Name: 안지오텐신 II 수용체의 현지화 시각화에 대한 수용체자가 방사선 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: 학습하세요 쥐 뇌에서 안지오텐신 II 수용체의 현지화 및 정량화를 위한 수용체자가 방사선법을 이용한 프로토콜입니다. 이 방법은 신경퇴행성 및 심혈관 질환 치료를 위한 새로운 치료법 개발에 중요한 통찰을 제공합니다.

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이 작업은 NIH Grant HL-113905의 지원을 받았습니다.

이 연구 수행 모든 동물의 절차는 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 맞은 노바 사우스 이스턴 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다, 제 8 판 (국립 아카데미 프레스, 워싱턴 DC, 2011 ). 수용체자가 방사선 1. 준비 조직 섹션 <ol><li> 희생시 수확 신선한 뇌 조직, 및 알루미늄 호일 대신에 포장 -20 ° C에 냉동 빨리. 20 ° C 냉동 - 정확한 형상을 유지 두개골 내를 모의하는 뇌 몰드에서 뇌를 배치하기 위해, 알루미늄 호일 대신 랩. 30 분 후, 장소 밀봉 냉동 보관 백에 조직 및 장기 저장을 위해 -80 ° C에 냉동 장치로 이동한다. <ol><li> -80 -10 ° C 및 -18 ℃의 최대의 최소로 설정 그라 이오 스탯에 C의 냉동고 및 전송 °, 피하기 위해 해동 관심의 냉동 조직 표본을 얻습니다. </li&gt; <li> 조직 상에 시료만을 배지에 시료의 작은 부분을 포함하는 글리콜 수지계 매립 매체 마운트 놓는다. 뇌의 경우, 뇌는 관상면에서 절편 수 있도록 수직으로 장착된다. </li></ol></li><li> 조직은 저온 유지 장치 내에서 마이크로톰에 탑재하고 제자리에 단단히 조여 놓습니다. 배측 - 복부 축이 수직 일반적으로 사용하는 뇌지도 책이라는 동일한 안테 - postero 좌표에있는 뇌의 왼쪽과 오른쪽을 확인하고. </li><li> 원하는 두께로 절단 시작 (20 μm의 권장) 및 슬라이드의 공간보다 큰 표면적을 갖고 수직 방향으로 현미경 슬라이드 상에 마운트 부 해동. 슬라이드의 첫 번째 세트는 (그림 3) 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5 표시되어 있습니다 즉, 오의 연속 세트의 슬라이드 상에 섹션을 수집합니다. </li><li> 섹션과 슬라이드 세트를 작성 후 최대 1 시간 동안 공기 건조에 슬라이드, 다음 SLI를 배치 할 수 있도록-20 ° C에서 플라스틱 슬라이드 자체 밀봉 냉동 보관 가방 상자, 저장에 데스. </li></ol> 2. 수용체자가 방사선 주의 : 방사능. 방사능을 처리하기 위해 보호 복장을 사용합니다. 폐기 시설에 의존하고, 제대로 (반감기 60 일) 부패하거나 인증 기업으로 뽑힐 지침을 따라야합니다. <ol><li> (그림 5)를 -20 ° C 냉장고에서 관심의 &quot;-2&quot; &quot;-1&quot;과 슬라이드를 제거하고 슬라이드 그립으로 마운트합니다. 함께 &#39;비 특정&#39;치료를위한 &quot;-1&quot;슬라이드 및 &#39;전체&#39;치료를위한 &quot;-2&quot;슬라이드를 탑재합니다. 바인딩 항아리가 10이 포함됩니다의 &#39;총&#39;(표 1) &#39;비 특정&#39;항아리 2 R 길항제 AT PD123319 10 μm의 최종 농도를 포함하며, 분석 매체 버퍼에, 1 R 길항제 AT (AM5을)를을 로사 르탄 AM5에서 μM PD123319. </li><li> 슬라이드 전환그립을 실온에서 30 분 동안 AM5의 35-40 mL로 충전 전 배양 코 플린 항아리에 슬라이드 각각의 억제제를 배치한다. 4 분 간격으로 자신의 전 배양 조에서 다음 세트를 시작합니다. </li><li> 즉시 방에서 60 ~ 90 분 동안 10 AM5 ml의 플러스 각각의 억제제 (그림 4에서 계산) 125 I-SI-중앙 II의 소정의 농도를 포함, 배양 슬라이드 우편물에 대한 사전 배양 용액에서 슬라이드를 전송 온도. 