Name: 다양한 조직에서 면역 세포의 질병에 의존하는 유통의 마우스 및 평가에 실험자가 면역 뇌척수염의 유도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 학습하세요 실험자가 면역 뇌척수염(EAE) 유도 및 면역 세포 분포 평가 방법을 통해 다발성 경화증의 분자 메커니즘을 연구하는 기법을. 유세포 분석과 정량 PCR을 활용하여 중추신경계 면역 세포 침윤 시점을 파악하고 치료 전략 개발에 기여합니다.

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이 작업은 EKFS(Else Kröner-Fresenius Foundation) 연구 교육 그룹 TRIP(Translational Research Innovation - Pharma)와 헤센 주의 "Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz (LOEWE), Schwerpunkt: Anwendungsorientierte Arzneimittelforschung"의 지원을 받았습니다.

윤리 선언문 : 우리의 실험 절차는 Regierungspräsidium 다름슈타트 (독일)의 윤리위원회의 승인을 국내 및 유럽 규정을 확인하고 있습니다. 모든 노력이 동물의 고통을 최소화하고 사용하는 동물의 수를 줄이기 위해 만들어졌다. 1. EAE 모델 <ol><li> EAE 모델의 유도 <ol><li> EAE의 유도를 위해 10 13 주령 여성 129S4 / SvJae × C57BL / 6 마​​우스를 사용합니다. </li><li> 상단에, 쥐에게 피하 주사를주고 encephalitogenic MOG (35), 허리 - 400 μg의 결핵균이 포함 된 200 ㎕를 완료 Freund`s 보조제 (CFA)에서 유화 55 (수초의 희소 돌기 아교 세포 당 단백질) 펩티드 (200 μg의). 주 : 음이 아닌 질환 유발 허위 대조군으로 같은 부피, 같은 경로에 의해 결핵균을 함유하는 프로 인트 불완전 보조제를 사용할 수있다. </li><li> THEReafter, 다시 24 시간 후, 마우스에게 (200 ㎕를 인산염 완충 식염수, PBS에 희석 총 0.2 μg의에서) 백일해 독소의 복강 내 주사를 제공합니다. 건강한 동물 질병 비교할 수 있도록, 대조군으로 처리되지 않은 마우스를 사용합니다. 참고 : (200) EAE를 유도하는 것도 가능하다 - 300 μg의의 MOG 35-55 펩타이드, 300 - CFA에서 결핵균의 500 μg의 0.2 - 주입 당 0.2 ml의 - 0.3 μg의 백일해 독소를 0.1 볼륨. </li><li> 마우스는 임상 증상 매일, 주입 후 일주를 조사 시작 (단계 1.2.1 참조) 참고 : 질병 발병의 날은 다른 실험에서 다양하지만 우리의 실험실 조건 하에서,이 날 11 주위 따라서, 여기에 14 일 3 일 질병 발병 이후로 정의된다. 본 연구의 모든 마우스는 임상 증상을 개발했다. </li></ol></li><li> 쥐의 점수 <ol><li> 다음과 같이 임상 점수에 의한 임상 증상을 분류 :0) 아무 표시도없고, 꼬리 0.5) 말단 마비, 1) 꼬리의 완전한 마비, 1.5) 맥 빠진 꼬리와 뒷다리의 약한 약점, 2) 다리를 저는 꼬리와 뒷다리의 심각한 약점, 2.5) 맥 빠진 꼬리의 마비 하나의 뒷다리, 3) 다리를 저는 꼬리와 두 뒷다리 마비, 뒷다리 하나 앞 사지의 약점 모두 3.5) 마비 (이 점수를 달성 마우스) 지역 윤리 가이드 라인을 유지, 안락사시켰다. </li></ol></li></ol> 유동 세포 계측법 분석을위한 단일 세포의 2. 준비 참고 : 항체 혼합물 1 ㎕의 CD45-Vioblue, 2 μL CD8-eFluor650, 0.5 ㎕를 CD11b를-eFluor605, 0.5 μL F4 / 80-PE-Cy7, 1 μL CD3-PE-CF594, CD4-V500, 0.5 μL의 중 CD11c 구성 -AlexaFluor700, 1 ㎕의 CD19-APC-H7 1 μL Ly6G-APC-Cy7. 참고 : 혈액, 림프절, 비장 및 척수을 다음과 같이 다음 절차는 : 마우스가 깊이 isofl의 조합으로 마취하고 있습니다urane 및 케타민 (100 ㎎ / ㎏ 체중) (분당 carbogen 2 %). 다음으로, 가슴을 열고 intracardial 막대기로 혈액을 제거하고 차가운 PBS로 intracardially 마우스를 관류. 그런 다음 비장 한 다음 림프절 마지막으로 척수를 제거합니다. 당신이 intracardially 쥐를 관류 할 필요가없는 경우 다음 목의 탈구에 의해 깊은 마취에서 쥐를 안락사. <ol><li> 비장 세포의 분리 <ol><li> 이소 플루 란 (분당 carbogen 2 %) 및 ​​케타민 (100 ㎎ / ㎏ 체중)의 조합으로 쥐를 마취. </li><li> 80 % 이소프로판올 젖은 절개 지역은 가위를 사용하여 머리카락과 함께 모든 오염을 방지하고 깊은 조직을 천공하지 않고, 길이 방향으로 흉부를 엽니 다. </li><li> 차가운 PBS 산도 7.0 23 intracardially 마우스를 관류. 참고 : 비장이 흉곽 아래의 왼쪽 우수한 복부 사분면에 위치해 있습니다. 비장이 연구 될 경우에만,이 기관은 Retai 무료 뉴스하기 위해 관류 전에 제거 될 수있다관심의 n은 모든 세포 유형. </li><li> 비장을 제거하고 약 1/8을 차단하고 무게. 얼음에 PBS에서 샘플을 저장합니다. </li><li> 2 mL의 주사기의 플런저를 사용하여 (50 ㎖의 튜브 위에 위치)은 70 ㎛의 메쉬 체로 비장 조직을 짠다. </li><li> 5 ml의 PBS와 메쉬를 씻으십시오. 3 분 동안 1,800 XG에 원심 분리기. 