Name: 의 기록 세포 내 전압 응답에 대한 전기 생리 방법 초파리 빛 자극에 광수와의 interneurons 생체 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: 학습하세요 Drosophila 광수용체와 시각 중간뉴런의 세포내 전기생리학적 반응 기록 방법을. 이 기법은 최소한의 세포 손상으로 고품질 전압 기록을 제공하여 곤충 복합눈의 신경 정보 처리 연구에 적합합니다.

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저자는 리그의 많은 전기 및 기계 부품을 설계하고 제작하는 데 중요한 기여를 한 Mick Swann, Chris Askham 및 Martin Gautrey에게 감사를 표합니다. MJ의 현재 연구는 Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC Grant : BB / M009564 / 1), State Key Laboratory of Cognitive Neuroscience and Learning open research fund (중국), High-End Foreign Expert Grant (중국), Jane and Aatos Erkko Foundation Fellowship (핀란드) 및 Leverhulme Trust Grant (RPG-2012-567)의 지원을 받고 있습니다.

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우리는 손상되지 않은 파리 눈에서 R1-R6 광수용체 및 LMC의 세포내 반응을 기록하기 위해 날카로운 기존 미세 전극을 사용하는 방법에 대한 기본 핵심 단계를 제시했습니다. 이 방법은 지난 18년 동안 맞춤형 하드웨어 및 소프트웨어 도구와 함께 최적화되어 광범위한 실험 질문에 답할 수 있는 고품질의 오래 지속되는 녹음을 제공합니다. 강력하고 정밀한 실험 설정을 구성하고 유리한 전기적 특성을 가진 미세 전극을 생산하기 위해 시간과 자원을 투자함으로써 고품질 기록은 초파리 시각 신경생리학을 연구하는 모든 실험실에서 표준이 될 수 있습니다. 잘 설계된 기록 및 광 자극 시스템은 다양한 실험 패러다임을 신속하게 실행하는 데 중요하지만, 성공적인 기록을 달성하기 위해 훨씬 더 중요한 세 가지 절차 단계가 있습니다: (i) 눈 손상을 최소화하면서 파리 준비를 하는 것, (ii) 올바른 전기적 특성을 가진 미세 전극을 당기는 것, (iii) 기록 전극의 끝을 부러뜨리지 않고 눈으로 밀어 넣는 것입니다. 궁극적으로 의미 있는 데이터를 기록하기 위해 연구자는 전기생리학의 물리적 기초와 표적 세포 유형에 적합한 미세 전극을 제작하는 방법을 이해해야 합니다.
따라서 이 기술의 한계는 주로 연구자의 인내심, 경험 및 기술적 능력에 의해 설정됩니다. 이 기술은 작은 초 파리 세포에 대해 숙달하는 데 오랜 시간이 걸릴 수 있기 때문에 수련생 전기생리학자는 먼저 동일한 장비를 사용하여 날파리(36 ) 또는 메뚜기(35)와 같은 더 큰 곤충 눈으로 연습하는 것이 좋습니다. 더 큰 광수용체와 중간 뉴런에서 고품질 세포 내 기록을 수행하는 것이 일상화되면 초파리 눈으로 이동할 때입니다. 이 기술의 또 다른 한계는 세포 식별에 관한 것입니다. 관통된 초파리 세포는 루시퍼 옐로우 또는 뉴로비오틴을 포함한 염료를 전기영동으로 로드할 수 있습니다. 그러나 미세 전극의 팁 크기가 작기 때문에 전기영동은 패치 전극과 같은 저항이 낮은 전극보다 덜 효율적으로 작동합니다. 또한, 염료로 채워진 미세 전극은 특징적으로 덜 유리한 전기적 특성을 가지므로 초파리 광수용체 및 LMC로부터 고품질 반응을 기록하기가 훨씬 더 어렵습니다.
