Name: 개발 및 특성화의 체외 미세 혈관 네트워크 및 내피의 정량적 측정 칼슘 2 + 전 및 질소 산화물 생산 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 배우세요 미세유체 장치를 이용한 HUVEC 배양 및 ATP 유도 칼슘 신호와 산화질소 생성 정량화 방법. 생리학적 전단류 조건에서 내피 세포 반응을 실시간 측정하여 미세혈관 연구의 격차를 해소합니다.

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이 작품은 국립 심장, 폐, 혈액 연구소에 의해 지원되었다 HL56237, 당뇨병과 소화기의 국립 연구소 및 신장 질환 연구소 DK97391-03, 국립 과학 재단 (NSF-1227359 및 EPS-1003907)를 부여합니다.

1. 미세 유체 소자의 제작 <ol><li> SU-8 (50) 마스터 금형의 표준 포토 리소그래피 제작 <ol><li> 스핀 코팅 전에 실리콘 웨이퍼를 청소합니다. 15 분 동안 이소 프로필 알콜 (IPA) 다음에 15 분 동안 아세톤 노출 된 2 인치 실리콘 웨이퍼를 헹군다. 1 시간 동안 150 ℃에서 핫 플레이트 상에 배치하여, 웨이퍼 탈수. 탈수 후, 실온에서 웨이퍼를 냉각. </li><li> 스핀 코트 SU-8 포토 레지스트와 실리콘 웨이퍼. 웨이퍼에 2 ㎖의 SU-8 포토 레지스트를 추가합니다. 30 초 동안 300 rpm으로 / 초 가속 1,000 rpm으로 다음 10 초 동안 100 rpm으로 / 초 가속에서 500 rpm으로,에 웨이퍼를 램프. (보충 비디오 1 참조) </li><li> 프리 베이킹을 30 분 동안 95 ° C에서 10 분 후, 소프트 베이크와 65 ℃에서 핫 플레이트상에서 웨이퍼. </li><li> 스핀 코팅 된 포토 레지스트에 영화 마스크에서 디자인 패턴을 변환하는 자외선 노출을 사용합니다. 막을 마스크로 얇은 투명 필름에 패턴을 인쇄. 의 상부에 마스크 필름을 놓고포토 레지스트 코팅 - 스핀과 300 엠제이 / cm 2의 용량과 UV에 노출. (보충 비디오 2 참조) 참고 :이 프로토콜에서, 마이크로 채널 네트워크 패턴 (159 μm의 폭 어머니 채널 사 100 ㎛ 폭 딸 채널로 분기) CAD 소프트웨어로 설계되어 있습니다. 필름상의 패턴 명확한 필드로 나타내고, 필름의 나머지 부분은 검은 색 잉크에 의해 덮여있다. SU-8 네가티브 포토 레지스트이므로, UV에 노출되는 포토 레지스트의 부분 가교 금형 개발 (단계 1.1.6) 중에 용매에 용해 될 것이다. 현상 후,이 불용 설계된 네트워크 패턴을 복제하고 마스터 몰드 역할을한다. </li><li> 포스트 베이크 1 분, 10 분 후, 95 ° C, 65 ° C에서 핫 플레이트상에서 노광 된 웨이퍼. </li><li> 마스터 금형을 개발합니다. 용매로 사용 SU-8 개발자는 않은 가교 포토 레지스트를 제거합니다. 3 분 동안 SU-8 개발자의 웨이퍼를 담그고 IPA 씻어1 분. </li><li> IPA 린스 후 더 흰색 줄무늬 형성 (비 경화 된 포토 레지스트의 잔류 물)가 없어 질 때까지이 개발주기를 2 ~ 3 번 반복합니다. 부드럽게 질소 가스로 웨이퍼를 건조하고, 현미경으로 패턴의 작은 특징을 검토한다. 필요한 경우 추가 개발주기를 반복합니다. </li><li> 하드 15 분간 150 ℃에서 핫 플레이트 상에 웨이퍼 굽는다. </li></ol></li><li> 소프트 리소그래피 <ol><li> 수동으로 중량의 두 부분으로 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 엘라스토머 (기본 및 경화제)을 섞는다. 10의 비율 : 1. </li><li> 드 가스 15 분 동안 집 진공 연결 데시 케이 터와 PDMS 혼합물. 포토 레지스트 마스터 주형에 PDMS 용액 캐스트. PDMS의 두께는 상기 입구 / 출구 관의 안정된지지를 제공하는 이상 3mm 할 필요가있다. 탈 가스를 15 분 동안 다시 PDMS, 필요하다면 질소 가스 잔류 기포를 제거한다. 3 시간 동안 65 ° C의 오븐에서 주조 된 PDMS 큐어. </li><li> 의 표면을 청소스카치 테이프와 플라즈마 세정기 (30 초 플라즈마 처리)을 유리 커버 슬립. 30 초 동안 500 rpm / sec 가속도에서 4000 rpm으로 램핑 유리 커버 슬립에 스핀 코트 미 경화 PDMS (0.5 mL)을 첨가 하였다. 적어도 30 분 동안 65 ° C의 오븐에서 PDMS 스핀 코팅 된 커버 슬립을 치료. </li><li> 잘라 내기 및 마스터 몰드로부터 경화 된 PDMS를 놓습니다. 이어서 입구 및 머더 채널의 선단부에 직경 1mm의 구멍을 펀치와 출구를 생성한다. </li><li> PDMS의 스핀 - 코팅 유리 커버 슬립에 접합 장치. PDMS의 표면을 산화 1 분 동안 플라즈마 클리너 커버 슬립. 산소 플라즈마 처리 후, 접착면에 탈 이온수 (DI 수)의 액체 방울을 배치하고, 함께 두 부분으로 놓는다. 