줄기 세포 기반 유전자 치료 종양 모델로 BLT 인간화 마우스를 사용하여

다음 실험의 전반적인 목적은 조작된 인간 면역 체계를 가진 쥐를 생성하는 것입니다. 이것은 먼저 수술을 위해 마우스를 준비한 다음 두 번째 단계에서 투관침에 흉선 조각을 로드함으로써 달성됩니다. 마트리겔을 CD 34 음성 및 CD 34 양성 형질도입 세포와 혼합한 다음 혼합물을 투관침에 첨가합니다.

다음으로, 마트리겔 구조체를 신장 캡슐 아래에 이식합니다. 궁극적으로, 유전자 조작 CD 8 T 세포에 의한 표적 종양의 거부 반응은 살아있는 애완 동물 이미징 및 물리적 종양 측정으로 모니터링 할 수 있습니다. 완전 뉴런 모델과 같은 기존 필로폰 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 방법을 통해 인간 흉선 내에서 유전적으로 변형된 인간 줄기 세포 발달을 연구할 수 있고 그 절차를 입증하는 파생 계통의 생체 내 효능 테스트를 수행할 수 있다는 것입니다. 그리고 숀 킴.

이 개략도에서는 마트를 운반하는 키메라 마우스의 생성을 위해 이러한 연구에 사용된 수정된 BLT 모델, 하나의 특정 T 세포가 요약되어 있습니다. 임플란트는 자가 태아 간에서 분리된 형질도입 및 비형질주입 CD 34 세포로부터 재구성된다. 그런 다음 형질도입된 세포의 일부를 동결하여 4주 내지 6주 후에 방사선 조사된 마우스에 주입합니다.

이 비디오에서는 동물이 마취로 인해 느려진 후 살아있는 구조물을 이식하는 것을 시연합니다. 각 마우스의 왼쪽을 엉덩이에서 어깨까지 등 중앙과 배 사이를 면도하는 것으로 시작합니다. 각 동물의 체중을 기록한 후 귀를 주먹으로 번호를 매기고 피하로 각 어깨에 0.3ml의 카프로펜을 주사합니다.

그런 다음 마우스를 왼쪽을 향하도록 오른쪽에 놓습니다. 이제 PBS가 있는 둥근 파일 팁이 있는 16게이지 암 임플란트 바늘의 투관침을 세척합니다. 한 쌍의 바늘 코 겸자를 사용하여 PBS 접시에 흉선 조각을 추가한 다음 막대와 수평으로 투관침을 잡습니다.

팁 안쪽에서 조직을 흡인합니다. 투관침을 신장 캡슐 아래로 밀어 넣고 조직을 주입하는 것은 이 절차에서 가장 어려운 측면 중 하나입니다. 다음으로, 도우미가 있어야 합니다.

eend orph positive displacement 피펫을 사용하여 5마이크로리터의 차가운 마트리겔을 세포 튜브 하나에 부드럽게 저어주면서 혼합합니다. 투관침을 수평으로 유지. 도우미가 매트리스 젤을 피펫팅하는 동안 막대를 천천히 뒤로 당깁니다.

각 마우스의 투관침에 섞습니다. 먼저 베타딘으로 동물의 맨살을 닦은 다음 이소프로판올 물티슈로 닦아냅니다. 두 번은 피부 아래의 가장 어두운 점을 확인하여 비장의 위치를 나타냅니다.

신장은 비장에서 약 5mm 등쪽에 있으며, 뭉툭한 집게를 사용하여 신장 위의 피부를 집어 올립니다. 비장과 평행하게 피부를 약 15mm 길이로 자릅니다. 아래의 복막 근육층도 비슷하게 절개한다.

남성의 경우 신장을 직접 볼 수 있어야 합니다. 복부를 쥐어짜기만 하면 튀어나옵니다. 여성의 경우 신장이 노출되지 않도록 왼손으로 복부에 압력을 가하는 것이 먼저, 지혈을 사용하여 난소를 집어낸 다음 신장을 끌어내어 장기가 몸 밖으로 유지되도록 돕습니다.

신장 캡슐의 뒤쪽 끝에 있는 작은 구멍을 뽑은 다음 투관침의 구멍이 신장 캡슐로 완전히 덮일 때까지 투관침을 이 구멍과 신장을 따라 밀어 넣습니다. 그런 다음 오른손의 새끼 손가락을 사용하여 조직을 주입합니다. 이제 닫힌 지혈제를 사용하여 신장을 부드럽게 제자리로 밀어 넣습니다.

복막의 한 바늘을 더블 보브로 묶어 지갑처럼 피부를 짜낸 다음 두 개의 상처 클립에 넣습니다. 마지막으로 PBS 한 방울을 양쪽 눈에 떨어뜨리고 침구 위에 있는 케이지에 마우스를 옆으로 눕힙니다. 같은 방법으로 모든 쥐를 이식한 후 동물이 떠나기 전에 배에 누워 있는지 확인합니다.

이 첫 번째 그림은 인간화 마우스에 있는 THI 라이브 임플란트의 대표적인 이미지를 보여줍니다. 이 그림에서는 흉선 조직의 정상적인 발달과 인간 CD 4 및 CD 8 양성 T의 생리학적 조직 분포가 입증되었습니다. 재구성 후, 동물은 CD 4 및 CD 8 양성 T 세포의 정상 분포를 가진 인간 면역 체계를 가지고 있습니다.

다음은 흑색종 종양을 가지고 있는 쥐의 대표적인 이미지입니다. 회색 영역은 CT 스캔 이미지를 나타냅니다. 색상이 지정된 영역은 PET 스캔에서 감지된 종양의 대사 활동을 나타냅니다.

이 실험의 CT 스캔만으로도 흰색 원으로 표시된 영역에 큰 종양 덩어리가 있음을 나타낼 수 있습니다. 그러나 in vivo PET 이미징에서 알 수 있듯이 이 영역은 대부분 괴사 및 흉터 조직으로 구성되어 있으며, 종양 퇴행 및 제거를 평가하는 보다 민감하고 정확한 방법으로서 PET 이미징의 유용성을 강조합니다. 이 절차에 따라 T-세포, 표현형 분석 및 생체 외 활성화와 같은 다른 분석을 수행하여 T-세포 기능과 관련된 질문에 답할 수 있습니다.