충분한 방사성이있는 경우, 10 슬라이드 수정 슬라이드 그립에 (다시 다시하는) 배치 및 코 플린 단지에 125 I-SI-중앙 II와 함께 배양 할 수있다. </li><li> 장소 (필요한 경우), 블롯을 부드럽게 두 개의 별도의 용기에 증류수 400 ㎖에 1-2 초 동안 소용돌이에 의해 린스 슬라이드 그립에 다시 슬라이드. </li><li> 정확히 1 분마다 (그림 4 &lt;에 도시 된 바와 같이 대한 AM5의 35 ~ 40 ml에 포함 된 네 개의 코 플린 단지에 순차적으로 슬라이드를 이동/ STRONG&gt;). </li><li> 마지막 1 분 린스 후, 부드럽게 얼음 차가운 증류수 사 변경에 1-2 초 동안 섹션을 소용돌이 친다. </li><li> - 불어 건조 시원한 공기와 슬라이드 (주의 : 뜨거운 공기가 방사성 화합물 휘발) 4 분 (그림 5)에 대해 서로 다른 각도에서 설정 네 헤어 드라이어를 사용하여, 모든 섹션이 건조 될 때까지, 다음 종이 타월에 배치합니다. </li><li> 마운트 조직은 양면 테이프를 사용하여 X 선 필름에 동격의 판지에 위쪽을 향하도록 슬라이드. </li><li> 적어도 하나의 마운트, 각 판지 위에 125 요오드 교정 표준 슬라이드 (그림 6). 주 : 검정 표준은 완전히 머리 부와 동일한 두께로 절단하고 현미경 위에 해동 - 장착 저온 유지되는 한 용액 투베르쿨린 주사기를 원심 분리에 의해 압축 된 페놀 고리를 포함하는 화합물에 결합 된 125 요오드 혼합 뇌 페이스트 이루어져 슬라이드. 대안에서, 125 I 교정 표준20 ㎛의 두께로 절단 플라스틱 수지는 상업적으로 얻을 수있다. 이러한 표준의 플라스틱 수지가 부분적 ~ 40 %의 조직 동등성 보정에 반영되어야하는 방사선 차폐 필름. </li></ol> 3. 필름의 노출 및 현상 <ol><li> 스트랩 백 X 레이 카세트 및자가 방사선 필름과 암실로 진행합니다. 카세트를 열고 내부 슬라이드 (그림 6)와 골 판지를 배치합니다. <ol><li> 불을 끄고 안전 등의 전원을 켭니다. 조심스럽게, X 레이 필름의 상자를 열고 한 필름을 제거하고, 카세트에서 슬라이드의 상단에 (오른쪽 아래 모서리에있는 들쭉날쭉 한 가장자리) 필름 광택면을 배치합니다. 조심스럽게 카세트를 닫고, 빛 (그림 6) 밖으로 밀봉 잠금 막대를 비틀어. -20 ° C에서 몇 주에 며칠 동안 슬라이드를 노출. </li></ol></li><li> 암실에서, 카세트를 열고 필름 현상 PROC 진행ESS. <ol><li> 연속 트레이에 슬라이드를 놓고; 2 분 동안 개발자, 5 분 동안 5 % 빙초산 30 초 산, 그리고 해결사를 함유하는 물. 필름은 20 분 동안 흐르는 물과 트레이에 배치 한 후 더 이상 10 이상의 초 Photoflo에 넣고 걸. 낮은 바인딩과 지역에서 측정 신호를 얻기 위해 충분히,하지만 너무 오래 높은 결합을 가진 지역으로 필름을 포화과 같이 노출 시간은 경험적으로 결정되고 다른 노출 시간과 여러 영화를 포함 할 수 있습니다. 허용 노출이 얻어지면, 다음 단계로 진행합니다. </li></ol></li></ol> 4. 조직학 <ol><li> thionin 염색 및 염색 시약 (표 2, 그림 7)를 준비합니다. <ol><li> 슬라이드 랙에 &quot;-3&quot;슬라이드를 놓고 1 분 동안 탈 이온수로 시작하는 순차적으로 전송 한 후 10 분 동안 thionin 얼룩 솔루션은 deion에 세 딥 다음화된 물, 탈 이온수 한 30 초 세척. </li><li> 다음과 같이 물을 따르면, 에탄올 세척에 슬라이드 선반을 두십시오; 각각 1 분 100 % 둘 에탄올 세척 한 다음 50 %, 70 %, 30 초 동안 90 %. 마지막으로, 3 분 동안 크실렌으로 슬라이드 랙을 배치 한 다음 5 분 동안 제 크실렌 용액 위에 옮긴다. </li></ol></li><li> 마지막 자일 렌 화장실에서 한 번에 하나의 슬라이드를 제거하고 유기 용매 장착 매체 수지베이스와 슬라이드의 상단 커버 및 슬라이드 상에 24mm X 60mm의 coverslip에 배치합니다. ~ 48 시간 동안 슬라이드가 충분히 건조 허용하고 2,400 dpi의 그레이 스케일에서 컴퓨터로 스캔합니다. </li></ol> 5. 농도계 이미지 분석 <ol><li> 왼쪽 하단에있는 들쭉날쭉 한 가장자리 아래로 필름 광택면을 놓고 이미징 시스템의 컴퓨터에서 왜곡없이 막 밀도 정보를 전송할 수있는 전용 스캐너를 사용하여 스캔. </li><li> 독점 영상 SYS를 엽니 다TEM과 활용 교정 바 필름의 이미지 (- 12,도 9)의 미래 농도계 분석 교정 표준을 확립한다. </li><li> 템플릿을 설정 또는 경험적으로 관심의 영역을 요약하거나하여 관심의 측정 영역. 데이터는, 제어 또는 야생형 (부) 및 지역를 수집하고 영화를 기반으로 분리된다. (그림 9) 측정에서 밀도 (fmol / g), 스캔 영역, 총 대상 면적을 포함해야합니다. <ol><li> 관심의 영역이 강조의 매개 변수 (그림 10) 사이에 떨어지는 것을 보장하여 스캔 영역 막대를 조정합니다. </li><li> 스프레드 시트로 데이터 내보내기 (표 4). 밀도 시간을 총 타깃 영역을 곱하고 그 특정 영역의 결합에 대한 값을 얻기 위해 스캔 영역으로 나눈다. 이 측정 값 모두 완료되면, 특정 바인딩 (P)을 수득 총 설정된 비특이적 기판화내다. 평균은 이들 값에 대해 수행 될 수있다. </li></ol></li></ol>