영구적 결합을 달성하기 위해 30 분 동안 65 ° C의 오븐에서 장치를 굽는다. </li></ol></li></ol><img alt="보충 비디오 1" src="/files/ftp_upload/54014/54014movie1.jpg"/&gt; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54014/Supplemental_video_1.mp4" target="_blank">보충 비디오 1 (오른쪽 다운로드 클릭).</a> <img alt="보충 비디오 2" src="/files/ftp_upload/54014/54014movie2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54014/Supplemental_video_2.mp4" target="_blank">보충 비디오 2 (오른쪽 다운로드 클릭).</a> 2. 내피 세포 시드와 문화 <ol><li> 장치 살균 및 피브로넥틴 코팅 <ol><li> 산화에서 입구 / 출구 주위 PDMS 표면의 소수성을 유지. 입구 주위 PDMS 표면을 덮어 산화를 방지하기 위해 스카치 테이프의 작은 줄무늬 출구. 이 절차는 충전 공정 (2.1.3) 동안 장치의 상면 위에 모두 확산되는 DI 워터를 방지 할 수있다. </li><li> 산소 플라즈마 FO하여 PDMS 소자 취급R 5 분 이와 같이, 표면이 소수성으로 변화 마이크로 채널을 통한 유체 유동을 용이하게하고, 충전 과정 (2.1.3)에서 기포 트랩을 방지 할 수있다. </li><li> 입구에서 DI 워터와 장치를 채우기 위해 부착 된 바늘이나 피펫과 주사기를 사용합니다. 출구에서 축적 DI 물 (30 ~ 50 μL)의 비말이 될 때까지 충전을 계속한다. 마이크로 안에 갇혀 거품이 있는지 확인하기 위해 현미경 장치를 검사합니다. 종이 티슈로 입구와 출구에 과도한 물 방울을 제거합니다. </li><li> 층류 바이오 안전성 후드에서 3 시간의 최소 UV와 배양 접시에서 장치를 소독. , 증발을 방지 PDMS의 얇은 조각으로 입구 / 출구를 커버하기 위해, 접시 내부에 젖은 종이 티슈를 넣고, 파라 필름과 접시를 포장. </li><li> 코트 피브로넥틴 장치. (냉장 / ml의 피브로넥틴을 밤새 100 μg의 코트 한 후, 인산 완충 식염수 (PBS)로 먼저 장치 린스4 ° C). 입구에서 용액의 방울을 놓은 다음 집 진공, 바늘 또는 피펫 주사기와 출구에서 부압을 만듭니다. </li><li> 세포 배양 미디어와 디바이스를 입력합니다. 세포 배양 배지를로드하기 전에 세 번 수동 PBS로 씻어 장치. 37 ° C에서 항온 장치를 워밍업. </li></ol></li><li> 되는 EC 시드 및 장기 관류 주 : 종래의 정적 2D EC 배양과 비교하여, 연속 관류와 시험 관내 미세 혈관 네트워크 모델이 가까운 생체 조건 세포 배양 환경을 만들었다. 이 프로토콜에서 입증 시험 관내 미세 혈관 네트워크는 2 주까지 유지 될 수있다. 잘 제어 관류는 지속적으로 영양분을 보충 폐기물을 제거하고 과도한 합류은 EC 단일 층의 방지 할 수 있습니다. 따라서, 다른 physiologica하에 세포 및 혈역학 적 환경을 흉내 장기적인 연구로 확장 될 수있다리터와 병리 적 상태. <ol><li> 8 % 덱스 트란 (몰 중량 70,000)와 HUVEC 배양 배지에서 차 HUVECs를 (MCDB 131)를 섞는다. 덱스 트란은 로딩 매체의 점도를 증가시키고, 더 나은 셀 시딩 결과를 달성하기 위해 사용된다. 권장 세포 밀도는 약 2-4 × 106 세포 / ml이다. </li><li> 장치에 세포를 시드. 입구를 통해 세포의 10 ~ 20 μl의 방울을 배치합니다. 어느 장치를 틸팅하거나, 모세관 작용이 출구 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 완만 한 흐름을 소개한다. 성공적인 셀 로딩 키는 유속을 최소 채널 내의 1mm 미만 / 초를 제어하는​​ 것이다. </li><li> 셀 시드를 확인합니다. 초기 접종 후, 현미경으로 시딩 상태를 확인하기 전에 15 ~ 20 분 (37 ℃, 5 % CO 2의 가습 된 분위기)에 장치를 배양한다. 필요한 경우, 원하는 세포 밀도를 달성하기 위해 추가의 셀 로딩을 수행한다. </li><li> 부드럽게 (37 세포 배양 배지로 장치 린스° C)는 덱스 트란를 제거합니다. 배양 (37 ℃, 5 % CO 2) 배양기에서 처음 6 시간 동안 흐름이 없을 장치. </li><li> 장기 관류 용 튜브 연결을 설정합니다. 이동을 방지하기 위해 배양 접시에 장치를 테이프입니다. 입구와 출구 튜브 삽입에 대한 페트리 접시의 뚜껑에 작은 구멍을 만듭니다. 세포 배양 미디어 관류 용 바늘과 주사기에 흡입 튜브를 연결합니다. 폐기물 수집에 출구 튜브를 연결합니다. 참고 : 장소 장치와 세포 배양 인큐베이터에서 쓰레기 수집기, 인큐베이터 외부의 관류 펌프를 배치하면서 긴 입구 튜브에 의해 장치에 연결합니다. 재관류 속도는 실험 설계에 의해 결정된다. 본 장치에서, 0.35 μL / 분의 재관류 속도, 1-2 다인 / ㎝ (2) 사이의 전단 응력 범위를 사용한다. 