안지오텐신 II 수용체의 현지화 시각화에 대한 수용체자가 방사선 프로토콜

이 절차의 전반적인 목표는 수용체 자가 방사선 촬영과 뇌 구조의 조직학적 식별을 활용하여 뇌 절편에서 Angiotensin II 수용체 발현을 해부학적으로 국소화하고 정량화하는 것입니다. 이 방법은 안지오텐신 II가 행동, 인지 기능 및 심혈관계에 영향을 미치는 뇌 영역을 식별하여 신경퇴행성 및 심혈관 질환 치료를 위한 새로운 치료법 개발에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 양적, 질적이며 다른 방법보다 더 큰 특이성으로 Angiotensin II에 대한 기능적 수용체를 식별할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 또한 남용 약물과 관련된 수용체와 같은 신체 전체의 다른 호르몬 수용체 시스템의 기능을 특성화할 수 있습니다. 채취 직후, 두개골 내부를 모방한 뇌 주형에 뇌 조직을 넣고 주형을 알루미늄 호일로 싸서 섭씨 영하 20도의 보관을 합니다. 30분 후 티슈를 밀봉 가능한 냉동 보관 백에 옮기고 영하 80도에서 보관하십시오.

절편하기 전에 뇌 곰팡이에서 뇌를 부드럽게 제거합니다. 뇌 조직을 절편화하기 위해, 관심 표본을 섭씨 영하 10도에서 영하 18도 사이로 설정된 저온 유지 장치로 옮깁니다. 조직이 새로운 온도로 평형을 이루면 글리콜 및 수지 기반 배지를 사용하여 표본의 작은 부분을 조직 마운트에 수직으로 삽입하여 관상동맥 평면을 절단할 수 있습니다.

조직을 마이크로톰에 로드하고 마운트를 제자리에 단단히 조인 다음 원하는 두께로 뇌를 절단하기 시작한 다음 수직 방향으로 현미경 슬라이드에 섹션을 장착하여 슬라이드에 조직의 더 큰 표면적을 적용합니다. 섹션을 5개씩 순차적으로 수집합니다. 모든 섹션이 수집되면 슬라이드를 최대 1시간 동안 자연 건조시킵니다.

그런 다음 샘플을 플라스틱 슬라이드 상자에 넣어 자체 밀봉 냉동 백에 넣어 섭씨 영하 20도에서 보관합니다. 시편에 무선 라벨을 부착하려면 5개 세트에서 첫 번째 및 두 번째 슬라이드를 제거하고 시판용 또는 3D 프린팅 슬라이드 그립에 장착합니다. 대시 1 슬라이드는 비특이적 처리 그룹을 위한 것이고 대시 2 슬라이드는 전체 처리 그룹을 위한 것입니다.

35-40 밀리리터의 실온 AM5와 각각의 억제제에 있는 슬라이드를 적절한 사전 배양 Coplin 용기에 뒤집습니다. 여러 세트의 슬라이드를 실행하는 것은 압도적일 수 있습니다. 따라서 건조 단계에서 겹치지 않도록 4분 간격으로 사전 배양 용기에 슬라이드를 배치하는 것이 매우 중요합니다.

30분 후, 적절한 농도의 I125 SI 안지오텐신 II와 해당 치료군 억제제가 보충된 AM5 10밀리리터가 들어 있는 배양 슬라이드 메일러로 슬라이드를 실온에서 60-90분 동안 옮깁니다. 125I SI Ang II의 정확한 농도를 결정하는 것은 Angiotensin II 수용체를 하루에서 다음 날로 비교할 수 있도록 하는 데 중요합니다. 배양이 끝나면 슬라이드를 슬라이드 그립으로 되돌려 놓고 슬라이드를 막고 400ml의 증류수가 담긴 두 개의 별도 용기에서 1-2초 동안 부드럽게 소용돌이칩니다.

두 번째 물 세척 후 30-40ml의 AM5에서 40 개의 순차적 1 분 세척으로 슬라이드를 헹굽니다. 네 번째 세척 후 얼음처럼 차가운 증류수를 4번 바꾸어 1-2초 동안 섹션을 부드럽게 휘젓습니다. 그런 다음 서로 다른 각도로 설정된 4개의 블로우 드라이어를 사용하여 4분 동안 시원한 공기로 슬라이드를 건조시킵니다.

모든 섹션이 마르면 슬라이드를 종이 타월에 옮깁니다. 그런 다음 양면 테이프를 사용하여 X선 필름용 판지 조각에 조직 면이 위로 향하게 슬라이드를 장착하고 그룹당 하나 이상의 요오드 125 교정 표준 슬라이드를 포함합니다. 섹션을 필름으로 노출시키려면 어두운 방에서 판지 슬라이드를 스트랩 백 X-ray 카세트 안에 넣고 조명을 끕니다.

안전 조명을 켜고 X-ray 필름 상자를 조심스럽게 엽니다. 반짝이는 면이 위로 향하게 한 필름을 카세트의 슬라이드 위에 오른쪽 하단 모서리의 들쭉날쭉한 가장자리가 오도록 놓습니다. 그런 다음 잠금 막대를 꼬아 빛을 차단한 상태에서 카세트를 조심스럽게 닫고 카세트를 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오.