Robert Speth는 안지오텐신 II 수용체에 대한 항체를 상업 공급업체에 라이선스했으며 해당 항체 판매로 로열티를 받습니다. 다른 저자는 공개할 것이 없습니다.

기술 된 프로토콜은 설치류 뇌 이전에 수거하고 -80 ℃에서 보관의 관상 부의 인접 부에서의 방사성 리간드의 결합을 &#39;전체&#39;및 &#39;비​​특이적&#39;의 시각화를 식별하고, 거의 모든 조직에 용이하게 적용 할 수 있다는 해부학 적 수용체 또는 방사성 리간드 결합 부위의 차이 금액을 표시 하부 구조를 해결했다. 프로토콜에서 설명하는 절차는 간단하고 정확하게 분석 결과를 해석 중요하다. 20 ㎛의 두께를 최적으로 결정 하였다; 단면이 너무 두꺼우면, 비 특​​이 적 결합 어려운 목표로 방사성 리간드의 결합을 해결하는 데있어 증가한다. 부분이 얇게 절단하면, 성공적으로 절단하고, 변형이없는 연속 부분을 저장하는 것이 곤란해진다. 최적의 절삭 온도로 인해 조직의 특성과 절 그리고 난의 두께가 약간 달라집니다이야 일반적으로 경험적으로 결정. 접촉 블레이드와 조직 사이되면, 시편의 배향을 검토하고, 다시 거리 블레이드로부터 조직 표본을 이동하고, 장착 공 재 방향으로 재정렬 할 수있다. 설치류의 뇌를 절단 할 때의 배...

