개발 및 특성화의

이 절차의 전반적인 목표는 내피세포가 생리학적으로 유의미한 전단 흐름 하에서 성장할 수 있도록 하는 미세유체 장치를 개발하고, 작용제에 의해 유도된 칼슘 및 산화질소 생성의 변화를 측정하는 것입니다. 이 방법은 인비트로(in vitro) 미세혈관 모델을 검증하고 인비보(in vivo) 연구와 인비트로 연구 사이의 간극을 메움으로써 미세혈관 연구의 미래를 발전시키는 데 기여할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다양한 혈관계 구조를 모방할 수 있는 미세채널의 다각적인 설계가 가능하다는 점이며, 기존의 정적인 배양 조건보다 인비보 환경에 더 가까운 세포 배양 환경을 개선한다는 점입니다.

시연은 저희 실험실의 Sulei와 Xiang 두 사람이 진행하겠습니다. 시작하기 전에, 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 표준 포토리소그래피(photolithography)를 사용하여 마스터 몰드를 제작하고 소프트 리소그래피(soft lithography)를 통해 PDMS 미세유체 채널 장치를 제작하십시오. 미세유체 채널 장치를 준비하려면, 먼저 입구와 출구를 얇은 PDMS 조각으로 덮고 젖은 티슈가 들어 있는 페트리 접시 안에 장치를 넣으십시오.

그런 다음, 디쉬를 Parafilm으로 감싸고 UV 램프 아래에서 장치를 최소 3시간 동안 멸균합니다. 다음 단계는 fibronectin을 도포하는 것입니다. 먼저, 입구에 30~50 µL의 PBS 한 방울을 떨어뜨립니다.

출구 쪽에 진공을 형성하여 장치를 세척합니다. 다음으로, 입구 쪽에 100 µg/mL fibronectin 한 방울을 떨어뜨립니다. 출구 쪽에 진공을 형성하여 fibronectin 용액을 로딩합니다.

다음으로, 입구와 출구를 덮습니다. 배양 접시를 Parafilm으로 다시 감싸고 장치를 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, PBS로 장치를 세 번 수동으로 헹굽니다.

그런 다음, 30에서 50 µL의 세포 배양 배지를 넣고 37 °C의 인큐베이터에서 장치를 최소 15분 동안 예열합니다. 8% Dextran이 포함된 HUVEC 배양 배지에 HUVEC을 mL당 200만에서 400만 개의 세포 농도로 혼합하여 시작합니다. Dextran은 점도를 높여 세포 시딩 효율을 향상시키기 위해 필요합니다.

다음으로, 유입구 위에 10~20 µL의 세포를 올리고 중력을 이용하거나 출구 쪽에서 유리 파스퇴르 피펫의 모세관 현상을 이용하여 세포를 주입합니다. 그 다음, 장치를 15~20분 동안 배양합니다. 이후 현미경으로 세포 접종 상태를 확인합니다.

필요한 경우, 원하는 세포 밀도를 달성하기 위해 더 많은 세포를 로딩하십시오. 충분한 세포가 로딩되면, 일반적인 따뜻한 세포 배양 배지로 장치를 부드럽게 헹구어 Dextran을 제거합니다. 그 후, 배지 관류 없이 6시간 동안 장치를 배양하십시오.

다음으로, 장기 관류를 위한 튜빙 연결을 설정합니다. 장치를 페트리 접시에 테이프로 고정한 후, 입구 튜빙을 바늘이 달린 주사기에 연결합니다. 장치의 입구와 출구 양쪽에 튜빙을 삽입합니다.

배출 튜브를 폐액 수집기에 연결합니다. 이제 디쉬와 폐액 용기를 인큐베이터에 넣습니다. 긴 유입 튜브가 연결된 시린지를 인큐베이터 문을 통과하여 외부 퍼퓨전 펌프에 연결합니다.

그 다음, 실험 설계에 따라 관류 속도를 설정합니다. 관류가 잘 제어되면 미세혈관 네트워크 내의 배양 상태를 최대 2주까지 유지할 수 있습니다. 따라서 이를 통해 다양한 생리적 및 병리적 조건에서의 세포 및 혈역학적 환경을 모사하는 장기 연구로 확장할 수 있습니다.