솔루션을 용균 500 μL에 펠렛을 재현 탁. 주의 :이 단계에서는, 그 후, 대안 FACS 분석법 비즈 (섹션 3 참조)를 사용하지 않는 것을 사용하고, 경우에 차동 셀 카운트 할 필요가있을 수있다. </li><li> 실온 (RT)에서 10 분 동안 품어 500 μl의 PBS를 추가합니다. 실온에서 650 XG (RT)에서 6 분 동안 원심 분리기. </li><li> 500 ㎕의 PBS로 세척 단계를 반복합니다. 100 ㎕의 0.2 % 소 혈청 알부민 (BSA)에서 세포 펠렛을 재현 탁, 상층 액을 제거 / PBS 2 μL Fc 수용체 -1 (FcRI) 블로킹 버퍼를 추가하고 어두운 곳에서 실온에서 15 분 동안 배양한다. </li><li> 13 μL 추가tibody 혼합물은, 어둠 속에서 실온에서 15 분을 품어 RT에서 650 XG에 6 분 동안 500 ㎕의 PBS와 원심 분리기를 추가합니다. 상층 액을 버린다. 주 : 제조업체의 염색 방법은 하나의 세척을 권장하지만 배경 얼룩의 추가적인 감소는 임의로 세척 단계를 하나 또는 두 번 이상 반복함으로써 달성 될 수있다. </li><li> (잠재적으로 세포 응집을 감소시키기 위해, 단백질 분리 또는 아마도 런닝 버퍼) 및 튜브 유세포로 전송 세포 500 ㎕의 PBS에 펠렛을 재현 탁. 얼음에 세포를 유지합니다. </li></ol></li><li> 림프절 세포의 분리 <ol><li> 이소 플루 란 (분당 carbogen 2 %) 및 ​​케타민 (100 ㎎ / ㎏ 체중)의 조합으로 쥐를 마취. </li><li> 80 % 이소프로판올 젖은 절개 영역과 가위를 사용하여 길이 방향으로 흉부를 엽니 다. 차가운 PBS 산도 7.0 23 intracardially 마우스를 관류. </li><li> 사타구니 림프절을 분리 신중 하이의 영역에서 피부를 제거p와는 집게와 지방 조직에서 조심스럽게 림프 노드를 선택합니다. 사타구니 림프절을 달아 얼음에 PBS에서 샘플을 저장합니다. 참고 : 우리는 우리의 연구 때문에 O`Connor 등의 알에서 서혜부 림프절을 사용했다. 활성화 된 단핵 세포, 대 식세포, 호중구 및 T 세포의 높은 숫자는 모든 EAE 유도 24 후 서혜부 림프절에 존재하는 것을 발견했다. </li><li> 2 mL의 주사기의 플런저를 사용하여 (50 ㎖의 튜브 위에 위치)은 70 ㎛의 메쉬 체로 림프절을 짠다. </li><li> 5 ml의 PBS와 메쉬를 씻으십시오. 8 분 동안 2,400 XG에 원심 분리기. 100 ㎕의 0.2 % BSA / PBS에서 세포 펠렛을 재현 탁 2 μL FcRI 블로킹 버퍼를 추가하고 어두운 곳에서 실온에서 15 분 동안 배양한다. </li><li> 13 μL에게 항체 혼합물을 추가 어둠 속에서 실온에서 15 분을 품어, 실온에서 650 XG에서 6 분 동안 500 ㎕의 PBS와 원심 분리기를 추가합니다. </li><li> 상등액을 버리고 300 ㎕의 PBS에서 세포 펠릿 (또는 적절한 주행 완충액)을 재현 탁하고 전송할유동 세포 계측법 튜브. </li></ol></li><li> 혈액 세포의 단리 <ol><li> (EDTA 안정화) 50 μl의 혈액 50 μl를 20 mM의 HEPES를 추가하고 솔루션을 용균 500 μl를 추가합니다. 실온에서 10 분 동안 품어 500 μl의 PBS를 추가합니다. 실온에서 650 XG에 6 분 동안 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 세척 단계를 반복합니다. </li><li> 100 ㎕의 0.2 % BSA / PBS에서 세포 펠렛을 재현 탁 2 μL FcRI 블로킹 버퍼를 추가하고 어두운 곳에서 실온에서 15 분 동안 배양한다. </li><li> 13 μL에게 항체 혼합물을 추가 어둠 속에서 실온에서 15 분을 품어, 실온에서 650 XG에서 6 분 동안 500 ㎕의 PBS와 원심 분리기를 추가합니다. 상등액을 버리고 PBS 300 ㎕를 상기 세포 펠렛을 재현 탁하고 유세포 튜브로 옮긴다. </li></ol></li><li> 척수 세포의 분리 <ol><li> 이소 플루 란 (분당 carbogen 2 %) 및 ​​케타민 (100 ㎎ / ㎏ 체중)의 조합으로 쥐를 마취. </li><li> 젖은 절개 80 % 이소프로판올과 영역과 길이 방향으로 흉부를 엽니 다가위를 사용하여. 차가운 PBS 산도 7.0 23 intracardially 마우스를 관류. </li><li> 뒷면의 절개 영역을 적시고 다시 메스와 길이 절단하고 피부를 제거합니다. </li><li> (뒷다리 사지를 innervates) 척추의 요추 부분을 잘라 척수를 추출하기 위해 PBS 채워진 주사기로 세척합니다. , 요추 코드의 약 1/3을 잘라이 무게와 얼음에 PBS에서 샘플을 저장합니다. </li><li> 4 ℃에서 2 분 250 XG에 원심 분리기. , 상층 액을 버리고 500 ㎕의 세포 분리 솔루션 및 HBSS 추가 (1 : 1). 3 ㎎ / ㎖의 콜라게나 A와 1 단위 / ㎖의 DNase I을 추가까지 반복 상하 피펫 팅하여 세포를 목을 베다 400 rpm으로 37 ℃에서 진탕하면서 30 분간 배양한다. 주 : 바람직한 경우, 세포 현탁액은 배경 형광도의 저감하여, 유세포 측정의 감도를 향상시킬 수 밀도 구배 원심 분리에 의해 미엘린 및 세포 파편을 오염 지울 수취득해야 할 이벤트의 수를 D (섹션 3.5 참조). </li><li> 실온에서 2 분 동안 250 XG에 원심 분리기. 상등액을 버리고 1 ml의 10 % 소 태아 혈청 (FCS)에 펠렛을 재현 탁 / 둘 베코 최소 필수 배지 (DMEM) 및 최대 반복 상하 피펫 팅하여 다시 세포를 목을 베다. </li><li> 실온에서 2 분 동안 250 XG에 원심 분리기. 