심혈관 질환 2011 년 1 년 미국에서 사망의 30 % 이상을 일으키는 원인이 미국에서 사망과 장애의 주요 원인이되고 있습니다. 미국 심장 협회 (American Heart Association)에서 가장 최근의 통계는 세 개 이상 한 사람이 하나가 나타냅니다 심혈관 질환의 이상 유형입니다. 심장 혈관 연구는이 질병을 이해에 진전을 만들기 위해 계속되지만 세대가 나이가 점점 시작으로 이러한 노력을 계속하는 것이 필수적이다. 레닌 - 안지오텐신 시스템 (RAS)는 주로 (도 1) 2-8 교감 신경계의 동맥 경화, 염증, 전신 혈관 수축 및 활성화를 촉진하여 심혈 관계의 조절에 중요한 역할을한다. RAS 장치 혈압 감소하는 신장의 방 사구체 세포 응답하여 혈류로 레닌 분비 될 때 활성화되는 호르몬 시스템, sympat 증가hetic 자극, 또는 황반 densa에 의한 나트륨의 흐름을 감소. 레닌 안지오텐신 I (ANG I)을 형성 (간에서 합성) 안 지오 텐시 노겐을 대사. 중앙 I는 안지오텐신 II (ANG II) 상기 RAS의 주요 이펙터 펩타이드를 형성하기 위해, 주로 폐, 신장, 혈관 내피 세포의 내강 측에, 안지오텐신 전환 효소 (ACE)에 의해 ectoenzyme을 대사한다. 중앙 II는 두 개의 수용체 아형을 활성화 할 수있다; (1 AT R) 타입 1 수용체 (2 R AT) 2 형 수용체는 심장 혈관 시스템을 조절하는 모두, 유체 및 전해질 항상성을 유지하고 지금은인지 기능 및 신경 퇴행성 질환에 영향을 미치는 것으로 간주됩니다 8,9을 처리합니다. 로컬, 뇌 특정 RAS는 독립적으로 중앙 II를 합성보고됩니다. 뇌에서, 전구체 단백질 지오 텐시 노겐는 레닌과 같은 ​​효소 I (3) 중앙으로 변환 별아교 세포 (10)에서 합성되고, 아마도 prorenin prorenin 수용체에 결합(11)이어서 풍부 뇌 12 뉴런의 세포 표면에 발현되는 안지오텐신 전환 효소에 의해 중앙 II로 전환. 중앙 II 생성이 intrabrain 1 AT 뇌에 대한 혈액을 매개로 중앙 II 분리되어 2 수용체에 작용 물질이다. 상기 한 R 중요한 생리 학적 역할을하지만, 더 나은 주로 심혈관 및 신장 (도 2)에 영향을 몸 전체의 병태 생리 학적 효과로 알려져있다. 중앙 II는 AT (1) R에 결합하면 혈관 수축의 원인; 혈류에 대한 저항을 증가시키고 혈압을 올리는. 또한, 증가 된 나트륨 및 보수성 선도 및 바소프레신​​ 알도스테론의 합성 및 분비를 촉진한다. 이러한 효과는 허혈성 뇌 손상 및인지 장애를 유발할 수 있으며, 파킨슨 병, 알츠하이머 병에 연결되며, diabeTES, 최근에 발견 된뿐만 아니라 학습과 기억 13-15에 영향을 줄 수 있습니다. 신장의 방 사구체 세포에 1 R AT 점에서 RAS의 피드백 루프는 레닌 분비가 억제됩니다. 흥미롭게도, AT (2) R은 일반적으로 1 R AT, 많은 다른 16 ~ 20 사이에서 혈관 확장, 신경 돌기의 가지, 축삭 재생, 항 증식 및 cerebroprotection의 원인의 조치를 반대 조절한다. 상기 R 2는 항 고혈압 최근에는 항암제 (21) 타겟으로서 확인되었다. 다양한 조직 내에서 중앙 II 수용체의 현지화 및 밀도를 결정하는 방법 그들은 RAS 특정 질병의 역할을 파악하는 데 도움이됩니다 양적 농도계 수용체자가 방사선을 사용하여 다양한 트리트먼트와 질병 상태에 의해 영향을받습니다. 수용체자가 방사선는 안지오텐신 I의 존재를 지시하기위한 효과적인 방법으로서 30 년 이상 사용되어왔다I 수용체와 뇌에서 RAS의 다른 구성 요소와 실험 조건 22-34의 다양한에서 쥐, 마우스, 기니 돼지, 개와 인간의 다른 조직. 뇌에서 중앙 II 수용체 위치의 중요성은 하나의 뇌에서 중앙 II의 작용에 기능적 신경 해부학을 적용 할 수 있다는 것, 예를 들면 시상 하부 (PVN)의 뇌실 핵 AT 한 R의 존재는 중앙의 기능을 제시 뇌 II는 바소프레신​​, 옥시토신 또는 부 신피질 자극 호르몬 방출 호르몬 (CRH) 방출, 또는 교감 신경계의 활성화를 촉진한다. 따라서, AT (1) R을 차단하는 약물은 뇌 RAS의 활동을 통해과 관련이 PVN 매개 효과의 일부를 줄일 수 있습니다. 진행중인 작업은 1 R 길항제 AT의 사용은 CRH의 외상 후 스트레스 장애 (PTSD) - 유도 방출을 감소시키고 PTSD의 증상을 개선 할 수 있음을 시사한다 (상처 등., 게시를 위해 제출). PVN, subfornical기관 (SFO)와 편도체는 항상성, 식욕 / 갈증, 수면, 기억, 감정 반응을 조절하기위한 알려져 있으며,이 시범 연구의 대상 지역이다. 이 영역은 현미경 슬라이드에 뇌의 코로나 섹션을 수집하고, 중앙 II 수용체에 대한 특정 방사성 리간드와 함께 특정 억제제와 섹션을 처리하여 조사 하였다. 본 연구에서 제안 된 벤더와 함께 모든 물질 및 시약 나열 요오드 125는 모노 125 I로 정제 된 중앙 II 수용체 길항제, 사르코 1 이소류신 8 중앙 II (SI 중앙 II)을 방사성 표지하는 데 사용되는 이전 35 설명 된 바와 같이 HPLC 방법을 사용하여 -SI 중앙 II. 이러한 높은 비 활동 방사성 리간드의 사용은 X 선 필름에 방사성 표지 부분의 노출 된 후 낮은 중간 및 높은 수용체 밀도 영역의 가시화를 허용한다. 요오드 (125)는 특정 량의 공지 된 양을 함유하는 뇌 페이스트 표준 필름을 교정함으로써영역에 결합 중앙 II 수용체 정량화 할 수있다. 실험 연구에서, 피험자의 뇌에서 바인딩 중앙 II 수용체 대조군의 뇌에서와 비교 될 수있다. 이것은 중앙 II의 행동이 유전 적 조건, 표현형 이상, 질병 상태 또는 약물 치료에 대한 응답으로 변경할지 여부를 표시 할 수 있습니다. 이 기술은 다음 RAS의 조절 곤란과 연관된 질환을 치료하는 치료제의 개발에 적용 할 수있다. 해부학 적 해상도하지만 사이트를 수용체 결합을 식별하는 대안적인 기술은, 해리 상수 방사성 리간드 결합 친화도를 평가하기위한 농도 범위에 걸쳐 방사성 리간드와 인큐베이션 조직 균질 물로부터 유도 된 조직의 막 제제를 사용하여 검정 (K D를 바인딩 관심의 조직) 및 최대 바인딩 용량 (B 최대). 여기에 설명 된 프로토콜은 5 대 공동으로 세분화 될 수있다mponents : 수용체자가 방사선에 대한 조직 섹션을 준비; 수용체자가 방사선; 필름의 노출 및 개발; 조직학; 및 농도계 이미지 분석.