이 관류 조건 하에서, HUVECs를이 3-4 일 합류에 도달합니다. </li></ol></li></ol> 3. Immunofluorescent 염색 <ol><li> 30 15 분 동안 실온에서 PBS 1X 세척 한 다음 4 ℃에서 분, 30 분 동안 차단하고, 1 % BSA 2 % 파라 포름 알데히드의 관류 장치에 고정되는 EC. 세포 배양에 사용되는 것과 같은 재관류 속도를 사용한다. </li><li> 0.1 % 트리톤 X-100 항체 염색을 위해 고정되는 EC Permeabilize 하시려면. 라벨에 5-7 분 동안 트리톤과 장치를 관류는-VE cadherin의, 및 레이블 F - 굴지 3 분. </li><li> 장치에 항체를 넣습니다. 이전의 해결책을 씻어 15 분 동안 1X PBS로 관류 장치. 2 μg의 수동 / ㎖ (총 부피가 20 내지 50 μL 임)의 농도로 장치에 VE-cadherin의 (항 염소)에 대한 일차 항체로드. 4 ℃의 냉장고에 하룻밤 보관 장치. 45-60 분 동안 7 μg의 / ㎖의 농도로 시린지 펌프에 의해 이차 항체 (당나귀 항 - 염소) 관류. </li><li> EC F를-굴지의 레이블 팔로이 딘과 함께. 1X PBS에 FO를 가진 장치를 관류수동으로 7-10 분 동안 팔로이 딘 (10 μg의 / ㎖)를로드하기 전에 R 15 분. </li><li> 라벨 EC 핵 (자료 목록 참조). </li><li> 1X PBS와 장치를 씻어, 및 이미징까지 4 ° C에서 그것을 유지한다. </li></ol> 내피 4. 형광 이미징 [칼슘 2 +] 난 <ol><li> 알부민 장치 (10 ㎎ / ㎖), 37 ℃에서 15 분 동안 -Ringer의 용액을 관류. 즉, 세포 배양을 위해 사용 된 동일한 관류 속도를 사용한다. 알부민 링거액 모든 성분의 농도는 자재 목록에 설명되어있다. </li><li> EC는 [칼슘 2 +] 내가 FLUO-오전 4시와 이미징 공 촛점 시스템을 설정합니다. 칼슘 이미징 공 초점 현미경 시스템을 사용합니다. 여기에 대한 아르곤 레이저 (488 nm의)를 사용하고 510-530 나노 미터로 방출 대역을 설정합니다. 512 X 512 스캔 형식에 : (0.95, 침수 NA를)은 25X의 목적으로 이미지를 수집합니다. 난 각 스택 2 ㎛의 Z-공정과 주사 간격을 사용20 초의 마법사. </li><li> 알부민 링거액과 함께 루멘 FLUO-4 오전 세척 한 후, 37 ℃에서 40 분 동안 FLUO-오전 4시 (5 μM)와 장치를 관류. </li><li> FLUO-4로드 미세 혈관의 이미지를 획득. 10 분 동안 기본 이미지를 수집합니다. ATP (10 μM)로 장치를 관류하고 20 분 동안 형광 강도 (FI)의 변화를 기록한다. </li></ol> 산화 질소 생산의 5 형광 이미징 <ol><li> 15 분 동안 알부민 링거 용액으로 관류 장치. 세포 배양에 사용되는 것과 같은 재관류 속도를 사용한다. </li><li> ATP 유도 된 산화 질소 생성을 측정하기 위해 형광 이미징 시스템을 설정한다. 12 비트 디지털 CCD 카메라와 산화 질소 측정을위한 컴퓨터 제어 셔터가 장착 된 현미경을 사용한다. 광원으로 75 W의 크세논 램프를 사용합니다. 주 : 간섭 필터 (40분의 480 ㎚) 및 다이크로 익 미러에 의해 DAF-2 DA위한 여기 및 발광 파장을 선택대역 통과 장벽 (505 ㎚) (50분의 535 ㎚). 이미지를 수집 : 20 배 대물 렌즈 (0.75 NA)를 사용합니다. 광표백을 최소화하기 위해, 간섭 필터 앞의 감광 필터 (0.5 N)을 배치하고 0.12 초의 노출 시간을 제한한다. </li><li> DAF-2 DA (5 μM)와 세포를로드합니다. 37 ° C에서 약 35-40 분 동안 DAF-2 DA로 관류 장치. 초기 로딩 후 DAF-2 형광 강도 (FI DAF)의 기준선을 기록합니다. 참고 : DAF-2 DA 실험 (7)에 걸쳐 관류에 지속적으로 존재한다. </li><li> DAF-2 이미지를 수집합니다. 5 분 동안 FI DAF의 기준선을 기록합니다. ATP (10 μM)로 관류 장치를 1 분 간격으로 30 분 동안 이미지를 수집한다. 동일한 초점 평면에서 셀의 동일한 그룹의 모든 이미지를 수집한다. </li></ol> 6. 데이터 분석 <ol><li> 수동으로 개별 셀 수준에서 수집 된 이미지에서 관심 (로아)의 영역을 선택합니다. 마다ROI는 형광 윤곽에 의해 표시 될 수있는 하나의 개별 셀의 영역을 다루고 있습니다. </li><li> 배경 형광을 빼기 각 로아의 평균 FI를 계산합니다. </li><li> EC에서 ATP에 의한 변화를 측정 [칼슘 2 +] i와 NO 생산. (FI 0 알부민 벨소리 관류 동안 평균 기준 FI가 ATP를 추가하기 전에이다 FI / FI 0 * 100) FLUO-4 FI의 변화를 계산하여 EC [칼슘 2 +] 난에 ATP에 의한 변화를 정량화를 뺀 측정 배경. 시간 경과 FI DAF의 제 1 차동 변환을 수행함으로써 NO 생산 속도를 정량화 없다. 주 : FI DAF 시간 경과 시간과 누적 NO 생산을 나타낸다. 따라서, NO 생성 속도는 기초 및 ATP 조건을 자극 모두에서 FI DAF의 프로필을 기준으로 계산되지 않습니다. 데이터 분석 및 실험 절차의 세부 사항은 이전의 간행물 7에 기재되어있다. </li></ol>

