 삭제할 수 있습니다. 다음으로, Drosophila NMJ Morphometrics 인터페이스에서 define ROI 하위 매크로를 선택하고 이미지 파일 디렉토리를 선택합니다.첫 번째 투영이 열리면 자유형 선택 도구를 선택합니다. 그런 다음 마우스를 사용하여 관심 있는 완전한 NMJ 말단을 포함하는 영역을 정의합니다. 선택한 후 define terminal(터미널 정의) 창에서 OK(확인)를 클릭합니다.NMJ 터미널이 모든 프로젝션에서 정의될 때까지 이 작업을 계속합니다. 매크로는 프로세스를 자동으로 진행합니다. 각 이미지 파일에 대해 기본 이름 ROI와 원래 이미지 이름으로 구성된 하나의 새 파일이 만들어집니다.NMJ 기능을 정량화하려면 먼저 Drosophila NMJ Morphometrics 인터페이스로 이동하여 스케일을 설정합니다. 예를 들어 이미지의 한 픽셀이 0.72미크론에 해당하는 경우 배율 픽셀을 1로 설정하고 배율 거리를 0.072로 설정합니다. 그런 다음 하위 매크로 분석을 선택하고 두 개의 채널 이미지가 있는 경우 가중치도 토글합니다.OK(확인)를 누르고 메시지가 표시되면 이미지 파일 디렉토리를 선택합니다. 처리 시간은 시냅스당 몇 분이 될 수 있습니다. 분석 후 분석된 각 시냅스에 대한 새 이미지 파일은 상위 폴더에 저장되고 정량적 측정이 결과입니다.txt 파일. 모든 이미지를 검사하고 분할 오류가 있는 그림을 제외합니다. 예를 들어, 시냅스 말단의 일부는 노란색 윤곽선에 포함되지 않을 수 있습니다.배경의 일부는 시냅스 말단에 포함될 수 있습니다. 파란색 골격선은 시냅스 말단 너머로 확장될 수 있습니다. 활성 영역이 너무 많거나 일부 활성 영역이 감지되지 않은 상태로 남아 있을 수 있습니다.이미지의 5% 이상이 분할 오류가 있는 경우 다른 분석 알고리즘을 탐색하여 이미지 처리를 개선합니다. 다음 비디오 섹션에서는 이러한 매크로 분석 설정을 정의하는 방법에 대해 설명합니다. 매크로의 롤링 볼 반경 값을 조정하려면 이미지 데이터 세트를 나타내는 세 개의 NMJ Z 투영을 선택합니다.결과 res 이미지 이름과 sub 매크로 analyze에서 이전에 생성한 두 개의 활성 영역 스택 이미지 이름을 삭제합니다. 선택한 각 이미지에 대한 스택 이미지 이름 파일을 연 다음 도구 모음에서 분할 채널을 선택하여 채널 1의 이미지와 채널 2의 이미지를 만들고 이러한 파일을 저장합니다. 채널 1에 속하는 이미지를 엽니다. 이 경우 DLG one immuno 라벨링에 해당합니다.이제 프로세스 탭 아래에 있는 필터 빼기 배경을 실행합니다.롤링 볼 반경을 시냅스와 배경 사이의 대비를 증가시키는 값으로 설정합니다. 투영 유형을 최대 강도로 사용하여 Z 투영을 만들고 이미지를 저장합니다.그런 다음 모든 Z 투영에서 새 롤링 볼 반경으로 빼기 배경 알고리즘을 실행하고 결과를 저장합니다. 매크로에 가장 적합한 자동 임계값을 결정하려면 저장된 C 프로젝션을 열고 모두 시도 옵션을 사용하여 자동 임계값을 실행합니다. 결과 이미지에서 이미지에 가장 적합한 알고리즘을 찾고 추가 이미지에 대해 매크로를 실행할 때 해당 임계값 설정을 사용하여 진행합니다.다양한 자동 임계값을 정의하는 것은 매크로에 의한 적절한 이미지 분할에 중요합니다. 이러한 이유로 8개의 사이니지 매개변수를 적절하게 정량화하려면 소프트웨어에서 제공하는 16개의 자동 임계값 옵션을 숙지하는 것이 중요합니다. 더하기 버튼을 눌러 자동 임계값의 결과 이미지를 확대합니다.알고리즘 이름은 각 결과 이미지 아래에 있습니다. 이 예에서 NMJ 개요 임계값 설정에 가장 적합한 자동 임계값 알고리즘은 Huang입니다. 스켈레톤 임계값의 경우 가장 좋은 설정은 Li이고 활성 영역 임계값에 가장 적합한 설정은 Huang입니다.매크로에 대한 미세한 최대 노이즈 허용 오차 값을 정의하려면 원래 대표 NMJ 이미지로 돌아갑니다. BRP 채널을 엽니다. 