다양한 조직에서 면역 세포의 질병에 의존하는 유통의 마우스 및 평가에 실험자가 면역 뇌척수염의 유도

이 원고는 다양한 질병 단계에서 각각 유세포 분석 및 정량적 PCR을 사용하여 림프절, 비장, 혈액 및 척수의 면역 세포 분포 및 mRNA 사이토카인 수치를 평가하는 방법과 함께 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 모델의 유도 및 채점 방법을 설명합니다.

실험적 자가면역 뇌척수염 또는 EAE 모델의 전반적인 목표는 다발성 경화증 발병의 기저에 있는 잠재적인 분자 메커니즘에 대한 연구를 촉진하는 것입니다. 이 방법은 다발성 경화증 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 면역 세포는 질병의 어느 단계에서 중추 신경계에 침투합니까? 이 기술의 주요 장점은 EAE 모델이 탈수초 및 면역 세포 침투와 같은 다발성 경화증의 주요 특성 중 많은 부분을 모방한다는 것입니다.

이 기술의 의미는 다발성 경화증 치료로 확장되는데, 이 방법으로 시험된 약물이 이미 이 질병에 대해 승인되었기 때문입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 EAE를 유도할 때 고려해야 하는 철저한 조건이 있기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 생쥐는 스트레스가 없는 환경에서 사육해야 하며, 백일해 독소는 신선하게 준비해야 합니다.

이 방법의 공식 시연은 림프절의 분리와 척수의 추출이 설명만으로는 배우기 어렵기 때문에 중요합니다. 10-13주 된 암컷 마우스에게 200마이크로그램의 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질을 피하주사하는 것으로 시작합니다. 200 마이크로 리터의 완전한 Freund 보조제에서 유화되어 400 마이크로 그램의 결핵

즉시 그리고 24시간 후, 200마이크로리터의 PBS에 0.2마이크로그램의 백일해 독소를 마우스에게 복강내 주사합니다. 생쥐가 임상 증상의 발병을 예방할 수 있는 스트레스를 유발하는 방향으로 EAE 유도 전에 취급 및 실험 환경에 적응하는 것이 중요합니다. 주사 일주일 후, 표에 설명된 대로 임상 증상이 있는지 매일 쥐를 검사합니다.

EAE 유도 림프절 면역 세포 집단을 평가하기 위해 유도 후 적절한 시점에 절개 부위에 80% 이소프로판올을 적시고 엉덩이 부위의 피부를 조심스럽게 제거합니다. 겸자를 사용하여 지방 조직에서 서혜부 림프절을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 노드의 무게를 측정하고 샘플을 얼음 위의 PBS에 놓습니다.

척수 세포를 분석하려면 이소프로판올로 동물의 등을 적시고 메스를 사용하여 척추를 세로로 자릅니다. 그런 다음 피부를 제거하고 척추의 요추 부분을 절개하여 뒷다리에 신경을 공급합니다. PBS가 채워진 주사기로 척추를 세척하여 척수를 추출합니다.

요추의 약 1/3을 제거한 후 척추 조각의 무게를 측정하고 조직을 얼음 위의 PBS에 보관합니다. 비장 면역 세포 집단을 분석하려면 조직을 열어 복부 하부에 접근합니다. 다음으로 비장을 제거하고 조직의 약 1/8을 잘라냅니다.

비장 조각의 무게를 측정하고 조직을 얼음 위의 PBS에 보관하십시오. 그런 다음 2mL 주사기의 플런저를 사용하여 50ml 튜브의 70미크론 메쉬 체를 통해 나머지 조직을 침지한 다음 스트레이너를 5ml PBS 세척합니다. 여과된 세포를 원심분리합니다.

펠릿을 500마이크로리터의 세포 용해 완충액에 재현탁시키고 세포를 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 실온에서 10분 후 PBS 500마이크로리터에서 세포를 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후, PBS에서 0.2%BSA 100마이크로리터에 펠릿을 재현탁하고 2마이크로리터의 Fc 수용체 1 차단 완충액을 세포에 추가합니다.

실온에서 어둠 속에서 15분 동안 방영한 후, 실온에서 15분 동안 15분 동안 항체 칵테일 13마이크로리터로 세포에 라벨을 붙입니다. 배양이 끝나면 500마이크로리터의 PBS에서 세포를 최소 2회 세척하고 500마이크로리터의 새로운 PBS에 최종 펠릿을 재현탁합니다. 그런 다음 세포를 얼음 위의 유세포 분석 튜브로 옮깁니다.

마지막으로, 유세포 분석으로 샘플을 분석하기 위해 유세포 분석 측정 직전에 절대 세포 수를 결정하기 위해 30 마이크로리터의 유세포 분석 절대 계수 표준을 세포에 추가합니다. 그런 다음 유세포 분석기에서 샘플을 분석합니다. 이 그림에서 알 수 있듯이, 림프절 내의 모든 면역 세포 집단의 일시적인 증가는 EAE 유도의 급성기 동안 관찰됩니다.

그러나 비장에서는 대식세포, B세포, T세포, 호중구만이 침투가 증가한 것으로 나타났습니다. 혈액에서 모든 면역 세포 집단은 전임상 단계에서 말초 순환의 일시적인 증가를 보여주는데, 이는 척수에 들어간 후 대식세포로 분화하는 것으로 추정되는 단핵구 집단을 제외하고, 질병의 급성기 동안 요추 척수의 유사한 질병 의존적 증가에 해당합니다. 여기에서는 서로 다른 세포 집단의 평가를 위한 게이팅 전략이 표시됩니다.

세포의 수는 분석된 조직의 양 또는 혈액량과 관련이 있으며, 이는 절대 세포 수를 반영합니다. 림프절에서 IL-23 mRNA 발현은 전임상 단계에서 증가하는 반면, IL-6의 발현은 질병 의존적 방식으로 증가합니다. 비장에서 IL-6 및 IL-23 발현은 전임상 단계에서 증가하는 반면, IL-1 베타 mRNA 발현은 질병이 발병할 때까지 영향을 받지 않습니다.

혈액에서는 TNF-알파 mRNA의 발현만 상향 조절되고 질병 의존적 방식으로 이루어집니다. 요추에서는 TNF-알파, IL-1 베타 및 인터페론 감마가 급성기에 유도되는 반면, IL-6는 질병의 발병기에만 상향 조절됩니다. 일단 마스터되면 EAE 모델, 후속 세포 분리 및 효과 분석이 적절하게 수행될 경우 10마리의 마우스에 대해 8시간 내에 완료할 수 있습니다.

이 절차에 따라 Western Blot 또는 ELISA와 같은 다른 방법을 수행하여 mRNA 발현 분석 결과를 확인할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 다발성 경화증 분야의 연구자들이 중추 신경계의 탈수초 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 EAE 모델을 유도하는 방법과 면역 세포를 분리하여 재현 가능한 유세포 분석 결과를 얻는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

완전한 Freund 보조제로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있음을 잊지 말고, 이 절차를 수행하는 동안 마우스의 피부를 들어 올리고 주사기로 피부가 완전히 침투하도록 하는 것과 같은 예방 조치를 추가해야 합니다.