세척 단계를 반복합니다. </li><li> 1 ㎖의 PBS에서 세포 펠렛을 재현 탁하고, 2 mL의 주사기의 플런저를 사용하여 (50 ㎖의 튜브 위에 위치)은 70 ㎛의 메쉬 체로 척수 짠다. </li><li> 4 ml의 PBS와 메쉬를 씻으십시오. RT에서 3 분 동안 1,800 XG에 원심 분리기. , 상층 액을 버리고 100 ㎕를 0.2 % BSA에서 세포 펠렛을 재현 탁 / PBS는 2 μL FcRI 차단 시약을 추가하고 어둠 속에서 실온에서 15 분 동안 품어. </li><li> 13 μL에게 항체 혼합물을 추가 어둠 속에서 실온에서 15 분을 품어, 실온에서 650 XG에서 6 분 동안 500 ㎕의 PBS와 원심 분리기를 추가합니다. </li><li> , 상층 액을 버린다 셀 PELLE를 재현 탁500 ㎕의 PBS에서 t (또는 적절한 주행 완충액) 및 튜브 유동 세포 계측법에 옮긴다. </li></ol></li></ol> 3. 유세포 분석 <ol><li> Olesch 외. (25)에 의해 기술 된 바와 같이 최적의 농도를 결정하기 위해 미리 모든 항체 적정한다. </li><li> 제조자의 지시에 따라 여러 색 보정 매트릭스를 만들기 위해 단일 ​​색 보정 항체 캡쳐 보상 비드를 사용한다. </li><li> 매일 제조자의 지침에 따라 특정 비드를 사용하여 기기 조정을 제어한다. </li><li> 직접 측정 유동 세포 계측법 전에, 세포를 30 μl를 유세포 절대 카운트 표준을 추가 절대 세포 수를 결정하는 (격리 절 2.1, 2.2, 2.3, 2.4 참조). 대신 카운트 비드를 사용하는 세포를 카운트 할 수있다. </li><li> 사이토 흐름으로 샘플 (50 이벤트 : 10 만 이벤트, 척수, 비장, 림프절, 혈액에서 세포)를 차지ND 특정 유동 세포 계측법 소프트웨어를 사용하여 분석한다. <ol><li> 유동 세포 계측법 소프트웨어를 열고 버튼 &quot;샘플을 추가&quot;를 눌러 FCS 3.0 파일을 추가합니다. </li><li> 두 번 클릭하여 추가 파일을 엽니 다. X 축 및 Y 축에 대한 채널을 조정한다. 관심의 세포 인구는 게이트를 만들 선택합니다 (그림 4 참조). </li></ol></li></ol> 4. 정량 PCR 분석 <ol><li> cDNA를로의 mRNA의 분리 및 전사 <ol><li> 페놀 - 클로로포름에 의해 요추 척수 (1/3), 비장 (1/8) 및 서혜부 림프절에서의 mRNA를 추출하고 에탄올 (26) 침전. <ol><li> 이를 위해, 10 분간 배양하고, 1 ㎖의 구 아니 디늄 티오 시아 네이트 - 페놀 혼합물 조직을 균질화. 200 μl의 클로로포름을 추가하고 10 분 동안 다시 품어. </li><li> 원심 분리 단계 후 (4 ° C에서 15 분 동안 18,000 XG), 위 수성 위상을 씻어 500 μl의 이소프로판올 및 원심 분리기 (4시 8 분 동안 18,000 XG 함께기음). </li><li> 500 ㎕를 에탄올로하고 원심 분리 단계 (4 ℃에서 5 분 동안 18,000 XG) 후 펠렛을 세척, 진공 농축기에서 펠렛 (30​​ ° C에서 5 분)을 건조. 그 후, 30 ㎕의 물에 펠렛을 재현 탁. </li></ol></li><li> 혈액에서의 mRNA를 추출하기 위해, 원심 분리기 500 μL의 EDTA 안정화 혈액 (300 XG에 10 분 4 ° C). <ol><li> 상기 버피 코트를 받아 백혈구를 함유 한 용액 (150 mM의 NH 4 CL 100 밀리미터의 NaHCO3, 0.1 mM의 EDTA 나트륨-의 pH 7.4) 1 ㎖에 용해시키기 희석. </li><li> RT에서 10 분 동안 배양 한 후 6 분 동안 650 XG에서 세포를 원심 분리 후 PBS로 두 번 세척 하였다. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 RNA 추출을위한 키트를 사용하여 백혈구 (백혈구)에서 mRNA의 압축을 풉니 다. </li></ol></li><li> 제조업체의 지침에 따라 임의의 헥사을 포함하여 cDNA 합성을위한 키트를 사용하여 cDNA 합성을 수행합니다. CDN에 200 NG의 mRNA를 사용하여합성. </li></ol></li><li> 정량 PCR <ol><li> 특정 mRNA의 양을 정량화하기 위해, 1 ㎕의 cDNA를, 1 μM 역방향 / 정방향 프라이머 및 제조업체의 지침 27에 따라 염료를 결합 형광 DNA를 사용합니다. 프라이머 세트의 서열은 표 1을 참조하십시오. , IL-1β의 CT 값을 측정 IL-6, IL-23, 정량적 PCR 시스템을 이용 IFNγ, TNFα 및 PPIA (펩 티딜 프 롤릴 이성화 효소). </li><li> 상대 mRNA 발현을 비교 CT (사이클 임계 값) 방법 (27)을 사용하여 결정합니다. <ol><li> (이전의 연구에서 바르트 외. 28 Schiffmann 외. 29 Schiffmann 바와 같이이를 위해, 표적 유전자의 PPIA 평균 CT 값을 뺀 PPIA의 발현 수준에 대한 표적 유전자의 CT 값을 정규화 등의 등. 30). 그 후, ΔCT 값을 정상화하는, 사용, 소위 ΔΔCT 값을 계산미처리 된 쥐의 표적 유전자의 발현 수준 EAE 마우스에서 표적 유전자의 다시 EAE 마우스에서 ΔCT 값으로부터 미처리 된 쥐의 평균 ΔCT 값을 뺀. </li><li> 표적 유전자의 상대적인 mRNA의 발현을 얻기 위해, 다음 식을 이용하여 비율을 계산한다 : 2 - ΔΔct한다. </li></ol></li></ol></li><li> 각각의 프라이머의 특이성을 테스트합니다. 2 % 아가로 오스 겔 (31)을 사용하여 증폭 된 단편의 크기를 결정한다. 단편의 크기는 표 1에 나타낸다. </li></ol>