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</ol>

저자는 공개 할 경쟁의 이익 또는 충돌하는 이해 관계가 없습니다.

<html> 이 글에서, 우리는 배양 된 미세 혈관 네트워크의 개발을위한 상세한 프로토콜을 제시, EC 접합 및 F-굴지의 유통 세포 골격 특성화 및 EC의 정량적 측정 [칼슘 2 +] i와 미세 유체 장치를 이용하여 NO 생산. 관류 미세 유체 장치는 생체 내 미세 혈관 형상과 전단 유동 조건의 가까운 시뮬레이션을 허용하는 체외 모델을 제공합니다. 배양 된 미세 혈관 네트워크가 일차 인간 EC에 의해 형성 될 수 있기 때문에,이 방법은 환자의 시료로부터 변형 된 혈액 성분이 배양 된 미세 혈관에 환자의 혈액 시료를 직접 관류 인간 EC에 영향을 미치는지 병리학 연구 및 임상에 대한 통찰력을 제공 할 수있는 유용한 수단이 될 수있다 문제. 미세 혈관의 EC 개발 인간은 인간과 동물의 조직과 약물 반응에 잠재적 불일치를 피하기 위해 약물 스크리닝에 사용될 수있다. ve_content &quot;&gt;이 프로토콜에 도시 된 미세 유동 장치의 기판 상에 ...

생체 내에서 혈관 벽을 라이닝 내피 세포 (EC에)는 끊임없이 유동에 노출되어 있지만, 배양되는 EC 종종 정적 조건 하에서 성장 및 염증성 표현형 1,2 나타내고있다. 미세 유체 기술은 원하는 유량 조건 하에서 성장하기 위하여, 특히 혈관의 EC를 들어, 세포 배양을위한 기회를 제공하는 마이크로 기하학적 제약 (서브 밀리미터) 채널 (3)을 통해 유체를 정밀하게 제어 할 수있다. 이러한 기능은 기존의 정적 차원 세포 배양에 비해 생체 내에서의 세포 배양 조건을 가까이합니다. 그들은 마이크로 유체 장치 vasculatures의 다른 유형을 모델링하는 데 사용되는 기계적 및 / 또는 화학적 자극에 대한 EC의 반응을 연구 할 때 매우 중요하다. 정적 세포 배양, 생물 의학 F의 적응과 미세 유체의 응용 프로그램을 통해 마이크로 네트워크에 의해 입증 장점에도 불구하고의 ield 제한 남아있다. 최근의 검토에 의해보고되는 경우,이 필드 (85 %)의 서적의 대부분은 공학 저널 (4)에 정지한다. 미세 유체 장치의 성능은 대부분의 생물 학자들이 같은 트랜스 웰 분석이 소형 장치에 매크로 규모의 배양 접시 / 유리 슬라이드로 현재 기술로 전환하기에 충분한 납득되지 않았습니다. 미세 유체 앞으로이 필드를 이동하는 학제 간 협력을 필요로하는 종합 분야입니다. 이 기술 문서의 목적은 생물학적 응용 및 미세 미세 혈관의 기능 검증을 제공하면서, 기술 분야 사이의 갭을 ​​감소시키고 생물에 의한 제조 방법을 이해할 수 있도록하는 것이다. 시각화 실험 프로토콜은 마이크로 유체 장치 및 엔지니어와 생물 학자들 사이의 긴밀한 협력을 나타내는 생물학적 유틸리티, 모두의 제조를 포함한다. 우리는 최근 몇 가지를보고미세 유동 장치 (5) 시험 관내 미세 혈관 망을 이용하여 생물학적 응용. 적절히 원하는 전단 응력을 마이크로 네트워크의 치수를 설계 및 적용하기 위해서, 수치적인 모델 밀접 유량 프로파일을 추정하는 전산 유체 역학 소프트웨어를 사용하여 구축 하였다. 즉, 합류에 도달 마이크로에 접종 한 기본 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVECs를)은 연속 관류 3-4 일, 마이크로의 전체 내부 표면에 덮여있다. 적절한 배리어 형성 정적 세포 배양 조건에서 미세 혈관 손상에 형성된 것과 비교 VE-cadherin의 염색에 의해 증명되었다. 개별적으로 관류 그대로 미세 혈관 6-8에서 개발 된 실험 프로토콜을 적용하여, 우리는 정량적으로 EC의 변화를 측정 [칼슘 2 +] i와 산화 질소 (NO) 형광에서와 아데노신 삼인산 (ATP)에 응답하여 생산에 모아와 공 초점 및 기존의 형광 현미경. EC의 효능 유발 증가 [칼슘 2 +] i와 NO 생산은 미세 혈관 투과성 6-15에 염증 매개체에 의한 증가에 필요한 세포 내 신호로보고되고있다. 일부 이전 연구는 DAF-2 DA로드 미세 유체 장치 (16, 17)의 이미지를 보여 주었다 있지만, 적절한 해상도와 데이터 분석은 아직 18을 달성하지 않았다. 우리의 지식으로,이 연구는 내피 세포에 작용 물질에 의한 동적 변화 [칼슘 2 +] i와 NO 생산 이용한 미세 유체 기반 시스템의 첫 번째 양적 측정을 보여줍니다. 미세 가공 기술이 몇 마이크론 마이크로 채널을 제조 및 생체 내 미세 혈관의 형상을 모방하는 복잡한 패턴의 개발을 가능하게 할 수있는 유연성을 가지고있다. 여기에서 우리는 분기의 세 가지 수준으로 일반적인 마이크로 채널 네트워크를 발표했다. 이네트워크는 미세 크린룸 소프트 리소그래피에서 수행되는 리소그래피의 조합에 의해 제조된다.