때때로 발생하는 기술적 문제는 입력 신호가 불안정하거나 완전히 부족하다는 것입니다. 이는 종종 전압 신호가 지속적으로 표류하거나 증폭기의 녹음 범위보다 높거나 낮는 것과 관련이 있습니다. 대부분의 경우 이러한 동작은 기록 전극이 차단되어 발생합니다(또는 팁이 너무 미세하여 저항이 너무 높거나 벽내 커패시턴스가 있어 빠른 신호 변경을 제대로 수행하지 못함). 때때로 작동하는 전극 정전 용량을 윙윙거리게 하여 팁의 차단을 해제하려고 시도할 수 있지만 종종 단순히 기록 전극을 변경하여 상황을 가장 잘 해결할 수 있습니다. 이를 위해서는 새 전극의 팁 저항을 낮추기 위해 미세 전극 풀러 기기의 매개변수 조정이 필요할 수 있습니다. 전극 팁은 또한 준비 중에 막힐 수 있으며, 바셀린으로 각막 구멍을 덮는 데 너무 많은 시간이 걸립니다. 장기간 공기와 접촉하면 새로 노출된 망막 조직이 건조되어 표면층이 접착제 같은 물질로 변할 수 있습니다. 이 경우 조사자는 일반적으로 기록 전극을 눈에서 빼낼 때 기록 전극에 달라붙은 빨간색 조직 덩어리를 봅니다. 여기서 유일한 해결책은 새로운 준비를 하는 것입니다. 바셀린은 전기생리학적 기록에 많은 이점을 제공할 수 있습니다: (i) 전극 팁을 파손할 수 있는 혈림프의 응고를 방지합니다. (ii) 전극 팁을 코팅하여 벽내 커패시턴스를 감소시켜 전극의 시간 상수를 낮추고, 따라서 기록된 신경 신호의 시간적 분해능을 향상시킬 수 있는 잠재력을 갖는다(40,41); (iii) 전극 팁을 깨끗하게 유지하여 침투를 용이하게 합니다. 그리고 침투 후, (iv) 전극 팁을 세포막(42)에 밀봉하는 데 도움이 될 수도 있다. 
전극 홀더의 염화은-와이어가 끊어지거나 탈염화되면 신호가 더욱 불안정하거나 손실될 수 있습니다. 이 경우 기존 와이어를 교체하거나 재염소화하기만 하면 됩니다. 신호 누락은 전극 홀더 중 하나(또는 둘 다)가 잭에 단단히 연결되지 않았기 때문에 발생할 수도 있습니다. 그러나 장비가 오작동하는 것은 매우 드문 일입니다. 신호를 감지할 수 없고 다른 모든 가능성이 소진된 경우 헤드스테이지를 포함한 녹음 장치의 각 부분을 테스트합니다.tage, 증폭기, 저역 통과 필터 및 AD/DA 변환기가 제대로 연결되고 정상적으로 작동하는지 테스트합니다. 이를 달성하는 한 가지 방법은 각 기기를 정상적으로 작동하는 것으로 알려진 장비의 다른 기기로 교체하는 것입니다. 또는 신호 발생기를 사용하여 전자 부품의 성능을 하나씩 확인하십시오.
그러나 아마도 전기생리학자가 직면한 가장 일반적인 기술적 문제는 소음을 녹음하는 문제일 것입니다. 광범위하게, 노이즈 기록은 주어진 자극에 대한 직접적인 뉴런 반응 이외의 관찰된 전기적 활동입니다. 플라이 준비가 적절하게 수행되면 매우 안정적이기 때문에 관찰된 노이즈(응답의 자연스러운 가변성을 넘어서)는 대부분 녹음 장비의 접지 루프에서 발생하거나 근처의 전기 장치에서 포착됩니다. 이러한 소음은 일반적으로 50/60Hz 주전원 윙윙거리는 소리와 그 고조파입니다. 그러나 때로는 더 복잡한 파형으로 구성됩니다. 노이즈의 원인을 파악하려면 설정에서 플라이 준비 홀더를 제거하고 플라이 링거 한 방울을 통해 기록 및 기준 전극을 연결하고(또는 작은 링거 용액 수조에 넣습니다. 1.2.6단계 참조) CC 또는 브리지 모드에서 신호를 녹음합니다. 기록된 신호에서 노이즈가 관찰되는 경우 이는 노이즈가 플라이 준비 외부에 있음을 의미할 수 있습니다.