MJP는 Xellia와 Leo Pharmaceuticals의 컨설턴트입니다.

여기에 설명 된 EAE 모델은 MS의 모델로 가장 주목을 받고 있으며, 통상적으로 MS (32)에 대한 치료 적 전략을 시험에 사용된다. 마우스 질병은 MS의 많은 임상 및 조직 학적 특징을 나타내고 신경 세포의 항원에 대한자가 면역의 유도에 의해 발생합니다. 미엘린 항원에 감작은 CNS 내로 혈액 뇌 장벽 부전함으로써 면역 세포의 침윤과 관련된다. 우리의 연구 결과는 면역 세포가 급성 단계에서 림프절에 일시적으로 증가 할 것으로 나타났다. 비장 T 세포와 B 세포는 질병의 전임상 단계에서 감소한다. 호중구 질환 의존적으로 증가하는 반면 혈액 순환에있어서, T 세포, B 세포, 수지상 세포 및 단핵구는 전임상 단계에서 일시적으로 증가한다. 마지막으로, 척수, 면역 세포의 증가를 검출 (도 2)이다. 이러한 데이터는 T 세포 및 B 세포의 역할 비장, 마이그레이션 것을 나타이들 세포를 들어, 활성화 및 증식 된 림프절 저장조. 이어서, 이들은 척수로...