<table><tbody><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>아세톤</td><td>Fisher Scientific</td><td>A929</td><td></td></tr><tr><td>생검 펀치</td><td>Miltex</td><td>33-31 AA</td><td></td></tr><tr><td>소 알부민</td><td>MP Biomedicals</td><td>810014</td><td></td></tr><tr><td>소 뇌 추출물(BBE)</td><td>Lonza</td><td>CC-4098</td><td></td></tr><tr><td>커버 슬립</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542C</td><td></td></tr><tr><td>DAF-2 DA</td><td>Calbiochem</td><td>251505</td><td></td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31390</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 안티-염소 IgG (H+L) 보조 항체</td><td>생명 기술</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5 (핵 염색)&nbsp;</td><td>세포 신호 기술</td><td>4084</td><td></td></tr><tr><td>내피 세포 성장 보충제(ECGS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2759-15MG</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Gibco</td><td>PHE0023</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life technologies</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>돼지 껍질의 젤라</td>틴 <td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td></td></tr><tr><td>겐타마이신(50mg/ml)</td><td>Gibco</td><td>15750-078</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버슬립</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548B</td><td></td></tr><tr><td>유리 파스퇴르 피펫</td><td>VWR</td><td>14672</td><td></td></tr><tr><td>돼지 장 점막에서 추출한 헤파린 나트륨 염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393-10KU</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 완충 식염수</td><td>Lonza</td><td>CC-5024</td><td></td></tr><tr><td>인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)</td><td>Lonza</td><td>CC-2517</td><td></td></tr><tr><td>이소프로필 알코올(IPA)</td><td>VWR</td><td>89125</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민(200mM)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>포유류 링거 용액 성분</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl(132mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl(4.6mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 &middot; 2H2O (2.0 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 &middot; 7H2O (1.2 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>포도당 (5.5 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP350-1</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3 (5.0 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Salt (9.1 mM)</td><td>Research Organics</td><td>6007H</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Acid (10.9 mM)</td><td>Research Organics</td><td>6003H</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 131 Culture Medium</td><td>Life Technologies</td><td>10372-019</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin (F-actin staining)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>Buffered Saline&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>폴리디메틸실록산(PDMS)</td><td>다우코닝 코퍼레이션</td><td>실가드 184</td><td></td></tr><tr><td>메스</td><td>엑셀 Int</td><td>29552</td><td></td></tr><tr><td>스카치 테이프</td><td>3M</td><td>34-8711-3070-3</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 웨이퍼</td><td>VWR</td><td>14672</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 포토레지스트</td><td>MicroChem</td><td>SU-8 2050 Y111072</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 현상액</td><td>MicroChem</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 플라스크</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z707503-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Chemical Book</td><td>T6878</td><td></td></tr><tr><td>트립신 중화제 용액</td><td>Gibco</td><td>R-002-100</td><td></td></tr><tr><td>트립신/EDTA 용액(TE)</td><td>Gibco</td><td>R-001-100</td><td></td></tr><tr><td>튜빙</td><td>Cole-Parmer</td><td>PTFE 마이크로보어 튜브, 0.012" ID x 0.030" OD</td><td></td></tr><tr><td>VE-cadherin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-6458</td><td></td></tr><tr><td>장비 이름</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>Biosafety Laminar hood</td><td>NuAire</td><td>NU-425 Class II, Type A2</td><td></td></tr><tr><td>CCD 카메라</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Leica</td><td>TCS SL</td><td></td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>Bel-Art</td><td>F42022</td><td></td></tr><tr><td>핫플레이트</td><td>Wenesco</td><td>HP-1212</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Forma Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 오븐</td><td>Barnstead</td><td>3608-5</td><td></td></tr><tr><td>리소그래피 벤치</td><td>Karl Suss</td><td>MA6 Contact Lithography</td><td></td></tr><tr><td>광학 현미경</td><td>Nikon</td><td>L200 ND & </td><td></td></tr><tr><td>CCD 카메라</td><td>Sutter Instrument</td><td>Lambda 10-2</td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 클리너</td><td>PVA TePla/Harrick 플라즈마</td><td>M4L/PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>스핀 코터</td><td>Brewer Science</td><td>Cee 200X</td><td></td></tr><tr><td>주사기 펌프 시스템</td><td>Harvard Apparatus</td><td>703005</td><td></td></tr><tr><td>소프트웨어 이름</td><td> 회사</td><td>카탈로그 번호</td><td>설명</td></tr><tr><td>CAD 소프트웨어</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD 2015</td><td></td></tr><tr><td>CFD 시뮬레이션 소프트웨어</td><td>COMSOL</td><td>COMSOL Multiphysics 4.0.0.982</td><td></td></tr><tr><td>이미지 획득 및 분석 NO 생산&nbsp;</td><td>범용 이미징</td><td>메타플루오르(Metafluor</td><td></td></tr></tbody></table>)

개발 및 특성화의<em&gt; 체외</em&gt; 미세 혈관 네트워크 및 내피의 정량적 측정 [칼슘<sup&gt; 2 +</sup&gt;]<sub&gt; 전</sub&gt; 및 질소 산화물 생산