노이즈의 원인을 식별하기 위한 또 다른 좋은 테스트는 전극 홀더를 증폭기에 연결된 전기 셀 모델로 교체하는 것입니다. 이상적으로 구성되고 접지된 설정에서 기록된 신호는 이제 실질적으로 노이즈가 없어야 하며 AD 컨버터의 확률론적 비트 노이즈만 표시해야 합니다(가장 좋은 경우에는 그것조차도 아닙니다!). 소음이 여전히 존재하면 모든 장비 장비가 제대로 접지되었는지 다시 확인하십시오. 접지 루프를 감지하는 편리한 접근 방식은 (i) 장비 내의 모든 부품에서 모든 접지선을 분리하는 것입니다. (ii) 이 작업을 수행한 후 모든 단일 부품이 실제로 저항계를 사용하여 접지에서 절연되어 있는지 확인합니다. (iii) 장비를 통하지 않고 부품을 하나씩 중앙 접지에 직접 연결합니다. 장비 구성도 변경해 보십시오. 예를 들어, 컴퓨터와 모니터를 장비에서 더 멀리 이동하면 소음을 줄일 수 있습니다. 그러나 다른 경우에는 장비 랙 내부로 컴퓨터를 이동하면 소음이 줄어듭니다. 주변 장비의 플러그를 뽑아 소음이 감소하는지 확인하거나 추가 구성 요소를 보호하는 것도 좋습니다. 또한 녹음 장비의 다른 구성 요소, 특히 BNC 케이블(접지 연결에 결함이 있을 수 있음)을 분리하거나 교체해 보십시오. 셀 모델을 사용할 때 비트 노이즈만 관찰되는 경우 초기 노이즈 소스는 전극 또는 플라이 준비 자체입니다. 예를 들어, 기준 전극이 부주의하게 머리 캡슐 내부의 운동 신경 또는 활성 근육 섬유에 닿고 있을 수 있습니다(또는 흉부에 있는 경우 비행 근육을 방해합니다). 일반적으로 파리의 손상을 최소화하기 위해 주의를 기울여 기록을 위해 새 파리를 준비하는 것이 가장 간단합니다. 그러나 노이즈가 지속되고 광대역이라면 전극이 실험에 적합하지 않을 가능성이 높습니다. 너무 날카롭거나 미세하거나(따라서 너무 시끄럽거나) 목적에 맞지 않습니다. 우리는 심지어 안테나 역할을 하는 석영 전극이 희미한 방송 신호를 포착하는 것을 보았습니다! 특정 세포 유형에서 일관된 고품질 기록을 위해 올바른 미세 전극을 생성하기 위해 풀러 기기 매개변수 설정을 반복하는 데는 많은 노력이 필요할 수 있지만 그만한 가치가 있습니다. 기록 전극이 실험에 맞게 잘 조정되면 뛰어난 품질의 오래 지속되는 기록을 제공할 수 있습니다.
날카로운 미세전극 기록 기술은 곤충 눈과 뇌의 상이한 처리 층을 포함하여 다양한 준비에서 신경 정보 처리를 연구하는 데 유사하게 적용될 수 있습니다43,44. 미세 전극 팁은 매우 미세하게 만들 수 있기 때문에 일반적으로 대부분의 패치 클램프 응용 분야보다 연구 대상 셀의 손상이 적습니다. 중요한 것은 최신 샘플 앤 홀드 미세 전극 증폭기가 팁의 전기적 특성을 잘 제어할 수 있다는 것입니다40,45-47. 따라서 올바르게 적용되면 이 기술은 밀리초 미만의 해상도에서 높은 신호 대 잡음비로 생체 내3,5,7-10,44 또는 시험관 내48 제제 모두에서 신뢰할 수 있는 데이터를 제공할 수 있습니다. 이러한 정밀도는 더 시끄럽고 느린 오늘날의 광학 이미징 기술로는 불가능합니다. 또한, 이 방법은 전류 및 전압 클램프 구성5,29,33,36,40-42,49 모두에서 소형 셀의 전기막 특성을 특성화하는 데 사용될 수 있으며, 실험을 이론과 연결하는 생물물리학 및 경험적 모델링 접근방식 7,8,11,33,49-54 에 귀중한 데이터를 제공합니다.