다발성 경화증 (MS)과 대응하는 동물 모델 실험자가 면역 뇌척수염 (EAE)은 중추 신경계 (CNS)에서,자가 면역 신경 염증 변화를 나타낸다. 초기 활성 및 MS EAE 병변 침투 면역 세포의 존재를 특징으로한다. MS의 병인은 알려져 있지 않다, 그러나 널리 자기 반응성 T 세포에 의해 매개되는 수초의 파괴를 포함하는 것으로 간주된다. 이 자기 ​​반응성 T 세포는 순환에서 B 세포, 단핵구 및 호중구와 같은 다른 면역 세포를 끌어 염증성 사이토 카인 및 케모카인을 분비한다. 단핵 세포는 대 식세포로 분화. 자기 반응성 T 세포에 의해 분비 된 인터페론 감마 (IFNγ)는 염증성 식세포에 식세포 편광. 희소 돌기 아교 세포의 세포 사멸을 촉진 식세포 염증성 사이토 카인 방출 및 반응성 산소 종. 희소 돌기 아교 세포의 죽음은 탈수 초화로 연결됩니다. 또, B 세포는 P로 분화궁극적 미엘린의 열화 발생 lasma 세포 및 수초 대해 분리자가 항체. 수초의 손실은 신경 축삭 저하하여 MS (1)의 주요 특징을 나타내는 CNS의 병변 부위의 형성을 이끈다. 외주에서, T 세포와 B 세포는 림프절에서 활성화되고, 이들은 비장에서 증식 및 중추 신경계로의 순환을 통해 이동한다. 단핵구 및 호중구가 골수 증식 및 중추 신경계로의 순환을 통해 마이그레이션도. 혈액으로 또는 CNS에 혈액에서 골수, 비장과 림프절에서 백혈구의 혈관 외 유출은 케모카인과 케모카인 수용체에 의해 매개 백혈구와 내피 세포 사이의 분자 상호 작용 등 여러 가지 요인에 따라 달라집니다 다단계 과정이다. 다양한 유형의 세포에 의한 케모카인 생산은 면역 reactio 동안 유도 될 수있다이어서 2,3- 염증 부위로 면역 세포를 모집 종양 괴사 인자 α (TNFα), IFNγ 및 인터루킨 -6 (IL-6)와 같은 사이토 카인에 의해 N. 면역 세포는 염증성 사이트 세포 유형 및 이동 경로에 따라 그 표면에 케모카인 수용체의 서브 세트를 제시한다. 따라서, CXCR2, CCR1 및 CXCR1는 골수와 혈액 4 성숙 호중구에 표현, 그 리간드, CXCL2, CCL5 또는 CXCL6 결합되어, 각각 호중구를 활성화하고, 이후 세포의 이동을 내피에 자신의 접착을 촉진하고 조직 5-9로. CCL2 및 CCL20은 각각 CCR2 11 CCR6 (12)을 표현하는 단핵 세포와받은 Th1 / Th17 세포 (10)을 유치 할 수 있습니다. T 세포, 단핵구와 대 식세포 (13)를 포함하여 다른 세포 유형으로 표현 CCR1 및 CCR5, CCL3, CCL5 및 CCL7을 결합하여 MS (14) 중 상향 조절된다. CXCR3가 T 세포에 발현 및 CCL9, CCL10에 결합되고,CCL11 15. MS 처리 한 주요 전략은 면역 세포의 고갈 또는 CNS로 면역 세포 침윤을 방지한다. 따라서, 특정 케모카인 수용체의 봉쇄 EAE에서 조사되었다. 길항 또는 CCR1 16, CCR2 (17)의 유전 삭제, CCR7 18 CXCR2 19 길항 또는 CCR1 (20)의 유전 삭제 반면, CCR5 20 CXCR3 (21)가 병리학을 감소하지 않았다 EAE 병리을 줄일 수 있습니다. 따라서, 특정 백혈구 케모카인 수용체의 발현은 CNS에 후자의 침투를위한 중요하고 EAE 과정을 지시한다. 침투 면역 세포는 차례로, 염증 또는 신경 (22)의 분해를 촉진, TNFα, IL-6 및 IL-1β와 같은 사이토 카인을 방출하기 때문에 면역 세포의 고갈은 MS 환자의 효과적인 치료 전략이다. 또한, 자동반응 Th1 세포는 다시 TNFα, IL-1β 및 IL-23을 출시 할 대 식세포를 자극 IFNγ을 놓습니다. 이 원고 EAE 면역 세포 분포 EAE 마우스의 다양한 조직에서 사이토킨 수준 (mRNA의) 결정의 유도를 설명한다. 세포를 마지막 CNS 병변의 형성으로 이어질 염증 과정의 시간 의존성에 대한 개요를 제공하는 질환 과정에서 다른 시점에서 분리 하였다.

<table><tbody><tr><td>ABI Prism 7500 시퀀스 검출 시스템&nbsp;</td><td>Applied Biosystems, Austin, USA</td><td></td><td>정량 PCR 시스템</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma Aldrich 뮌헨, 독일</td><td>A6964</td><td>세포 분리 솔루션</td></tr><tr><td>CD3-PE-CF594</td><td>BD, 하이델베르크, 독일</td><td>562286</td><td></td></tr><tr><td>CD4-V500</td><td>BD, 하이델베르크, 독일</td><td>560782</td><td></td></tr><tr><td>CD8-eFluor650</td><td>eBioscience, 프랑크푸르트, 독일</td><td>95-0081-42</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-eFluor605</td><td>eBioscience, 프랑크푸르트, 독일</td><td>93-0112-42</td><td></td></tr><tr><td>CD11c-AlexaFluor700</td><td>BD, 하이델베르크, 독일</td><td>560583</td><td></td></tr><tr><td>CD19-APC-H7&nbsp;</td><td>BD, 독일 하이델베르크</td><td>560143</td><td></td></tr><tr><td>CD45-Vioblue&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-092-910</td><td></td></tr><tr><td>CompBeads</td><td>BD, Heidelberg, Germany</td><td>552843</td><td>보상 비드</td></tr><tr><td>Collagenase A</td><td>Sigma Aldrich Munich, Germany</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>Cytometric absolute count standard&nbsp;</td><td>Polyscience, Eppelheim, Germany</td><td>BLI-580-10</td><td></td></tr><tr><td>사이토미터 설정 및 추적 비드&nbsp;</td><td>BD, 하이델베르크, 독일</td><td>642412</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma Aldrich 뮌헨, 독일</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>EAE Kit</td><td>Hooke Laboratories, Lawrence, USA</td><td>EK2110</td><td></td></tr><tr><td>F4/80-PE-Cy7&nbsp;</td><td>BioLegend, Fell, Germany</td><td>123114</td><td></td></tr><tr><td>First Strand cDNA-Synthesis kit&nbsp;</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td><td>K1612</td><td></td></tr><tr><td>Fc 수용체-1 차단 완충액&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>플로우 사이토메트릭 절대 계수 표준</td><td>Polyscience, Eppelheim, Germany</td><td>580</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 소프트웨어 v10&nbsp;</td><td>Treestar, Ashland, 미국</td><td></td><td>유세포 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>LSRII/Fortessa&nbsp;</td><td>BD, 하이델베르크, 독일</td><td></td><td>유세포 분석기</td></tr><tr><td>Ly6G-APC-Cy7&nbsp;</td><td>BD, 독일 하이델베르크</td><td>560600</td><td></td></tr><tr><td>용해 용액&nbsp;</td><td>BD, 독일 하이델베르크</td><td>349202</td><td></td></tr><tr><td>Maxima SYBR Green&nbsp;</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td><td>K0221</td><td>형광 DNA 결합 염료&nbsp;</td></tr><tr><td>RNeasy 미니 키트&nbsp;</td><td>Qiagen, Hilden, Germany</td><td>74104</td><td>RNA 추출 키트</td></tr></tbody></table>