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

생체 내에서 혈관 벽을 라이닝 내피 세포 (EC에)는 끊임없이 유동에 노출되어 있지만, 배양되는 EC 종종 정적 조건 하에서 성장 및 염증성 표현형을 나타내고있다. 미세 유체 장치의 개발이 20 년간 엔지니어들이 채택되었지만, 생물학적 응용은 제한 남아있다. 생물학적 응용 프로그램에 의해 검증보다 생리 학적으로 관련 시험 관내 미세 혈관 모델들이 필드에 발전 생체 사이 시험관 연구에서 격차를 해소하는 것이 중요하다. 여기서는 장기 관류 용량을 갖는 미세 유동 장치를 이용하여 배양 된 미세 혈관 네트워크의 개발을위한 상세한 절차를 제시한다. 또한, 종래의 공 초점 및 형광 현미경을 사용하여 실시간으로 EC [칼슘] i 및 산화 질소 (NO)의 생산에서 작용제 - 유도 변화의 정량적 측정을위한 응용 프로그램을 보여준다. 형성된 미세 혈관 순연속 관류와 작업이되는 EC 사이의 잘 발달 된 접합을 보여 주었다. 분포를-cadherin의 VE 것은 정적 배양 EC 단층보다 그대로 미세 혈관에서 관찰에 가까운이었다. EC의 일시적인 증가가 유도 ATP [CA는 2+] i 및 NO 생산은 정량적 배양 된 미세 혈관의 기능을 검증 개별 셀 레벨에서 측정되었다. 이 마이크로 유체 장치는 내장 컴퓨터가 기존의 정적 2D 문화보다 생체 내에서의 세포 배양 환경을 가까이하게 잘 조절, 생리 학적으로 관련 흐름에 따라 증가 할 수 있습니다. 마이크로 채널 네트워크 설계 다용도이며, 제조 공정이 단순하고 반복적이다. 이 장치는 쉽게 고해상도 영상화를 가능하게하는 공 초점 현미경 또는 종래의 시스템에 통합 될 수있다. 배양 된 미세 혈관 네트워크가 일차 인간 EC에 의해 형성 될 수 있기 때문에, 가장 중요한 것은,이 방법은 방법을 조사하기 위해 유용한 도구가 될 것병리학 적으로 환자 샘플에서 변경된 혈액 성분은 인간의 내장 컴퓨터에 영향을 미치는 임상 문제에 대한 통찰력을 제공합니다. 또한, 약물 스크리닝을위한 플랫폼으로 개발 될 수있다.

이 섹션에서는이 프로토콜을 개발 한 배양 된 미세 혈관 네트워크와 얻어진 결과의 일부를 보여줍니다. 마이크로 패턴은 세 개의 레벨 분기 네트워크 (도 1a)이다. 이 설계에서, 네 개의 100 ㎛ 폭 보조 채널로 다시이 126 μm의 넓은 채널, 나뭇 가지로 159 ㎛ 폭 어머니 채널 분기합니다. 의 3D 수치 시뮬레이션이 마이크로 네트워크 내에 전단 응력의 ​​세 가지 레벨을 표시 0.35 μL / 분의 유속 (도 1b)에 따라 전단 응력 분포를 추정 하였다. 마이크로 채널 내의 층류를 교란 또는 보조 유동의 존재없이 유체 역학적으로 안정한 것으로 예상된다. SU-8 마스터 몰드는 표준 포토 리소그래피 공정 (도 1C)를 제조 하였다 후, PDMS 장치는 마이크로 채널 (NE)를 복제하는 소프트 리소그래피를 통해 제조 된투명, 공기 투과성 지지체 (- E</str...

1차 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)는 미세유체 네트워크 장치 내에서 합류하도록 성장했습니다. 내피 세포 접합부와 F-액틴 분포를 설명하고 아데노신 삼인산(ATP)에 대한 반응으로 세포 내 칼슘 농도 및 산화질소 생성의 변화를 개별 세포 수준에서 실시간으로 정량화했습니다.