<table><tbody><tr><td>500 ml 플라스틱 비커</td><td>Fisher</td><td>02-591-30</td><td></td></tr><tr><td>24 mm x 60 mm 커버슬립</td><td>Fisher</td><td>22-050-25</td><td></td></tr><tr><td>Autoradiography Imaging Film 24 mm x 30 cm</td><td>Carestream-Biomax MR Film</td><td>891-2560</td><td></td></tr><tr><td>Bacitracin (from Bacillus licheniformis)</td><td>Sigma</td><td>B-0125</td><td></td></tr><tr><td>Cardboard Sheet 8 x 11</td><td>Crescent Illustration Board #201</td><td>201</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jars</td><td>Fisher Scientific</td><td>E94</td><td></td></tr><tr><td>상업용 헤어 드라이어</td><td>Conair</td><td>모델 SD6X</td><td></td></tr><tr><td>일회용 배양 튜브</td><td>Fisher</td><td>14-961-26</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (디소듐 솔, 디하이드레이트)</td><td>USB Corporation</td><td>15-699</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>피셔</td><td>16-100-210&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-19 개발자 사진작가를 위한 약전 대체</td><td>품 Formulary, Inc.&nbsp;</td><td>01-0036</td><td></td></tr><tr><td>빙하 아세트산</td><td>Fisher</td><td>A38 SI-212</td><td></td></tr><tr><td>Histoprep/OCT</td><td>Fisher</td><td>SH75-125D</td><td></td></tr><tr><td>필름 해결사</td><td>Kodak</td><td>5160320</td><td></td></tr><tr><td>사진 flo</td><td>Kodak</td><td>1464502</td><td></td></tr><tr><td>Losartan</td><td>Fisher/Tocris</td><td>37-985-0</td><td></td></tr><tr><td>MCID&trade; Core 7.0</td><td>MCID</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way 슬라이드 그립</td><td>VWR</td><td>48440-003</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>PD123319</td><td>Fisher</td><td>13-615-0</td><td></td></tr><tr><td>프리미엄 차지드 슬라이드, 미세 연마 가장자리</td><td>프리미어 현미경 슬라이드</td><td>9308W</td><td></td></tr><tr><td> 125I 리간드</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEX- 248</td><td></td></tr><tr><td>125SI-Ang II&nbsp;</td><td>조지 워싱턴 대학교</td> Dr. Speth <td></td>Slide Mailers<td>에 의해 방사성 요오드</td></tr>화 <tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>HS15986</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dibasic Phosphate Anhydrous (Na2PO4)</td><td>Fisher</td><td>RDCS0750500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate (무수)</td><td>Fisher</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Thionin&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>T409-25</td><td></td></tr><tr><td>X-Ray Casette (10 x 12)</td><td>Spectronics Corporation</td><td>Four Square</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>X3P-1갤론</td><td></td></tr></tbody></table>

안지오텐신 ii 수용체의 현지화 시각화에 대한 수용체자가 방사선 프로토콜

Receptor Autoradiography Protocol for the Localized Visualization of Angiotensin II Receptors