다양한 조직에서 면역 세포의 질병에 의존하는 유통의 마우스 및 평가에 실험자가 면역 뇌척수염의 유도

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

다발성 경화증은인지 모터 손상에 기인하는 중추 신경계 (CNS)에서 병변 형성을 특징으로하는 염증성자가 면역 질환 인 것으로 추정된다. 이 또한 CNS 병변의 형성, 모터의 손상을 특징으로하며,자가 면역 및 염증 반응에 의해 구동되기 때문에 실험적자가 면역 뇌척수염 (EAE)은 MS의 유용한 동물 모델이다. EAE 모델 중 하나는 미엘린 희소 돌기 아교 세포 단백질 생쥐 (MOG) 35-55 유래의 펩타이드로 유도된다. EAE 마우스는 진행성 질환 코스를 개발한다. 이 과정은 세 단계로 구분됩니다 전임상 단계 (하루 0-9), 질병 발병 (일 10-11) 및 급성기 (일 12-14). MS와 EAE는 CNS 침투 자기 반응성 T 세포에 의해 유발된다. 이러한 T 세포는 또한 면역 세포의 채용으로 이어질 케모카인 및 사이토 카인을 분비한다. 척수 (D)에 따라서, 면역 세포 분포세 가지 질병의 단계를 uring하는 조사 하였다. T 세포, B 세포 및 단핵 세포의 활성화 / 확산 / 축적이 시작되는 질병의 시점을 강조하기 위해, 림프절, 비장 및 혈액에서 면역 세포 분포는 또한 평가 하였다. 또한, 세 가지 질병 단계에서 여러 가지 사이토 카인 (IL-1β, IL-6, IL-23, TNFα, IFNγ)의 수준은 질환의 염증 과정에 대한 통찰력을 얻기 위해, 측정 하였다. 결론적으로, 데이터는 EAE 병리 동안 면역 세포의 기능 프로파일의 개요를 제공한다.

그림 1은이 문서에서 설명하는 다른 방법의 개략적 인 개요를 제공합니다. 1) 마우스는 MOG 35-55 항원의 주사를 수신 및 10.7 ± 0.3 일 (28) 후 초기 임상 증상을 개발한다. EAE 마우스의 대표적인 질병 코스. 그림 1과 2) 다양한 조직 (비장, 림프절, 요추 척수)에 표시되고 혈액은 전임상 단계 (2 일, 4 일 동안 서로 다른 시간 지점에서 제어 및 EAE 생쥐에서 추출 하루 6) 질환의 발병 동안 (10 일) 및 질병 (12 일, 14 일째). 3) EAE 발달을 조절하는 사이토 카인의 mRNA 발현 프로파일의 급성기, 각종의 판단 조직은 정량적 PCR을 사용하여 질병 과정에서 다른 시점에서 추출 하였다. 4) 단셀 추출 다...

이 원고는 다양한 질병 단계에서 각각 유세포 분석 및 정량적 PCR을 사용하여 림프절, 비장, 혈액 및 척수의 면역 세포 분포 및 mRNA 사이토카인 수치를 평가하는 방법과 함께 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 모델의 유도 및 채점 방법을 설명합니다.