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

이 절차의 전반적인 목표는 내피세포가 생리학적으로 유의미한 전단 흐름 하에서 성장할 수 있도록 하는 미세유체 장치를 개발하고, 작용제에 의해 유도된 칼슘 및 산화질소 생성의 변화를 측정하는 것입니다. 이 방법은 인비트로(in vitro) 미세혈관 모델을 검증하고 인비보(in vivo) 연구와 인비트로 연구 사이의 간극을 메움으로써 미세혈관 연구의 미래를 발전시키는 데 기여할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다양한 혈관계 구조를 모방할 수 있는 미세채널의 다각적인 설계가 가능하다는 점이며, 기존의 정적인 배양 조건보다 인비보 환경에 더 가까운 세포 배양 환경을 개선한다는 점입니다.시연은 저희 실험실의 Sulei와 Xiang 두 사람이 진행하겠습니다. 시작하기 전에, 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 표준 포토리소그래피(photolithography)를 사용하여 마스터 몰드를 제작하고 소프트 리소그래피(soft lithography)를 통해 PDMS 미세유체 채널 장치를 제작하십시오. 미세유체 채널 장치를 준비하려면, 먼저 입구와 출구를 얇은 PDMS 조각으로 덮고 젖은 티슈가 들어 있는 페트리 접시 안에 장치를 넣으십시오.그런 다음, 디쉬를 Parafilm으로 감싸고 UV 램프 아래에서 장치를 최소 3시간 동안 멸균합니다. 다음 단계는 fibronectin을 도포하는 것입니다. 먼저, 입구에 30~50 µL의 PBS 한 방울을 떨어뜨립니다.출구 쪽에 진공을 형성하여 장치를 세척합니다. 다음으로, 입구 쪽에 100 µg/mL fibronectin 한 방울을 떨어뜨립니다. 출구 쪽에 진공을 형성하여 fibronectin 용액을 로딩합니다.다음으로, 입구와 출구를 덮습니다. 배양 접시를 Parafilm으로 다시 감싸고 장치를 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, PBS로 장치를 세 번 수동으로 헹굽니다.그런 다음, 30에서 50 µL의 세포 배양 배지를 넣고 37 °C의 인큐베이터에서 장치를 최소 15분 동안 예열합니다. 8% Dextran이 포함된 HUVEC 배양 배지에 HUVEC을 mL당 200만에서 400만 개의 세포 농도로 혼합하여 시작합니다. Dextran은 점도를 높여 세포 시딩 효율을 향상시키기 위해 필요합니다.다음으로, 유입구 위에 10~20 µL의 세포를 올리고 중력을 이용하거나 출구 쪽에서 유리 파스퇴르 피펫의 모세관 현상을 이용하여 세포를 주입합니다. 그 다음, 장치를 15~20분 동안 배양합니다. 이후 현미경으로 세포 접종 상태를 확인합니다.필요한 경우, 원하는 세포 밀도를 달성하기 위해 더 많은 세포를 로딩하십시오. 충분한 세포가 로딩되면, 일반적인 따뜻한 세포 배양 배지로 장치를 부드럽게 헹구어 Dextran을 제거합니다. 그 후, 배지 관류 없이 6시간 동안 장치를 배양하십시오.다음으로, 장기 관류를 위한 튜빙 연결을 설정합니다. 장치를 페트리 접시에 테이프로 고정한 후, 입구 튜빙을 바늘이 달린 주사기에 연결합니다. 장치의 입구와 출구 양쪽에 튜빙을 삽입합니다.배출 튜브를 폐액 수집기에 연결합니다. 이제 디쉬와 폐액 용기를 인큐베이터에 넣습니다. 긴 유입 튜브가 연결된 시린지를 인큐베이터 문을 통과하여 외부 퍼퓨전 펌프에 연결합니다.그 다음, 실험 설계에 따라 관류 속도를 설정합니다. 관류가 잘 제어되면 미세혈관 네트워크 내의 배양 상태를 최대 2주까지 유지할 수 있습니다. 따라서 이를 통해 다양한 생리적 및 병리적 조건에서의 세포 및 혈역학적 환경을 모사하는 장기 연구로 확장할 수 있습니다.VE-cadherin 라벨링과 같은 면역 염색을 시작하려면, 먼저 4°C에서 2% paraformaldehyde로 30분 동안 관류하여 세포를 고정합니다. 블로킹, 투과화 및 항체 염색을 위한 일련의 관류 과정을 거친 후, 세포 이미징 전까지 장치를 4°C로 유지합니다. 세포 내 칼슘 농도를 이미징하려면, 37°C에서 Ringer solution에 10 mg/mL albumin을 혼합하여 15분 동안 장치에 관류합니다.다음으로, 37°C에서 5 µM Fluo-4 AM으로 장치를 40분 동안 관류합니다. 그 후, 37°C에서 albumin Ringers로 루멘에 결합된 Fluo-4 AM을 15분 동안 세척합니다. 이어서, Fluo-4 AM을 이용한 세포 간 칼슘 농도 이미징을 위해 공초점 시스템을 가동합니다. Fluo-4가 로딩된 미세혈관의 이미지를 획득합니다.10분 동안 베이스라인 이미지를 수집합니다. 그런 다음, 10 µM ATP를 장치에 지속적으로 관류하며 20분 동안 형광 강도의 변화를 기록합니다. 세포 내 산화질소 생성을 이미지화하려면, 37 °C에서 albumin Ringers로 장치를 15분 동안 관류합니다.그 다음, 37 °C에서 약 35~40분 동안 5 µM DAF-2 DA를 사용하여 세포를 관류합니다. 이어서, ATP로 유도된 일산화질소 생성을 측정하기 위해 형광 이미징 시스템을 설정합니다. 5분 동안 기저 상태를 기록한 후, 장치에 10 µM ATP를 관류하고 1분 간격으로 30분 동안 이미지를 수집합니다.세포 내 산화질소 측정 시, 강도 프로파일(intensity profile)의 분리 어댑터는 산화질소 농도가 아니라 시간에 따른 누적 산화질소 생성량을 나타낸다는 점을 이해하는 것이 중요합니다. 수집된 이미지에서 개별 세포 수준의 관심 영역(ROI)을 수동으로 선택하십시오. 각 ROI는 형광 외곽선으로 표시될 수 있는 개별 세포 하나의 영역을 포함합니다.ATP로 유도된 내피 세포의 칼슘 및 산화질소 변화를 정량화합니다. 조직 배경 값을 제외한 Fluo-4의 형광 강도 변화를 계산하여 측정합니다. 시간 경과에 따른 DAF-2의 형광 강도를 1차 미분 변환하여 산화질소 생성률을 정량화합니다.장치 내의 마이크로채널 패턴은 3단계 분지 네트워크 구조를 가지고 있습니다. 0.35 µL/min의 유량 조건에서 전단 응력 분포를 추정하기 위해 3D 수치 시뮬레이션을 수행하였습니다. 내피세포를 설명된 방법대로 네트워크 내에 시딩하였습니다.그 후, F-actin과 핵을 염색하였다. 마찬가지로 VE-cadherin 또한 염색하였다. 그 결과는 온전한 세정맥에서의 VE-cadherin 발현과 유사하였다.다음으로, ATP에 의해 유도된 세포 내 칼슘 증가와 일산화질소 생성을 조사하였습니다. 칼슘 수치는 프로토콜 섹션에 설명된 대로 Fluo-4 AM을 사용하여 측정하였습니다. 일산화질소 생성은 프로토콜 섹션에 설명된 대로 DAF-2 DA를 사용하여 모니터링하였습니다.결과는 개별적으로 관류된 온전한 세정맥을 통해 얻은 결과와 유사했습니다. 이 고급 기술은 생물학적 조건 및 동적 유체 환경에서 용이하게 수행되었으며 엄격하게 제어되었는데, 이는 기존의 미세수술 기술로는 불가능했을 것입니다. 이 영상을 시청하고 나면 장치를 제작하고 칼슘 및 산화질소 측정을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.이 기술은 연구자들이 효능제에 의해 유도되는 기전을 조사할 수 있는 길을 열어주었을 뿐만 아니라, 생의학 연구를 위한 더 광범위한 응용 가능성을 제시하였습니다.

development-characterization-vitro-microvessel-network-quantitative

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

신생아 쥐 망막에서 혈관 신생을 조절 다른 유전자 또는 약물의 역할의 조사를 허용하는 혈관의 잘 특성화 생리 학적 모델을...