이 프로토콜은 중앙 II 수용체 수용체 방사 법적 매핑을 수행하기위한 특정한 방사성 리간드를 사용하여 쥐의 뇌에서 안지오텐신 II (중앙 II)에 대한 수용체 결합 패턴을 설명합니다. 조직 표본 채취 및 -80 ° C에 저장됩니다. 그라 이오 스탯은 coronally 섹션에 조직 (뇌)를 사용하고 충전 슬라이드에 섹션을 장착 해동. 슬라이드에 장착 된 조직 섹션은 중앙 II 수용체를 방사성 표지 125 I-SI-중앙 II에서 배양된다. 인접한 슬라이드 두 가지로 구분된다 : 수용체 포화 비 방사성 중앙 II의 농도 또는 존재하에 (NSP)를 &#39;비특이적 결합을&#39;1 중앙 II 수용체 아형 AT (1 R AT) 선택적 중앙 II 수용체 길항제 , 1 R 길항제 없음으로 &#39;결합되지 합계&#39;. 이 중앙 II 수용체 아형 AT (2 AT R)의 포화 농도의 길항제 (PD123319, 10 μM)도 incubati에 존재버퍼에 AT (1) R 하위 유형에 결합하는 125 I-SI-중앙 II를 제한합니다. 22 ° C가, NSP 슬라이드 10 μM PD123319과 로사 르탄에 노출되어 ~에서 30 분 사전 부화 중에 슬라이드 10 μM PD123319에 노출되는 &#39;바인딩 합계&#39;있다. 슬라이드는 &#39;결합 합계&#39;위한 PD123319의 존재하에 125 I-SI 중앙 II와 함께 배양하고, 분석 완충액에 NSP위한 PD123319과 로사 르탄, 여러 &#39;세척&#39;다음 완충액 및 물을 염과의 비를 제거한다 특히 방사성 리간드를 결합. 슬라이드는 전문 필름 카세트를 사용하여 다음자가 방사선 필름에 노출 타격 건조기를 사용하여 건조된다. 필름을 현상하고 이미지 독자적인 영상 시스템 및 스프레드 시트를 사용하여 시각적이고 정량적 농도계위한 컴퓨터로 스캐닝된다. 슬라이드의 추가 설정은 조직 학적 비교를 thionin 염색된다. 수용체자가 방사선을 사용하는 장점은 시각화하는 능력이다중앙 II 티슈 시험편의 단면 내의 시츄 수용체 및 해부학 인접한 조직 학적 기준 단면과 비교하여 조직의 영역을 식별한다.

레닌 - 안지오텐신 시스템의 대사 경로의 개요도 2에 설명되어있는도 1 (R 1 R AT 2 AT) 안지오텐신 II 수용체 아형에 직접 포커스에 나타낸다. (3) 디스플레이를 관상 뇌의 이동도 도 4에 도시 된 바와 같이 다음 소정의 125 I-시앙 II 농도를 사용하여 수용체자가 방사선 절차를 통해 실행된다 현미경 슬라이드 상에 부. 도표 5는 골판지 등 상에 부착 된 수용체자가 방사선의 슬라이드에 대한 건조 공정을 도시 이어서,도 6에서 볼 및 개발 하였다. 표 2 목록을 정량 7. 교정 표준 단위 <stro...

여기에서는 안지오텐신 II의 요오드-125 표지 유사체를 사용하여 정량적, 농도 측정, 체외 수용체 자가방사선 촬영을 통해 쥐의 뇌에서 안지오텐신 II 유형 1 수용체의 국소화를 설명하는 프로토콜을 제시합니다.

안지오텐신 II 수용체의 현지화 시각화에 대한 수용체자가 방사선 프로토콜

This protocol describes receptor binding patterns for Angiotensin II (Ang II) in the rat brain using a radioligand specific for Ang II receptors to ...