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

실험적 자가면역성 뇌척수염(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, EAE) 모델의 전반적인 목표는 다발성 경화증 발생의 기저에 있는 잠재적인 분자 기전 연구를 용이하게 하는 것입니다. 이 방법은 면역 세포가 질병의 어느 단계에서 중추신경계로 침투하는가와 같이 다발성 경화증 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 EAE 모델이 탈수초화 및 면역 세포 침투와 같은 다발성 경화증의 주요 특징 중 상당 부분을 모사한다는 점입니다.이 기법의 함의는 다발성 경화증 치료로까지 확장되는데, 이는 이 방법으로 테스트된 약물들이 이미 해당 질환에 대해 승인을 받았기 때문입니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 연구자들은 EAE를 유도할 때 고려해야 할 철저한 조건들이 많아 어려움을 겪을 수 있습니다. 마우스는 스트레스가 없는 환경에서 유지해야 하며, pertussis toxin은 새로 조제하여 사용해야 합니다.림프절 분리와 척수 추출은 설명만으로는 배우기 어렵기 때문에 이 방법의 공식적인 시연이 매우 중요합니다. 우선 10~13주령의 암컷 마우스에 400 µg의 mycobacterium tuberculosis가 포함된 200 µL의 complete Freund's adjuvant에 유화시킨 200 µg의 myelin oligodendrocyte glycoprotein을 피하 주사하는 것으로 시작하십시오.즉시 그리고 24시간 후에, 200 µL의 PBS에 희석된 0.2 µg의 pertussis toxin을 마우스에 복강 내 주사합니다. 임상 증상의 발현을 방해할 수 있는 스트레스를 유발하지 않도록, EAE 유도 전에 마우스가 핸들링과 실험 환경에 적응하도록 하는 것이 필수적입니다. 주사 1주일 후부터 표에 설명된 대로 마우스의 임상 증상을 매일 관찰합니다.EAE로 유도된 림프절 면역 세포 집단을 평가하기 위해, 유도 후 적절한 시점에 절개 부위를 80% isopropanol로 적신 다음 고관절 부위의 피부를 조심스럽게 제거합니다. 핀셋을 사용하여 지방 조직에서 서혜 림프절을 조심스럽게 분리합니다. 그런 다음 림프절의 무게를 측정하고, 샘플을 얼음 위에 놓인 PBS에 넣습니다.척수 세포를 분석하기 위해, 동물의 등 부분을 이소프로판올로 적신 후 메스를 사용하여 척추를 따라 세로로 절개합니다. 그런 다음 피부를 제거하고 뒷다리로 이어지는 척추의 요추 부위를 절제합니다. PBS가 채워진 주사기로 척추를 세척하여 척수를 추출합니다.요수(lumbar cord)의 약 1/3을 제거한 후, 척수 조각의 무게를 측정하고 조직을 얼음 위의 PBS에 보관하십시오. 비장 면역 세포 집단을 분석하려면, 조직을 절개하여 복부 하단에 접근하십시오. 그다음, 비장을 적출하여 조직의 약 1/8을 잘라내십시오.비장 조각의 무게를 측정하고, 조직을 PBS에 담아 얼음 위에 보관합니다. 그런 다음 2 mL 주사기의 플런저를 사용하여 50 mL 튜브 위에 놓인 70 micron 메쉬 체(mesh sieve)를 통해 나머지 조직을 으깨어 여과한 후, 체를 5 mL PBS로 세척합니다. 여과된 세포를 원심 분리합니다.펠릿을 500 µL의 세포 용해 버퍼(cell lysis buffer)에 재부유시킨 후, 세포를 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. 실온에서 10분간 방치한 후, 500 µL의 PBS로 세포를 2회 세척합니다. 두 번째 세척 후, 펠릿을 0.2% BSA/PBS 100 µL에 재부유시키고, 세포에 Fc receptor one blocking buffer 2 µL를 첨가합니다.실온의 암소에서 15분간 방치한 후, 13 µL의 항체 칵테일로 세포를 라벨링하고 실온의 암소에서 15분 더 반응시킵니다. 배양 종료 후, 500 µL의 PBS로 세포를 최소 2회 세척하고, 최종 펠릿을 500 µL의 신선한 PBS에 재부유합니다. 그런 다음 세포를 얼음 위에 놓인 유세포 분석 튜브로 옮깁니다.마지막으로, 유세포 분석을 통해 샘플을 분석하기 위해, 유세포 분석 측정 직전에 절대 세포 수를 결정하기 위한 유세포 분석용 절대 수 표준물질 30 microliters를 세포에 추가합니다. 그런 다음 유세포 분석기로 샘플을 분석합니다. 이 그림에서 보여주는 바와 같이, EAE 유도의 급성기 동안 림프절 내의 모든 면역 세포 집단에서 일시적인 증가가 관찰됩니다.그러나 비장에서는 대식세포, B 세포, T 세포 및 중성구만이 침윤 증가를 보입니다. 혈액의 경우, 단핵구 집단을 제외한 모든 면역 세포 집단이 전임상 단계 동안 말초 순환에서 일시적인 증가를 보이며, 이는 질병의 급성기 동안 요수 척수에서 나타나는 유사한 질병 의존적 증가와 일치합니다. 단핵구 집단은 척수로 진입한 후 대식세포로 분화되는 것으로 추정됩니다. 여기에서는 서로 다른 세포 집단을 평가하기 위한 게이팅 전략을 보여줍니다.세포 수는 분석된 조직의 양 또는 혈액량과 관련이 있으며, 이는 절대 세포 수를 반영합니다. 림프절의 경우, 전임상 단계 동안 IL-23 mRNA 발현이 증가하는 반면, IL-6의 발현은 질환 의존적인 방식으로 증가합니다. 비장에서는 전임상 단계에 IL-6 및 IL-23 발현이 증가하지만, IL-1 beta mRNA 발현은 질환이 발병될 때까지 영향을 받지 않습니다.혈액에서는 TNF-alpha mRNA의 발현만이 질병 의존적인 방식으로 상향 조절됩니다. 요추 척수에서는 급성기에 TNF-alpha, IL-1 beta 및 interferon gamma가 유도되는 반면, IL-6는 질병의 발병기에만 상향 조절됩니다. EAE 모델 구축법을 완전히 익히면, 적절한 수행 시 10마리의 마우스에 대해 후속 세포 분리 및 효과 분석을 8시간 이내에 완료할 수 있습니다.이 절차 이후에 Western Blot 또는 ELISA와 같은 다른 방법들을 수행하여 mRNA 발현 분석 결과를 확인할 수 있습니다. 이 기술은 개발 이후, 다발성 경화증 분야의 연구자들이 중추신경계의 탈수초화 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 EAE 모델을 유도하는 방법과 재현 가능한 유세포 분석 결과를 얻기 위해 면역 세포를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.완전 프런트 보조제(complete Freund's adjuvant)를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있음을 유념하십시오. 따라서 본 절차를 수행하는 동안 마우스의 피부를 들어 올리고 주사기가 피부를 완전히 관통했는지 확인하는 등의 예방 조치를 취해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

DA 쥐에서 만성 - 원래대로 돌아가는 실험 면역 encephalomyelitis :이 비디오는 여러 경화증의 동물 모델의 유도 및 임상 채점을 보여줍니다. 전체 쥐의 척수하고 완전한 프로 인드의 도움이되는가 포함된 유제와 immunizing 쥐가 유도된 질병은, 인간의 질병을 닮은 임상 징후를 보여줍니다.