팝업 메뉴의 플러그인 탭으로 이동하여 최대 3D를 선택합니다.잠시 후 새 이미지가 나타나고 원본 이미지를 닫습니다. 그런 다음 최소 3D 명령을 사용합니다. 그런 다음 최대 C2 스택 시냅스 하나의 이미지를 닫고 새로 생성된 이미지의 최소 최대 C2 스택 시냅스 1을 선택합니다.이제 find maxima 명령을 사용합니다. 새 창에서 미리보기 포인트 선택을 선택하고 노이즈 허용 오차를 50으로 설정합니다. 그런 다음 최대 포인트는 시냅스 활성 영역만 포함해야 하는 작은 십자가로 표시됩니다.크로스가 너무 많으면 노이즈 허용 오차 값을 높입니다. 일부 활성 영역에 주석이 추가되지 않으면 노이즈 허용 오차 값이 감소합니다. 매크로의 find maxima noise tolerance 필드에 대해 파생된 임계값을 사용합니다.최대 노이즈 허용 오차 값을 선택하려면 활성 영역의 수를 적절하게 정량화하는 것이 중요합니다. 적절한 값을 정의하기 위해 다른 값을 시도해야 하는 경우가 있습니다. 이제 매크로 인터페이스의 임계값 알고리즘에서 파생된 모든 값을 조정하고 원래 매크로 설정을 정의하는 데 사용된 대표 이미지에 대해 하위 매크로 분석을 실행합니다.흰색 점으로 표시된 활성 영역이 있는 새 파일이 생성됩니다. 이 파일을 도구 모음으로 끌어다 놓고 프로젝션 유형을 일부 슬라이스로 사용하여 Z 프로젝트를 선택하여 엽니다. 따라서 프로젝션 파일이 만들어집니다.다음 단계는 임계값을 조정하는 것입니다. 새 임계값 창에서 위쪽 막대를 밀어 원하는 모든 초점을 읽을 수 있는 임계값을 선택합니다. 이것은 BRP 긍정적 인 지점입니다.이 값을 BRP 푼크 하한 임계값으로 사용합니다. 이제 이전에 정의된 값, 알고리즘을 사용하여 원래 대표 NMJ 이미지에 대한 분석을 다시 실행한 다음 새 BRP puncta lower threshold 값을 사용합니다. 결과 이미지는 비판적 분석 기준을 충족해야 합니다.이제 정의 설정을 사용하여 동일한 조건에서 얻은 모든 NMJ 이미지에 대해 매크로를 실행합니다. Drosophila NMJ 형태 측정 매크로는 세 가지 돌연변이 유전자형에서 서로 다른 알려진 시냅스 결함을 검증하는 데 사용되었습니다. 안키린 두 돌연변이는 부톤과 더 작은 NMJ를 융합한 것으로 알려져 있습니다.매크로를 사용하여 panuronil 및 quirin two RNAI knock down NMJ의 면적과 둘레를 측정한 결과 대조군보다 훨씬 작은 것으로 나타났습니다. GTPase Rab3는 적절한 bruckpila 배포를 위해 필요합니다. 중단되면 활성 영역이 줄어듭니다.매크로 panuronil Rab 3 knock down flys를 사용하면 NMJ 터미널당 평균 138개의 활성 영역이 있는 반면 대조군에서는 290개가 감지되었습니다. 높은 와이어는 NMJ 성장의 중요한 조절자이며 돌연변이가 발생하면 NMJ는 말단에서 분기를 확장했습니다. 매크로 panuronil high wire RNAI knock down lines를 사용하여 NMJ에서 총 길이, 가장 긴 분기 길이, 분기 수 및 분기점 수를 포함하여 여러 골격 파생 매개변수가 크게 증가한 것으로 나타났습니다.이 비디오를 시청한 후에는 Drosophila NMJ 형태 측정 매크로의 설정을 작동하고 조정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 일단 숙달되면 50개의 시냅스 분석을 1시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이를 통해 시냅스당 약 15분의 정량화 시간을 절약할 수 있습니다.NMJ의 좋은 품질의 이미지를 획득하는 것이 중요합니다. 이미지가 좋을수록 매크로가 더 잘 수행됩니다. 이 기술은 신경생물학 분야의 연구자들이 초파리 NMJ의 형태학적 매개변수를 효율적으로 정량화하는 데 도움이 될 것입니다.