본 절차의 전반적인 목표는 수용체 자동방사법(Receptor Autoradiography)과 뇌 구조의 조직학적 식별을 이용하여 뇌 절편 내 Angiotensin II 수용체 발현의 해부학적 위치를 파악하고 정량화하는 것입니다. 이 방법은 Angiotensin II가 행동, 인지 기능 및 심혈관 시스템에 영향을 미치는 뇌 영역을 식별함으로써 신경퇴행성 및 심혈관 질환 치료를 위한 새로운 치료법 개발에 통찰력을 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 정량적, 정성적 분석이 가능하며, 다른 방법보다 더 높은 특이성으로 Angiotensin II의 기능적 수용체를 식별할 수 있다는 점입니다.이 방법은 약물 남용과 관련된 수용체와 같이 신체 전반의 다른 호르몬 수용체 시스템의 기능성을 규명하는 데에도 활용될 수 있습니다. 조직을 채취한 직후, 두개골 내부를 모사한 뇌 몰드에 뇌 조직을 넣고 몰드를 알루미늄 호일로 감싸 -20 °C에서 보관합니다. 30분 후, 조직을 밀봉 가능한 냉동 보관 백으로 옮겨 -80 °C에서 보관합니다.절편 제작 전, 뇌 몰드에서 뇌를 조심스럽게 꺼냅니다. 뇌 조직을 절편화하려면 관심 시료를 -10°C에서 -18°C 사이로 설정된 크라이오스탯(cryostat)으로 옮깁니다. 조직이 새로운 온도에 평형을 이루면, 글리콜 및 수지 기반 배지를 사용하여 시료의 일부분을 조직 마운트에 수직으로 매립함으로써 관상면(coronal plane)의 절편 제작이 가능하도록 합니다.조직을 마이크로톰에 올리고 마운트를 단단히 고정한 다음, 원하는 두께로 뇌 조직을 절편합니다. 이후 조직의 더 넓은 표면적이 슬라이드에 닿을 수 있도록 절편들을 수직 방향으로 현미경 슬라이드에 부착합니다. 절편들을 5개씩 순차적인 세트로 수집합니다. 모든 절편을 수집한 후, 슬라이드를 최대 1시간 동안 공기 중에서 건조시킵니다.그 후 샘플을 플라스틱 슬라이드 상자에 넣고 밀봉 가능한 냉동 보관용 지퍼백에 담아 -20 °C에서 보관합니다. 표본을 방사성 표지하려면, 5개로 구성된 각 세트에서 첫 번째와 두 번째 슬라이드를 꺼내 시판 제품 또는 3D 프린터로 출력한 슬라이드 그립에 장착합니다. -1 슬라이드는 비특이적 처리군용이며, -2 슬라이드는 전체 처리군용입니다.적절한 사전 배양 Coplin jar에 담긴 실온의 AM5 35~40 mL와 각각의 억제제를 사용하여 슬라이드를 뒤집어 넣습니다. 여러 세트의 슬라이드를 동시에 처리하면 작업 부하가 매우 클 수 있습니다. 따라서 건조 단계에서 중첩이 발생하지 않도록 4분 간격으로 슬라이드를 사전 배양 jar에 넣는 것이 매우 중요합니다.30분 후, 슬라이드를 적절한 농도의 I125 SI Angiotensin II 및 각 처리군 억제제가 첨가된 10 mL의 AM5가 들어있는 배양용 슬라이드 메일러로 옮겨 실온에서 60~90분 동안 배양합니다. 125I SI Ang II의 정확한 농도를 결정하는 것은 일자별로 Angiotensin II 수용체를 비교하는 데 매우 중요합니다. 배양이 끝나면 슬라이드를 다시 슬라이드 그립에 넣고 슬라이드를 블로킹한 후, 400 mL의 증류수가 담긴 두 개의 별도 용기에서 1~2초 동안 부드럽게 흔들어 씻어냅니다.두 번째 세척 후에, 30~40 mL의 AM5로 1분씩 총 4회 순차적으로 슬라이드를 헹굽니다. 네 번째 세척 후, 얼음처럼 차가운 증류수를 4번 교체하며 각 단계마다 절편을 1~2초간 부드럽게 흔들어 줍니다. 그런 다음 서로 다른 각도로 설정한 4개의 송풍 건조기를 사용하여 4분 동안 찬 공기로 슬라이드를 건조합니다.모든 절편이 건조되면 슬라이드를 종이 타월로 옮깁니다. 그다음 양면테이프를 사용하여 조직 면이 위로 향하게 하여 슬라이드를 판지에 부착하며, 이때 X-ray 필름 위치에 그룹당 최소 하나 이상의 iodine 125 보정 표준 슬라이드를 포함합니다. 암실에서 절편을 필름에 노출시키기 위해, 판지에 부착된 슬라이드를 스트랩 백 X-ray 카세트 안에 넣고 조명을 끕니다.안전등을 켜고 X-ray 필름 상자를 조심스럽게 엽니다. 필름 한 장의 광택면이 위로 향하게 하고 톱니 모양의 가장자리가 오른쪽 하단 모서리에 오도록 카세트 내 슬라이드 위에 놓습니다. 그다음 잠금 바를 돌려 빛이 차단되도록 카세트를 조심스럽게 닫고, 카세트를 -20 °C에서 보관합니다.적절한 노출 시간이 지난 후, 필름을 현상액에 2분 동안 담근 다음, 아세트산이 포함된 2중 증류수 정지욕에 30초 동안 담그고, 이어서 정착액에 5분 동안 담급니다. 