초파리 (Drosophila의 melanogaster의) 화합물의 눈은 신경 이미지 샘플링 및 처리를위한 광 수용체 및 interneuron 배열의 기능적 조직을 조사 할 수있는 좋은 모델 시스템이며, 동물 비전. 시스템은 가장 완벽한 배선도 1,2-을 가지며 유전자 조작 및 3-10 (높은 신호 - 대 - 잡음 비율 및 시간 해상도) 정확한 신경 활동 모니터링에 호감이다. 초파리의 눈은 함께가 머리 주위 거의 모든 방향을 커버하는 탁 트인 시야 비행을 제공 ommatidia, 개안라고 ~ 750 겉으로는 일반 렌즈 덮인 구조를 포함하는 모듈이다. 단위는 rhabdomeric 광 수용체 7,8,11 있습니다 샘플링 눈의 주요 정보를 제공합니다. 각 개안은 같은면 렌즈를 공유하지만, 일곱 가지 방향으로 정렬됩니다 팔 광 수용체 세포 (R1-R8)를 포함한다. 외부 광 수용체 R1-R6 아칸소 동안전자 파란색 - 녹색 빛에 가장 민감, 같은 방향으로 서로 지점의 상단에 거짓말 내부 세포 R7과 R8의 스펙트럼 감도, 전시 세 가지 독특한 하위 유형이 : 창백한 노란색과 지느러미 가장자리 영역 (DRA) 12 15. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig1.jpg" /> 그림 1. 초파리 눈의 기능 조직. (A) 두 최초의 광학 신경, 망막과 얇은 판은 플라이 눈 안쪽 회색으로 강조 표시됩니다. 망막 R1-R6의 광 수용체와 얇은 대형 모노 폴라 셀 (중저 소득 : L1-L3)는 기존의 날카로운 미세 전극 녹음에 생체 내에서 쉽게 액세스 할 수 있습니다. 개략적 전극 망막 R1-R6에서 기록하는 정상 경로를 강조한다. 라미에 중저 소득 국가에서 기록하는 하나의 경로는 왼쪽으로 평행 전극으로 이동하는 것입니다. (B)는 얇은 판 retinotopically 기관의 행렬시각적 공간에서 특정 작은 영역에서 정보를 처리하는 신경 세포들이 즐비 각각화된 카트리지. 신경 중첩으로 인해, 다른 이웃 ommatidia, 개안로부터 6 광 수용체는 L1-L3와 무 축삭 세포 (암)에 히스타민 출력 시냅스를 형성, 동일한 라미 카트리지에 자신의 축삭 (R1-R6)를 보낼 수 있습니다. (C) R1-R6 엑손 단자와 라미 카트리지 복잡한 내부 (L4, L5, Lawf, C2, C3 및 T1 포함) 사이의 interneurons 시각 신경 정보의 확산. (D) R1-R6의 광 수용체의 축삭은 L2 및 L4 극성 세포에서 시냅스 피드백을받을 수 있습니다. 리베라 - 알바 등의 알 2에서 수정 (B)와 (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 초파리의 눈은 신경 중첩 형 (16)이다. 이 t를 의미한다라미와 수질 : 모자는 공간에서 같은 지점에서 볼 ommatidia, 개안 이웃 일곱에 속하는 여덟 광 수용체의 신경 신호는 다음 두 neuropils 한 신경 카트리지에서 함께 풀링됩니다. 여섯 외부 광 수용체 라미에 신경 컬럼에 자신의 축삭 단자 R1-R6 프로젝트 (그림 1), R7 및 R8 세포는이 계층을 무시하고 자신이 수질 열 17-19 대응 시냅스 접촉을하는 동안. 이러한 정확한 배선은 모든 얇은 판 (도 1A-C) 그러자, 비행 초기 비전의 retinotopic 매핑에 대한 신경 기판을 생산하고 수질 열 (카트리지) 공간에서 하나의 지점을 나타냅니다. 라미 1,2,20에서와 무 축삭 세포 (암) : R1-R6의 광 수용체에서 직접 입력은 대형 모노 폴라 셀 (L1, L2 및 L3 중저 소득)에 의해 수신된다. 