혈관을 조사하기 위해 신생아 마우스 망막의 전체 마운트 면역 형광 염색<em&gt; 생체 내</em

마이크로 - 온 - 칩 플랫폼은 포토 리소그래피 리플 로우 레지스트 기술, 소프트 리소그래피, 그리고 미세 유체의 조합에 의해 개발되었다. endothelialized 마이크로 플랫폼은 생체 내 미세 혈관에서의 3 차원 (3D) 구조를 모방 제어 지속적인 혈류의 흐름에서 실행하고, 고품질의 실시간 영상을 허용하고 미세 혈관 연구에 적용 할 수 있습니다.

멀티 깊이 원형 단면 Endothelialized 마이크로 채널 - 온 - 칩의 개발을위한 절차

관 형성 분석법은 시험관 내 혈관 신생을 측정하기위한 신속하고 정량적 방법이다. 내피 세포는 조절 된 미디어와 결합 기저막 추출물에 도금된다. 튜브 형성은 시간 이내에 발생하고 새로 형성된 세관은 쉽게 정량화.

에 대한 내피 세포의 관 형성의 분석<em&gt; 체외</em&gt; 혈관 신생 연구

혈관 세포 기능은 세포 내 메신저의 활성에 따라 달라집니다.  여기에 설명된 것은 고립된 대동맥의 개별 내피 및 평활근 세포에서 생리학적 및 약리학적 자극에 반응하여 세포 내 칼슘 및 산화질소 수준을 측정할 수 있는 생체 외 이광자 이미징 방법입니다.

세포 내 칼슘의 두 광자 이미징<sup&gt; 2 +</sup&gt; 고립 된 쥐 대동맥의 취급 및 내피 세포에서 산화 질소 생산과 부드러운 근육 세포

여기 설명 (1) 갓 그대로 뇌 내 피 "튜브" 및 내 피 칼슘과 막 내 피 파생 hyperpolarization 동안 잠재적인의 (2) 동시 측정을 분리에 대 한 프로토콜이 있습니다. 또한, 이러한 메서드는 내 피 세포 칼슘 및 개별 또는 대화형 실험 변수로 전기 신호의 약리 튜닝 수 있습니다.

세포내 칼슘과 갓 고립과 그대로 마우스 대뇌 피에 막 잠재력의 동시 측정

유도 된 만능 줄기 세포에서 파생 된 내피 전구체 (iPSC-EP)는 심혈관 질환 치료에 혁명을 일으킬 잠재력을 가지고 있으며 보다 충실한 심혈관 질환 모델을 생성 할 수 있습니다. 본 명세서에서, 3차원(3D) 콜라겐 미세환경에서 iPSC-EP의 캡슐화 및 이들 세포의 혈관전위액의 정량적 분석이 기재되어 있다.

iPSC 유래 내피 선조의 혈관 전위를 정량화하는 체외 3D 모델 및 전산 파이프라인

여기서, 우리는 미세 유체 칩과 자동으로 제어되는 고효율 순환 미세 유체 시스템을 제공하여 신생 혈관화의 초기 미세 환경을 재구성하여 내피 세포 (EC)가 높은 발광 전단 응력, 생리학적 수준의 경내 연골 흐름 및 다양한 혈관 내막 성장 인자 (VEGF)에 의해 자극 될 수 있도록 합니다.

뇌혈관화의 초기 이벤트를 모방하는 미세 유체 모델

이 분석은 3D 콜라겐 젤에서 배양된 배아체로 분화된 마우스 배아 줄기 세포를 활용하여 시험관 내에서 발아 혈관신생을 제어하는 생물학적 과정을 분석합니다. 이 기술은 약물 테스트, 질병 모델링 및 배아적으로 치명적인 결실의 맥락에서 특정 유전자를 연구하는 데 적용될 수 있습니다.

체외 혈관 질환 모델링 및 약물 검사를 위한 마우스 배아 줄기 세포를 이용한 혈관신생의 3차원 발아 분석

대뇌 실질 세동맥으로부터의 무손상 마우스 대뇌 내피 "튜브"의 집중적 인 준비는 뇌 혈류 조절을 연구하기 위해 예시된다. 또한, 우리는 세포 내 [Ca2+] 및 막 전위의 변화를 포함한 주요 세포 신호 전달 경로의 형광 이미징 및 전기 생리학 측정을위한 내피 연구 모델의 실험 강점을 입증합니다.

마우스 뇌 실질의 동맥 내피의 분리 및 기능 분석

이 프로토콜은 장쇄 및 초장쇄 포화 지방산의 BODIPY-C12 및 BODIPY-C16 형광 유사체로 자극 시 내피 세포에서 세포 지질 흡수를 측정하기 위한 시험관 내 분석을 자세히 설명합니다. 이 방법은 효율적이고 다른 세포 유형에 적응할 수 있어 지질 대사를 연구하는 데 유용한 접근 방식을 제공합니다.

형광 지방산 유사체를 이용한 내피 지방산 흡수의 정량화

배우세요 미세유체 장치를 이용한 HUVEC 배양 및 ATP 유도 칼슘 신호와 산화질소 생성 정량화 방법. 생리학적 전단류 조건에서 내피 세포 반응을 실시간 측정하여 미세혈관 연구의 격차를 해소합니다.

개발 및 특성화의

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