개발 및 특성화의 체외 미세 혈관 네트워크 및 내피의 정량적 측정 [칼슘 ^{2 +}] _전 및 질소 산화물 생산

이 절차의 전반적인 목표는 내피 세포가 생리학적으로 관련된 전단 흐름에서 성장하고 칼슘 및 산화질소 생산의 작용제에 의한 변화를 측정할 수 있는 미세유체 장치를 개발하는 것입니다. 이 메시지는 체외 미세혈관 모델을 검증하고 in vivo 연구와 in vitro 연구 간의 격차를 해소함으로써 미세혈관 연구의 미래를 발전시키는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다양한 혈관 구조를 모방하는 마이크로 채널의 다재다능한 설계와 원래 배양에 대한 조건부 정적보다 생체 내(in vivo)에 더 가까운 세포 배양 환경을 개선한다는 것입니다.

절차를 시연하는 사람은 내 연구실의 Sulei와 Xiang입니다. 시작하기 전에 표준 포토리소그래피를 사용하여 마스터 몰드와 소프트 리소그래피를 만들어 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 PDMS 마이크로채널 소자를 제작합니다. 마이크로채널 장치를 준비하려면 먼저 얇은 PDMS 조각으로 입구와 출구를 덮고 젖은 티슈로 페트리 접시 안에 장치를 놓습니다.

그런 다음 파라필름으로 접시를 감싸고 최소 3시간 동안 자외선 아래에서 장치를 살균합니다. 다음 단계는 피브로넥틴을 바르는 것입니다. 먼저 30-50마이크로리터의 PBS를 주입구에 떨어뜨립니다.

장치를 헹구기 위해 배출구에 진공 청소기를 만드십시오. 다음으로, 주입구에 밀리리터당 100마이크로그램의 피브로넥틴을 떨어뜨립니다. 피브로넥틴 용액을 로드하기 위해 배출구에 진공을 생성합니다.

다음으로 입구와 출구를 덮습니다. 파라필름으로 접시를 다시 싸고 섭씨 4도에서 밤새 장치를 배양합니다. 다음 날 PBS로 장치를 수동으로 세 번 헹굽니다.

그런 다음 30-50마이크로리터의 세포 배양 배지를 로드하고 섭씨 37도의 인큐베이터에서 최소 15분 동안 장치를 예열합니다. 먼저 HUVEC을 8% 덱스트란과 함께 밀리리터당 2-400만 개의 세포로 HUVEC 배양 배지에 혼합합니다. 덱스트런은 점도를 증가시켜 세포 파종을 개선하는 데 필요합니다.

다음으로, 10-20 마이크로 리터의 셀을 입구에 놓고 중력을 사용하거나 출구에서 유리 파스퇴르 피펫의 모세관 작용을 사용하여 주입합니다. 그런 다음 15-20분 동안 장치를 배양합니다. 그런 다음 현미경으로 파종 상태를 확인합니다.

필요한 경우 원하는 셀 밀도를 얻기 위해 더 많은 셀을 로드합니다. 충분한 세포가 로드되면 정상적인 따뜻한 세포 배양 배지로 장치를 부드럽게 헹구어 Dextran을 제거합니다. 그런 다음 6시간 동안 매체 관류 없이 장치를 배양합니다.

다음으로, 장기 관류를 위해 튜빙 연결을 설정합니다. 장치를 페트리 접시에 테이프로 붙인 다음 바늘로 주사기에 입구 튜브를 연결합니다. 장치의 입구와 출구 모두에 튜브를 삽입합니다.

배출 튜브를 폐기물 수집기에 연결합니다. 이제 접시와 쓰레기통을 인큐베이터에 넣으십시오. 긴 주입 튜브가 있는 주사기를 인큐베이터 도어를 통과하는 외부 관류 펌프에 연결합니다.

그런 다음 실험 설계에 따라 관류 속도를 설정합니다. 잘 제어된 관류를 통해 미세혈관 네트워크의 배양액을 최대 2주까지 유지할 수 있습니다. 따라서 다양한 생리학적 및 병리학적 상태에 대한 세포 및 혈류역학적 환경을 모방하는 장기 연구로 확장될 수 있습니다.