이 중, L1 및 L2 주요 정보 경로 (그림 1D)를 매개하는 가장 큰 세포는, WHI 있습니다채널의 응답은 온 및 오프 에지를 이동함으로써, 움직임 검출부 (21, 22)의 계산 근거를 형성한다. L2 세포 23, 24의 L1에에 전면 후면 및 전면에서 후면 : 행동 실험은 중간 반면에, 두 개의 경로가 반대 방향의 모션 인식을 용이하게 제안합니다. 연결은 또한 L4 뉴런 이웃 카트리지 (25, 26) 사이의 측 방향 연통 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 의미한다. 상호 시냅스는 L2 및 L4 동일한에있는 세포와 두 개의 인접한 카트리지 사이에 발견되었다. 다운 스트림, 각각의 L2 셀과 세 개의 관련 L4 세포가 공통의 목표에 자신의 축삭 프로젝트, 이웃 카트리지에서 입력이 생각하는 수질에있는 TM2 신경 세포는 전후 운동 (27)의 처리를 위해 통합 될 수 있습니다. L1 신경 세포가 모두 갭 접합과 시냅스를 통해 동일한 카트리지 L2S에서 입력을받을 수 있지만, 그들은 직접 L4s 따라서 인접 라미 카트리지에 연결되어 있지 않습니다. <p클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; R1-R6의 광 수용체의 축색 돌기에 시냅틱 피드백은 L2 / L4 회로에 속하는 뉴런 만 제공 아니라 L1 경로의 1, 2 (그림 1D). 같은 카트리지 연결이 R1과 R2에 L2로부터 L4에서 R5에 선택적으로있는 동안, 모든 R1-R6의 광 수용체 중 하나의 L4 또는 둘 모두 이웃 카트리지에서 시냅스 피드백을받을 수 있습니다. 또한, R1, R2, R4 및 R5로 오전 강한 시냅스 연결이 있고, 신경교 세포는 시냅스 네트워크에 연결되어 있으므로 신경 화상 처리부 (6)에 참가할 수있다. 마지막으로, 얇은 판에서 R1-R6 및 R6 및 R7 / R8 사이의 광 수용체 이웃 연결 축삭 갭 접합은, 각 카트리지 14,20,28에서 비대칭 정보의 표현 및 처리에 기여한다. 거의 그대로 초파리에서 개별 광 수용체 및 시각의 interneurons에서 세포 내 전압 녹음은 높은 신호 대 잡음 연구를 제공연결된 뉴런 사이의 빠른 신경 계산의 의미를 만들기 위해 필요한 서브 밀리 초 해상도 3,5,7-10,29,에서 다음 페이지에 계속 데이터. 100 밀리 초 해상도 - 정밀도 수준은 상당히 잡음이 있고 일반적으로 10으로 동작 전류 결상 기술에 의해 불가능하다. 전극은 매우 작고 날카로운 팁을 가지고 있기 때문에 또한,이 방법은 세포 기관에 한정되지 않고, 작은 활성 신경 구조의 직접 기록을 제공 할 수있다; 이러한 패치 클램프 전극의 훨씬 더 큰 팁에 액세스 할 수없는 중저 소득 &#39;수지상 나무 또는 광 수용체의 축색 돌기, 등. 중요한 것은,이 방법은 또한 대부분의 패치 클램프 애플리케이션보다 덜 침습적 구조적 손상이기 때문에 적은 연구 세포의 세포 내 환경 정보 샘플링에 영향을 미친다. 따라서, 기존의 날카로운 미세 기술이 기여하고, 신경 INFOR으로, 근본적인 발견과 원래의 통찰력을 기여 계속했다적절한 시간 규모 메이션 처리; 비전 3-10 우리의 기계론의 이해를 향상시킬 수있다. 초파리 R1-R6의 광 수용체 및 중저 소득 국가에서 생체 세포 내 녹음에 Juusola 실험실에서 수행하는 방법이 문서에서는 설명합니다. 이 프로토콜은, 적절한 전기 생리학 장비를 구성하는 방법에 대해 설명 비행을 준비하고 녹음을 수행합니다. 일부 대표 데이터를 제시하고, 몇 가지 일반적인 문제와 잠재적 인 솔루션은이 방법을 사용할 때 발생 될 수있는 논의된다.