VE-cadherin 라벨링과 같은 면역 염색을 시작하려면, 먼저 4°C에서 2% paraformaldehyde로 30분 동안 관류하여 세포를 고정합니다. 블로킹, 투과화 및 항체 염색을 위한 일련의 관류 과정을 거친 후, 세포 이미징 전까지 장치를 4°C로 유지합니다. 세포 내 칼슘 농도를 이미징하려면, 37°C에서 Ringer solution에 10 mg/mL albumin을 혼합하여 15분 동안 장치에 관류합니다.

다음으로, 37°C에서 5 µM Fluo-4 AM으로 장치를 40분 동안 관류합니다. 그 후, 37°C에서 albumin Ringers로 루멘에 결합된 Fluo-4 AM을 15분 동안 세척합니다. 이어서, Fluo-4 AM을 이용한 세포 간 칼슘 농도 이미징을 위해 공초점 시스템을 가동합니다. Fluo-4가 로딩된 미세혈관의 이미지를 획득합니다.

10분 동안 베이스라인 이미지를 수집합니다. 그런 다음, 10 µM ATP를 장치에 지속적으로 관류하며 20분 동안 형광 강도의 변화를 기록합니다. 세포 내 산화질소 생성을 이미지화하려면, 37 °C에서 albumin Ringers로 장치를 15분 동안 관류합니다.

그 다음, 37 °C에서 약 35~40분 동안 5 µM DAF-2 DA를 사용하여 세포를 관류합니다. 이어서, ATP로 유도된 일산화질소 생성을 측정하기 위해 형광 이미징 시스템을 설정합니다. 5분 동안 기저 상태를 기록한 후, 장치에 10 µM ATP를 관류하고 1분 간격으로 30분 동안 이미지를 수집합니다.

세포 내 산화질소 측정 시, 강도 프로파일(intensity profile)의 분리 어댑터는 산화질소 농도가 아니라 시간에 따른 누적 산화질소 생성량을 나타낸다는 점을 이해하는 것이 중요합니다. 수집된 이미지에서 개별 세포 수준의 관심 영역(ROI)을 수동으로 선택하십시오. 각 ROI는 형광 외곽선으로 표시될 수 있는 개별 세포 하나의 영역을 포함합니다.

ATP로 유도된 내피 세포의 칼슘 및 산화질소 변화를 정량화합니다. 조직 배경 값을 제외한 Fluo-4의 형광 강도 변화를 계산하여 측정합니다. 시간 경과에 따른 DAF-2의 형광 강도를 1차 미분 변환하여 산화질소 생성률을 정량화합니다.

장치 내의 마이크로채널 패턴은 3단계 분지 네트워크 구조를 가지고 있습니다. 0.35 µL/min의 유량 조건에서 전단 응력 분포를 추정하기 위해 3D 수치 시뮬레이션을 수행하였습니다. 내피세포를 설명된 방법대로 네트워크 내에 시딩하였습니다.

그 후, F-actin과 핵을 염색하였다. 마찬가지로 VE-cadherin 또한 염색하였다. 그 결과는 온전한 세정맥에서의 VE-cadherin 발현과 유사하였다.

다음으로, ATP에 의해 유도된 세포 내 칼슘 증가와 일산화질소 생성을 조사하였습니다. 칼슘 수치는 프로토콜 섹션에 설명된 대로 Fluo-4 AM을 사용하여 측정하였습니다. 일산화질소 생성은 프로토콜 섹션에 설명된 대로 DAF-2 DA를 사용하여 모니터링하였습니다.

결과는 개별적으로 관류된 온전한 세정맥을 통해 얻은 결과와 유사했습니다. 이 고급 기술은 생물학적 조건 및 동적 유체 환경에서 용이하게 수행되었으며 엄격하게 제어되었는데, 이는 기존의 미세수술 기술로는 불가능했을 것입니다. 이 영상을 시청하고 나면 장치를 제작하고 칼슘 및 산화질소 측정을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

이 기술은 연구자들이 효능제에 의해 유도되는 기전을 조사할 수 있는 길을 열어주었을 뿐만 아니라, 생의학 연구를 위한 더 광범위한 응용 가능성을 제시하였습니다.