VE-cadherin 라벨링과 같은 면역 염색을 시작하려면 먼저 섭씨 4도에서 30분 동안 2%의 파라포름알데히드를 관류하여 세포를 고정합니다. 항체로 차단, 투과화 및 염색을 위한 일련의 관류 후 세포가 이미지화될 때까지 장치를 섭씨 4도로 유지합니다. 세포의 칼슘 농도를 이미지화하려면 섭씨 37도에서 15분 동안 Ringer 용액에 10밀리그램의 알부민을 장치에 관류합니다.

다음으로, 섭씨 37도에서 40분 동안 5마이크로몰 Fluo-4 AM으로 장치를 관류합니다. 그런 다음 알부민 링거로 내강에 결합된 Fluo-4 AM을 섭씨 37도에서 15분 동안 세척합니다. 다음으로, Fluo-4 AM으로 세포 간 칼슘 수준 이미징을 위한 컨포칼 시스템을 시작합니다. Fluo-4가 적재된 마이크로혈관의 이미지를 획득합니다.

10분 동안 기준 이미지를 수집합니다. 그런 다음 10마이크로몰 ATP로 장치를 지속적으로 관류하고 20분 동안 형광 강도의 변화를 기록합니다. 세포에서 산화질소 생성을 이미지화하려면 섭씨 37도에서 15분 동안 알부민 링거를 장치에 관류합니다.

그런 다음 섭씨 37도에서 약 35-40분 동안 5마이크로몰 DAF-2 DA로 세포를 관류합니다. 다음으로, ATP 유도 산화질소 생성을 측정하기 위해 형광 이미징 시스템을 설정합니다. 기준선을 5분 동안 기록한 다음 10마이크로몰 ATP로 장치를 관류하고 1분 간격으로 30분 동안 이미지를 수집합니다.

세포 산화질소 측정의 경우, 강도 프로파일에 대한 분리 어댑터는 산화질소 농도가 아니라 시간에 따른 누적 산화질소 생산을 나타낸다는 것을 이해하는 것이 중요합니다. 개별 세포 수준에서 수집된 이미지에서 관심 영역을 수동으로 선택합니다. 각 ROI는 한 개인의 세포 면적을 포함하며, 이는 floresense 윤곽선으로 표시할 수 있습니다.

ATP에 의해 유도된 내피 칼슘 및 산화질소의 변화를 정량화합니다. Fluo-4의 floresense 강도의 변화를 계산하여 조직 배경을 줄입니다. 시간 경과에 따른 DAF-2의 플로레센스 강도의 첫 번째 차등 변환을 수행하여 아산화질소 생산 속도를 정량화합니다.

장치의 마이크로 채널 패턴에는 3단계 분기 네트워크가 있습니다. 분당 0.35마이크로리터의 유속에서 전단 응력 분포를 추정하기 위해 3D 수치 시뮬레이션을 수행했습니다. 내피 세포는 설명된 대로 네트워크에 파종되고 있었습니다.

그런 다음 F-액틴과 핵을 라벨링했습니다. 마찬가지로, VE-cadherin도 염색되었습니다. 결과는 온전한 정맥에서 VE-cadherin 발현과 유사했습니다.

다음으로, ATP에 의한 세포 내 칼슘 및 산화질소 생산의 증가를 조사하였다. 칼슘 수치는 프로토콜 섹션에 설명된 대로 Fluo-4 AM을 사용하여 검사했습니다. 산화질소 생산은 프로토콜 섹션에 설명된 대로 DAF-2 DA를 사용하여 모니터링되었습니다.

결과는 개별적으로 관류된 온전한 정맥으로 유도된 결과와 유사했습니다. 고급은 생물학적 조건과 동적 유체 환경에서 쉽고 엄격하게 제어되었으며, 이는 기존의 마이크로 스킬 기술로는 불가능했을 것입니다. 이 비디오를 시청한 후에는 장치를 제조하고 칼슘 및 산화질소 측정을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 기술이 연구자들에게 근본적인 작용제 유도를 조사할 뿐만 아니라 생물 의학 연구를 위한 더 광범위한 응용 분야를 열 수 있는 길을 열었습니다.