적절한 노출 기간이 지난 후 필름을 현상액에 2분 동안 옮긴 다음 정지 수조에서 30초 동안 넣고 아세트산으로 이중 증류수를 한 다음 정착액에서 5분 동안 가열합니다. 흐르는 물이 담긴 트레이에서 필름을 20분 동안 씻습니다. 약 10초 동안 서펙턴트에 옮기고 필름을 걸어 말리십시오.

뇌 조직 절편의 조직학적 분석을 위해 슬라이드 랙에서 대시 3개 부분을 해동합니다. 다음으로, 탈이온수로 1분 동안 절편을 세척한 다음 티오닌 염색 용액에서 10분 동안 배양하고 하나의 탈이온수 용기에 3회 담그십시오. 추가로 30초 동안 탈이온수 세척을 위해 슬라이드를 담그십시오.

그런 다음 표시된 대로 순차적인 에탄올 세척으로 슬라이드를 세척합니다. 마지막 100% 에탄올 세척 후 자일렌 용기 2개에 담아 3분과 5분 연속으로 슬라이드를 세척합니다. 두 번째 크실렌 세척이 끝나면 한 번에 한 슬라이드의 상단 가장자리를 수지 베이스, 무기 용제 장착 매체로 덮습니다.

24 x 60mm 커버를 슬라이드에 장착하고 슬라이드를 48시간 동안 건조시킵니다. 그런 다음 슬라이드와 필름을 2400DPI 그레이스케일로 컴퓨터에 스캔합니다. 밀도 측정법으로 필름을 분석하려면 스캔 후 각 필름의 관심 영역을 경험적으로 간략하게 설명합니다.

이미지 분석 프로그램에서 스캔한 필름을 개봉한 후 생성되는 유사 색상 이미지입니다. 밀도, 스캔 영역 및 총 대상 영역을 측정에 포함합니다. 스캔 영역 막대를 조정하여 각 관심 영역이 강조 표시의 매개변수 사이에 속하도록 합니다.

그런 다음 데이터를 스프레드시트로 내보내 각 샘플에 존재하는 특정 바인딩을 확인합니다. 정량화를 위한 검량 표준 단위는 분석이 수행된 날짜를 기준으로 결정됩니다. 필름을 스캔한 후 보정 값은 해당 특정 필름에 대한 다양한 농도의 요오드 125 표준을 기반으로 곡선을 생성하는 데 사용됩니다.

교정 및 표준 값은 정확성을 위해 세 번 기록됩니다. 비특이적 결합과 전체 그룹 및 조직 레이블 간의 구분은 각 데이터 세트를 적절한 하위 그룹에 할당하여 설정됩니다. 매개변수를 빨간색에서 검은색으로 조정하여 더 높은 임계값을 설정해야 하며, 더 낮은 임계값은 스캔된 전체 관심 영역을 보다 정확하게 측정할 수 있도록 0에 가깝게 설정해야 합니다.

예를 들어, 여기서, 시상하부의 뇌실주위핵의 최종 측정된 면적을 전체 결합 그룹 대 비특이적 결합 그룹에서 해부학적 확인을 위해 티오닌 염색 절편과 비교합니다. 비특이적 결합은 비방사성 안지오텐신 I 수용체 리간드의 포화 농도가 존재할 때 비-안지오텐신 수용체에 결합된 방사성 리간드의 양이며, 총 결합은 비방사성 안지오텐신 I 수용체 리간드가 없을 때 결합된 방사선 리간드의 양입니다. 그런 다음 총 결합 값에서 비특이적 결합 값을 빼서 Angiotensin I 수용체에 대한 특정 결합 값을 얻을 수 있습니다.

일단 마스터하면 수용체 자가방사선 촬영 단계는 약 4시간 내에 완료할 수 있는 반면, 필름 현상 단계는 필름당 약 30분이 소요됩니다. 이 절차를 수행하는 동안 모든 슬라이드가 정확히 동일한 기간 동안 배양, 헹굼 및 건조되도록 시간을 추적하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 안지오텐신 II 수용체 발현을 나타내는 영역의 크기 변화를 평가하기 위해 뇌 형태학에 대한 추가 연구를 수행할 수 있습니다.

이 기술은 수용체 약리학을 연구하는 연구자들이 다양한 신경 호르몬, 신경 전달 물질 및 약물에 의해 다양한 뇌 영역이 어떻게 영향을 받는지 확인할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 수용체 자가방사선 촬영 분석, 조직학적으로 염색된 슬라이드를 성공적으로 수행하고 수용체를 특정 뇌 영역에 국한시키기 위한 자가방사선 사진을 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 방사능을 다루는 작업은 위험할 수 있으며 방사능 오염을 방지하기 위해 항상 적절한 차폐, 봉쇄, 노출 모니터링 및 폐기와 같은 예방 조치를 취해야 합니다.