two-algorithms-for-high-throughput-multi-parametric-quantification

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

의 활성 영역의 해부 및 이미징 Drosophila 신경근육학 융티온

초파리 신경근 접합부(NMJ)는 시냅스의 형태와 기능을 연구하기 위한 모델로 사용됩니다. 이 비디오는 연구자들이 NMJ를 특성화하기 위해 정량화하는 중요한 특징에 대해 설명합니다. 예제 프로토콜은 정량화를 자동으로 수행할 수 있는 소프트웨어를 보여줍니다.

초파리 신경근접합부(NMJ) 정량화: 시냅스 형태 및 기능을 평가하는 방법

신경근 접합부(NMJ)는 때때로 시냅스 실패로 이어질 수 있는 다양한 조건에서 변경됩니다. 이 보고서는 이러한 구조적 변화를 정량화하기 위한 형광 현미경 기반 방법을 설명합니다.

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세포 내 소기관의 형태, 크기 및 위치는 진화적으로 보존되어 있으며 그 기능에 직접적인 영향을 미치는 것으로 보입니다. 이러한 과정의 기저에 있는 분자 메커니즘을 이해하는 것은 현대 생물학의 중요한 목표가 되었습니다. 여기에서 우리는 정량적 기술을 적용하여 이러한 연구를 촉진할 수 있는 방법을 보여줍니다.

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신경 근육 접합 구성 요소를 정확하게 검출하는 능력은 병리학적 또는 발달 과정으로 인해 아키텍처의 수정을 평가하는 데 중요합니다. 여기서 우리는 정량 적 측정을 수행하는 데 사용할 수있는 전산 신경 근육 접합의 고품질 이미지를 얻기 위해 간단한 방법에 대한 완전한 설명을 제시합니다.

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우리는 신경 근육 접합의 건축을 보존하고 성인 Drosophila 다리에 있는 운동 신경의 상세한 면역 세포화학 연구 를 가능하게 하는 해부 기술을 기술합니다.

확인된 모터 뉴런을 위한 신경근육 정션에서 변경을 검출하기 위하여 Drosophila 성인 다리의 해부 및 면역 조직 화학

이 프로토콜은 SMA 및 ColQ 관련 CMS의 마우스 모델에서 병리학 적 변화를 정량화하는 데 사용되는 컨 포칼 및 STED 현미경을 결합하여 신경근 접합부의 형태 측정 분석 방법을 설명합니다.

결합된 공초점 및 초분해능 현미경에 의한 마우스의 신경근 접합부 특성 분석

이 보고서는 Drosophila Larvae의 신경근 접합부를 시각화하기 위한 새로운 샘플 준비 절차를 제공합니다. 이 방법은 기존 방법에 비해 샘플의 말림을 방지하는 데 더 효과적이며 초파리 신경근 접합부 초구조 분석에 특히 유용합니다.

Drosophila 유충의 신경근 접합부의 투과 전자 현미경을 위한 시료 전처리 공정 최적화

여기에서는 신경근 접합부와 근육 세포의 미세소관 네트워크를 시각화하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. Drosophila melanogaster의 강력한 유전 도구와 결합된 이 프로토콜은 신경계에서 미세소관 네트워크 조절 단백질의 역할에 대한 유전자 스크리닝 및 미세소관 역학 분석을 크게 용이하게 합니다.

초파리 유충 신경근 접합부 및 근육 세포를 사용하여 미세소관 네트워크 시각화

배우세요 Drosophila NMJ Morphometrics 알고리즘을 사용하여 초파리 신경근육접합 형태를 자동 정량화하는 방법을 익히세요. 이 기술은 고처리량 분석을 통해 시냅스 발달 조절인자를 효율적으로 식별하는 데 활용됩니다.

높은 처리량 및 다중 파라 메트릭 정량화를위한 ​​두 알고리즘

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