상호 빛과 전자 현미경은 β - 아밀로이드 플라크와 소교의 상호 작용을 연구하는

이 문서는 혈액 - 뇌 장벽을 통과 선택적 β-주름에 조밀 한 핵심 Aβ 플라크에있는 시트를 결합 메 톡시 X04을 사용하여 알츠하이머 병 마우스 모델에서 아밀로이드 아밀로이드 베타 플라크를 시각화하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이는 전자 현미경을위한 면역 염색 처리 전에 플라크 - 함유 조직 절편의 예비 스크리닝 할 수있다.

이 절차의 전반적인 목표는 전자 현미경을 위한 사전 삽입, 면역 염색 및 조직 처리 전에 알츠하이머병 마우스 모델의 뇌 절편에서 베타 아밀로이드 플라크를 식별하는 것입니다. 이 방법은 아밀로이드 베타 플롯 근처의 시냅스와 미세아교세포 세포의 상호 작용과 같은 신경면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 관심 영역과 층에서 아밀로이드 베타 플롯을 포함하는 뇌 조직 절편을 사전 스크리닝할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 알츠하이머병에 적용할 수 있지만 아밀로이드증이 있는 다른 질병이나 조직에도 적용할 수 있습니다. 먼저, 메톡시 X04 화합물의 밀리리터 당 5 밀리그램 용액을 준비합니다. mirco 저울을 사용하여 메톡시 X04의 무게를 5mg씩 싣습니다.

흄 후드 아래에서 메톡시 X04를 100마이크로리터의 DMSO에 용해시키고 맑은 녹색 용액이 얻어질 때까지 저어줍니다. 교반하면서 450 마이크로 리터의 프로필렌 글리콜과 450 마이크로 리터의 인산염 완충 식염수를 연속적으로 첨가합니다. 용액을 밤새 섭씨 4도에서 혼합하십시오.

다음날, 황록색 에멀젼을 볼 수 있습니다. 메톡시 X04를 주입 한 후 체중 1kg 당 10 밀리그램의 용량을 추가하고 승인 된 방법에 따라 원하는 시점에서 동물을 희생하고 파라 오르말데히드 고정 뇌를 식힌 PBS로 3 번 세척합니다. 그런 다음 날카로운 면도날을 사용하여 후각구를 제거하고 뇌를 관상동맥으로 거의 같은 높이의 두세 조각으로 자르고, 이 모든 조각을 동시에 절단하여 절차를 가속화할 수 있습니다.

트레이에 고정된 표본 플레이트에 뇌 조직 조각을 붙입니다. 매끄러운 절단면이 시편 플레이트에 단단히 달라붙는지 확인하십시오. 전체 뇌 표면이 완전히 잠길 때까지 PBS 용액을 트레이에 추가합니다.

트레이를 비브라톰에 놓고 50미크론 두께의 단면을 생성하도록 비브라톰 설정을 조정합니다. 절단을 시작하고 스크리닝하는 경우 즉시 미세한 붓을 사용하여 섹션을 PBS로 옮깁니다. 또는 섭씨 20도에서 보관하기 위해 극저온 보호 용액이 들어 있는 유리 바이알에 절편을 배치할 수 있습니다.

입체성 마우스 뇌 아틀라스(stereotaxic mouse brain atlas)의 도움을 받아 관심 영역이 포함된 뇌 절편을 선택하고 각 절편을 24웰 배양 플레이트의 웰에 있는 동결 보호제에 넣습니다. 다음으로, 일회용 피펫을 사용하여 PBS 방울을 현미경 슬라이드에 추가한 다음 해당 방울에 해당 부분을 놓습니다. 형광 현미경으로 해당 부분을 검사하여 메톡시 X04로 표시된 a-베타 플라크가 포함된 영역을 식별합니다.

현미경 스테이지를 움직이지 않고 명시야와 형광 모드에서 관심 영역의 이미지를 캡처할 수 있습니다. 각 이미지는 플라크를 조직 섹션의 구조적 영역과 연관시키기 위해 두 필드에서 동일한 영역을 표시해야 합니다. 동물 번호에 따라 촬영한 이미지를 저장하고 이름을 지정합니다.

또한 플레이트의 우물 번호와 촬영 한 사진의 필드를 기록하십시오. 이미징이 완료되면 지정된 웰에 섹션을 다시 놓습니다. 섹션이 건조되지 않도록 동일한 절차를 사용하여 순서의 다음 섹션을 검사합니다.

이미지를 정렬하려면 ImageJ에서 동일한 ROI에 대한 명시야 및 UV 필드 이미지를 엽니다. 그런 다음 MosaicJ 플러그인을 사용하여 두 이미지의 가장자리를 정렬합니다. 웰 번호에 따라 정렬되고 결합된 이미지를 특정 동물의 번호와 함께 폴더에 저장합니다.