<table><tbody><tr><td>플라이 준비를 위한 스테레오 줌 현미경</td><td>Olympus</td><td>SZX12 DFPLFL1.6x PF 접안렌즈: WHN30x-H/22</td><td>긴 작동 거리로 ~150X 배율 가능; 맞춤형 무거운 강철 테이블 마운트 스탠드</td></tr><tr><td>세포 내 설정 및 중간 점의 실체 현미경</td><td>; &nbsp; 올림푸스</td><td>올림푸스 SZX7; 접안렌즈: WHN30x-H/22</td><td>30X 접안렌즈는 작은 각막 구멍을 통해 전극을 눈으로 밀어 넣을 때 전극 팁 반사를 잘 보기 위해 필요합니다.</td></tr><tr><td>니콘 현미경</td><td>니콘 SMZ645; 접안렌즈: C-W30x/7</td><td></td><td></td></tr><tr><td>진동 방지 테이블</td><td>Melles Griot</td><td>브레드보드에 미터법 M6 구멍이 있습니다.</td><td>당사의 맞춤형 리그에는 두꺼운 브레드보드를 통해 뚫린 큰 구멍이 있어 아래에서 플라이 준비 플랫폼 기둥(전자 장치가 있는 구리 방열판이 있음)을</td></tr> 통해 <tr><td>Newport</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulators</td><td>Narishige Narishige</td><td>NMN-21</td><td>당사의 세포 내 설정에서는 shap 기록 전극을 플라이 아이로 구동하기 위해 다양한 미세 조작기 시스템이 사용됩니다. 나열된 모든 매니퓰레이터는 초파리 광수용체와 LMC로부터 오래 지속되는 안정적인 기록을 성공적으로 제공하고 있습니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>Huxley, Bertram,</td><td>Huxley, xyz 축, 미세 수동 제어</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sensapex</td>, <td>Sensapex 삼중 축</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M &auml; rzh&auml; 사용자</td><td>M&auml; rzh&auml; 추가 x축 피에조 스테퍼 및 MS 314 컨트롤러</td><td></td><td></td>사용자 DC-3K</tr><tr><td>자기 스탠드</td><td>켜짐/꺼짐 스위치가 있는 모든 자기 기반이 가능합니다</td><td></td><td>. 예를 들어, 패러데이 케이지 내부의 케이블을 관리하기 위해</td></tr><tr><td>전극 홀더</td><td>하버드 장치</td><td>ESP/W-F10N</td><td></td></tr><tr><td>실버 와이어</td><td>세계 정밀 기기&nbsp;</td><td>AGW1510</td><td>직경 0.3 - 0.5 mm; 전극 홀더에 대해 염소화 필요</td></tr><tr><td>광섬유 광원</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>광섬유 번들을</td> 포함한 다양한 기술 Cardan 암 시스템에 LED 광 자극을 전달하기 위해 <td>UltraFine Technology</td><td></td><td>. 우리는 액체 및 석영 라이트 가이드 (UV에서 IR까지의 범위)를 모두 사용합니다 Thorn</td></tr> <tr><td>Labs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fly Cathing Tube</td><td></td><td>P80-50P 50ml Cent. Tube PP., 100 개 팩</td><td>50 ml 플라스틱 원심 분리기 튜브에서 원뿔형 바닥을 잘라 내고 그 위에 1 ml 피펫 팁을 붙입니다.</td></tr><tr><td>디지털 수집 시스템</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>단일 전극 전류 / 전압 클램프 미세 전극 증폭기</td><td>npi SEC-10LX</td><td>http://www.npielectronic.de/products/amplifiers/sec-single-electrode-clamp/sec-10lx.html</td><td>뛰어난 성능!</td></tr><tr><td>헤드 스테이지</td><td>표준 (+/- 150 nA)</td> <td>npi SEC-10LX</td><td></td></tr><tr><td>LED 광원 및 드라이버</td>용 <td>2-채널 OptoLED (Cairn Research Ltd., 영국)</td><td></td> <td>우리의 stimulus 시스템 중 많은 부분이 자체 구축되어 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>자체 설계 및 구축</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>수집 및 분석 소프트웨어</td><td>많은 회사들이</td> Biosyst에서 <td></td> 선택할 수 있습니다<td>; Juusola 실험실에서의 실험 및 이론적 작업을 위한 맞춤형 Matlab 기반 시스템</td></tr><tr><td>개인용 컴퓨터 또는 Mac</td><td></td><td></td><td>PC 또는 Mac이 데이터 수집 