유도 및 만성 - 원래대로 돌아가는 실험 면역 Encephalomyelitis 임상 채점

이 비디오는 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질과 불활성화된 결핵균의 조합을 주입하여 마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염을 유도하는 방법을 보여줍니다. 이 모델을 통해 연구원들은 질병 메커니즘을 연구하고 치료 개입을 테스트할 수 있습니다.

마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염 유도

이 동영상은 뇌로 이동하는 자가반응성 T세포를 활성화하기 위해 미엘린 유래 펩타이드에 보조제를 주입하여 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 유발하는 방법을 보여줍니다. 백일해 독소는 혈액 뇌 장벽 투과성을 증가시켜 이러한 T 세포와 다른 면역 세포가 뇌로 들어갈 수 있도록 하기 위해 투여됩니다. 이러한 면역 세포는 탈수초화를 일으켜 신경 전달 장애와 EAE 발병을 유발합니다.

마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염의 발생

이 비디오에서는 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 사용하여 다발성 경화증의 마우스 모델을 구축합니다. 마우스에 뉴런 펩타이드와 보조제가 포함된 에멀젼을 주입하여 자가반응성 T세포를 활성화하는 면역 반응을 유발합니다. 그 다음에는 백일해 독소(PTX)를 주입하여 혈액뇌장벽 투과성을 높여 자가반응성 T세포가 뇌에 침투할 수 있도록 합니다. 이 침투는 궁극적으로 수초성 손상을 초래하는 신호 폭포를 시작하여 다발성 경화증의 탈수초성 상태를 모방합니다.

이 프로토콜은 실험적 자가면역 뇌척수염에 대한 약물 치료가 면역 세포 침투를 억제한 결과로 중추신경계 보호를 보여주는지 또는 면역 세포 침투의 맹공격 동안 신경 보호를 보여주는지 확인하는 방법을 설명합니다.

자가 면역 탈수 초화의 약리 개입에 대한 CNS 보호 대 결정 면역 시스템 억제

여기, 선물이 vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 혈관 단위의 장애를 조사 하는 프로토콜. 우리는 특별히 명과 limitans에서 혈액-뇌 장벽 침투성 및 백혈구 마이그레이션에 관련 된 gelatinase 활동을 확인 하는 방법 주소.

Vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 Neurovascular 단위의 내 피와 폐해 장벽의 장애 시각화

이 원고는 마우스에서 활성 실험자가 면역 뇌척수염(EAE)을 유도하는 프로토콜을 제시한다. 중추신경계(CNS)에서 침투된 림프구의 분리 및 특성화 방법도 림프구가 CNS 자가면역 질환의 발병에 어떻게 관여하는지 보여주기 위해 제시된다.

실험적인 자가면역 뇌척수염 중 중추신경계에서 림프구 침투의 흐름 세포 분석

본 프로토콜은 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질을 사용하는 마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염의 유도 및 임상 스코어링 시스템을 사용하여 질환 과정을 모니터링하는 것을 설명한다. 실험적 자가면역 뇌척수염 관련 증상은 마우스 대퇴골 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 분석 및 오픈 필드 테스트를 사용하여 분석되어 질병 과정을 종합적으로 평가합니다.

실험적 자가면역 뇌척수염의 유도 및 다양한 평가 지표

현재까지 동일한 마우스에서 모든 주요 중추 신경계 상주 세포 유형을 동시에 분리하기 위한 프로토콜은 충족되지 않은 수요입니다. 이 프로토콜은 신경 염증 중에 복잡한 세포 네트워크를 조사하고 동시에 필요한 마우스 수를 줄이기 위해 순진하고 실험적인 자가면역 뇌척수염 마우스에 적용할 수 있는 절차를 보여줍니다.

성인 자가면역 뇌척수염 마우스에서 주요 중추 신경계 상주 세포 유형의 동시 분리

실험적 자가면역 뇌척수염은 다발성 경화증에서 가장 널리 사용되는 쥐 모델 중 하나입니다. 현재 프로토콜에서는 남녀 모두의 C57BL/6J 마우스에 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 펩타이드를 면역하여 주로 꼬리와 팔다리의 상행 마비를 초래합니다. 여기서는 EAE 유도 및 평가 프로토콜에 대해 논의합니다.

두 성별의 다발성 경화증 모델링: MOG35-55-유도 실험적 자가면역 뇌척수염

실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 다발성 경화증(MS)의 동물 모델로, 인간 질병과 강력한 체액성 자가면역 반응을 공유합니다. 여기에서는 EAE 면역 마우스의 혈청에서 자가항체를 정량화하기 위한 간단하고 유연한 ELISA 프로토콜을 보고합니다.

Quantification of Autoreactive Antibodies in Mice on Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (실험적 자가면역 뇌척수염 시 마우스의 자가반응성 항체 정량화)

학습하세요 실험자가 면역 뇌척수염(EAE) 유도 및 면역 세포 분포 평가 방법을 통해 다발성 경화증의 분자 메커니즘을 연구하는 기법을. 유세포 분석과 정량 PCR을 활용하여 중추신경계 면역 세포 침윤 시점을 파악하고 치료 전략 개발에 기여합니다.

다양한 조직에서 면역 세포의 질병에 의존하는 유통의 마우스 및 평가에 실험자가 면역 뇌척수염의 유도

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