동일한 동물의 다른 부분의 이미지를 결합하여 관심 영역의 플라크를 식별하고 위치를 파악합니다. 스크리닝 공정이 완료된 후, 검사된 절편을 면역염색 또는 추가 처리가 수행될 때까지 동결보호제가 함유된 24웰 배양판으로 섭씨 20도에서 보관합니다. 먼저, 유리 바이알의 인산염 완충액에 1%오스뮴 테트록사이드 용액을 준비합니다.

사산화오스뮴은 감광성이므로 유리 바이알을 알루미늄 호일로 덮어 용액을 빛으로부터 보호하십시오. 인산염 완충액으로 세척한 후 섹션에서 완충액을 제거하고 고운 붓을 사용하여 평평하게 펴십시오. 사산화오스뮴을 추가하기 직전에 단면을 평평하게 해야 하며, 단면의 접힘은 영구적이 되며, 오스뮴 고정 후 조직을 평평하게 하려고 하면 단면만 끊어지게 됩니다.

전사 피펫을 사용하여 섹션이 잠길 때까지 한 번에 한 방울씩 섹션에 사산화오스mium을 추가합니다. 우물을 알루미늄 호일로 덮어 표면을 빛으로부터 보호하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 이 배양 중에 일회용 비커에 플라스틱 수지를 준비합니다.

성분을 순서대로 결합하고 균일한 색상이 얻어질 때까지 10ml 혈청학 피펫을 사용하여 잘 혼합합니다. 준비된 혼합물을 알루미늄 계량 접시에 옮깁니다. 이들은 탈수가 완료되면 조직 절편을 받게 됩니다.

배양 시간이 경과하면 각각 2분 동안 증가하는 농도의 에탄올로 절편을 탈수합니다. 24웰 배양 플레이트에서 탈수된 섹션을 20ml 유리 바이알로 옮깁니다. 그런 다음 잔류 에탄올을 제거하기 위해 매번 2분 동안 프로필렌 옥사이드에 섹션을 세 번 담그십시오.

다음으로, 구부러진 유리 피펫 팁이나 미세한 페인트 브러시를 사용하여 프로필렌 옥사이드 용액의 단면을 플라스틱 수지로 옮기고 실온에서 침투시키기 위해 밤새 그대로 둡니다. 침투 후 표본이 들어있는 알루미늄 계량 접시를 섭씨 50-60도 오븐에 10-15분 동안 넣습니다. 폴리클로로트리플루오로에틸렌 필름 시트에 섹션을 삽입하려면 먼저 미세한 페인트 브러시를 사용하여 섹션에 얇은 수지 층을 칠합니다.

그런 다음 알루미늄 계량 접시에서 한 번에 한 부분의 조직을 PCTFE 필름 시트로 이동합니다. 조직 주변의 과도한 수지를 제거하고 방해하지 않도록 주의하십시오. 하나의 계량 접시에서 PCTFE 필름 시트로 모든 섹션을 이동한 후 두 번째 PCTFE 시트를 첫 번째 시트 위에 놓고 두 시트 사이에 조직과 수지 샌드위치를 만듭니다.

인큐베이터에서 수지를 섭씨 55도에서 60도에서 3일 동안 중합합니다. 그런 다음 조직은 초박형 절편 및 초구조 검사를 위한 준비가 됩니다. 다음 이미지는 명시야 및 형광 모드를 사용하여 하나의 해마 단면을 이중 이미징한 것을 보여줍니다.

관심 영역과 레이어는 명시야(bright field) 아래에 시각화됩니다. a-베타 플라크는 340-380나노미터 범위에서 UV 필터를 사용하여 성공적으로 국소화됩니다. 이 이미지는 IBA1에 대한 면역염색을 사전 삽입하기 전의 해마 절편을 보여줍니다.

눈에 보이는 명판은 점선으로 윤곽선이 그려져 있습니다. 이 이미지는 IBA1에 대한 면역염색을 사전 삽입하고 투과 전자 현미경을 위해 처리한 후의 동일한 단면을 보여줍니다. 점선으로 둘러싸인 플라크는 전자 현미경을 위한 조직 처리 시 여전히 볼 수 있습니다.

이 프로토콜은 일단 마스터하면 제대로 수행되면 일주일 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 샘플 품질에 영향을 미치는 오염 및 기타 구조적 퇴화 가능성을 줄이기 위해 모든 단계를 엄격하게 수행해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 오스뮴으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 실험복과 장갑을 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

사용 후에는 실험이 끝나면 시설의 지침에 따라 폐기하십시오.