흐르는 물이 담긴 트레이에서 필름을 20분 동안 세척합니다. 필름을 계면활성제에 약 10초 동안 담근 후, 필름을 걸어 건조시킵니다.뇌 조직 절편의 조직학적 분석을 위해, 슬라이드 랙에 있는 3개의 절편을 해동합니다. 다음으로, 절편을 탈이온수로 1분간 세척한 후, thionin 염색액에 10분간 반응시키고 탈이온수 용기에 세 번 담가 헹굽니다. 슬라이드를 탈이온수에 30초 동안 추가로 담가 세척합니다.그 다음, 지시된 대로 순차적인 에탄올 세척 과정을 통해 슬라이드를 세척합니다. 마지막 100% ethanol 세척 후, 두 개의 자일렌 용기에서 각각 3분과 5분 동안 연속적으로 슬라이드를 세척합니다. 두 번째 자일렌 세척이 끝나면, 한 번에 하나의 슬라이드 상단 가장자리를 수지 기반의 무기 용매 봉입제를 사용하여 덮습니다.24 by 60 밀리미터 커버슬립을 슬라이드에 부착하고 슬라이드를 48시간 동안 건조시킵니다. 그 후 슬라이드와 필름을 2400 DPI 그레이스케일로 스캔하여 컴퓨터로 읽어들입니다. 밀도 측정을 통해 필름을 분석하려면, 스캔 후 각 필름에서 관심 영역을 경험적으로 지정합니다.이것은 이미지 분석 프로그램에서 스캔한 필름을 연 후 생성된 의사 색상(pseudo-color) 이미지입니다. 측정 항목에 밀도, 스캔 영역 및 총 표적 영역을 포함하십시오. 각 관심 영역이 강조 표시 파라미터 범위 내에 들어오도록 스캔 영역 바를 조정하십시오.그 후 데이터를 스프레드시트로 내보내어 각 시료에 존재하는 특이적 결합을 결정합니다. 정량을 위한 교정 표준 단위는 분석이 수행된 날짜를 기준으로 결정됩니다. 필름을 스캔한 후, 교정 값은 해당 특정 필름에 대한 iodine 125 표준물의 다양한 농도를 기반으로 곡선을 생성하는 데 사용됩니다.정확성을 위해 보정 및 표준 값은 3회 반복 측정하여 기록합니다. 비특이적 결합 그룹과 전체 그룹의 구분 및 조직 레이블은 각 데이터 세트를 적절한 하위 그룹에 할당하여 설정합니다. 상한 임계값은 매개변수를 빨간색에서 검은색으로 조정하여 설정해야 하며, 하한 임계값은 전체 스캔 관심 영역을 보다 정확하게 측정할 수 있도록 0에 가깝게 설정해야 합니다.예를 들어, 여기서는 해부학적 확인을 위해 thionine 염색 절편과 비교하여 시상하부 뇌실 주변핵의 총 결합군 대 비특이적 결합군의 최종 측정 면적을 비교하였습니다. 비특이적 결합은 포화 농도의 비방사성 Angiotensin I Receptor 리간드가 존재하는 상태에서 Angiotensin Receptor가 아닌 곳에 결합된 방사성 리간드의 양이며, 총 결합은 비방사성 Angiotensin I Receptor 리간드가 없는 상태에서 결합된 방사성 리간드의 양입니다. 이후 총 결합 값에서 비특이적 결합 값을 빼면 Angiotensin I Receptor에 대한 특이적 결합 값을 얻을 수 있습니다.숙달되면 수용체 자동 방사선 사진 촬영 단계는 약 4시간 만에 완료할 수 있으며, 필름 현상 단계는 필름 한 장당 약 30분이 소요됩니다. 이 절차를 수행할 때, 모든 슬라이드를 정확히 동일한 시간 동안 배양, 세척 및 건조하도록 시간을 추적하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에 뇌 형태학에 대한 추가 연구를 수행하여 Angiotensin II Receptor 발현을 나타내는 영역의 크기 변화를 평가할 수 있습니다.이 기술은 수용체 약리학을 연구하는 연구자들이 다양한 신경호르몬, 신경전달물질 및 약물에 의해 서로 다른 뇌 영역이 어떻게 영향을 받는지 결정할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 수용체 방사선자기촬영법(receptor autoradiography) 분석을 성공적으로 수행하고, 조직학적으로 염색된 슬라이드를 준비하며, 특정 뇌 영역의 수용체 위치를 확인하기 위해 방사선자기촬영 영상을 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 방사성 물질을 다루는 것은 위험할 수 있으므로, 방사능 오염을 방지하기 위해 적절한 차폐, 밀폐, 노출 모니터링 및 폐기물 처리와 같은 예방 조치를 항상 취해야 함을 기억하십시오.

receptor-autoradiography-protocol-for-localized-visualization

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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