시스템 및 소프트웨어와 호환되는지 확인</td></tr><tr><td>Cardan arm 시스템&nbsp;</td><td>자체 설계 및 제작</td><td></td><td>빛 자극의 정확한 x, y, z 위치</td></tr><tr><td>제공 펠티에 온도 제어 시스템&nbsp;</td><td>자체 설계 및 시공</td><td></td><td></td></tr><tr><td>패러데이 케이지</td><td>자체 제작</td><td></td><td>전자기 노이즈 차폐</td></tr><tr><td>필라멘트 붕규산 유리 모세 모세 피아노</td><td></td><td>외경 : 1mm</td><td></td></tr><tr><td>내경 : 0.5 - 0.7 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>필라멘트 석영 유리 모세 모세</td><td></td> 피아노 <td>외경 : 1mm</td><td></td></tr><tr><td>내경 : 0.5 - 0.7mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫 풀러</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>모델 P-2000 레이저 화염/갈색 마이크로피펫 풀러</td><td>붕규산 참조 전극의 경우 사전 설정 프로그램 #11(패치 전극)을 사용하십시오. 열 = 350; 필라멘트 = 4; 속도 36; 지연 = 200).1.2.1). 붕규산 기록 전극의 경우, 사전 설정 프로그램 #12를 사용하십시오(이것은 일반적으로 광수용체 기록의 경우 좋은 기존 sharps를 가져옵니다): 열 = 355; 필라멘트 = 4; 속도 50; 지연 = 225; 풀 = 150. 더 미세한 팁이 있는 전극이 필요한 LMC 녹음의 경우 이러한 값을 조정해야 합니다. 석영 모세관을 당기기 위해 P-2000 설명서는 미세한 팁 미세 전극에 대한 프로그램을 제안합니다. 이러한 프로그램' 사전 설정된 매개변수는 침투 성공률이 우수하고 녹음 노이즈가 낮은 전극을 생성하기 위한 체계적인 수정을 위한 유용한 시작점 역할을 합니다.</td></tr><tr><td>Fisher Scientific</td><td>10326390, NaCl 10010310, KCl 10147753, TES 10161800, CaCl2 10159872, MgCl2 10000430, 자당</td>의 <td>기준 전극 화학 물질에 대한 세포 외 링거 용액</td><td>Fisher</td></tr><tr><td>Scientific</td><td>10010310, KCl</td><td></td>Petroleum jelly Vaselin<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>의 필라멘트 기록 미세전극 염을 채우기 위한 프로토콜 섹션 3 M KCl 용액의 레시피를 참조하십시오.스테인리스 스틸이 아닌 면도날</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>블레이드 홀더/브레이커</td><td>Fine Science Tools By Dumont</td><td>10053-09</td><td>9 cm</td></tr><tr><td>Blu-tack</td><td>Bostik</td><td></td><td>또는 몰딩 클레</td></tr>이 <tr><td>집게</td><td>Fine Science Tools By Dumont</td><td>11252-00</td><td>#5SF (초미세 팁)</td></tr>을 사용하십시오.</tbody></table>

의 기록 세포 내 전압 응답에 대한 전기 생리 방법<em&gt; 초파리</em&gt; 빛 자극에 광수와의 interneurons<em&gt; 생체</em

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

곤충 광수용체와 시각 중간뉴런의 전압 반응은 기존의 날카로운 미세전극으로 정확하게 기록될 수 있습니다. 여기에 설명된 방법을 통해 조사자는 단일 초파리 R1-R6 광수용체 및 대형 단극 세포(LMC)에서 광 자극에 대한 오래 지속되는(몇 분에서 몇 시간까지) 고품질 세포 내 반응을 측정할 수 있습니다. 기록 시스템은 노이즈가 적기 때문에 플라이 아이의 개별 세포 간의 가변성과 그 출력이 시각 환경의 물리적 특성을 어떻게 반영하는지 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술을 수행하는 데 필요한 모든 주요 단계를 간략하게 설명합니다. 실험 장비의 설계 및 선택과 같은 기록을 위한 적절한 전기생리학 설정을 구성하는 기본 단계에 대해 설명합니다. 또한 적절한(날카로운) 기록 및 (무딘) 기준 전극을 만들어 기록을 준비하는 방법에 대해서도 설명합니다. 맞춤형 플라이 홀더에 온전한 파리를 고정하고, 눈에 작은 창을 준비하고, 손상을 최소화하면서 이 구멍을 통해 녹음 전극을 삽입하는 방법에 대한 세부 정보가 제공됩니다. 세포의 수용 영역의 중심을 지역화하고, 연구된 세포를 어둡거나 밝게 조정하고, 동적 광 자극에 대한 전압 반응을 기록하는 방법을 설명합니다. 마지막으로, 안정적인 정상 기록의 기준을 설명하고, 다양한 광 자극에 대한 개별 세포의 특징적인 고품질 전압 반응을 보여주고, 신호 전달 성능을 정량화하는 방법을 간략하게 정의합니다. 이 방법의 많은 측면은 기술적으로 까다로우며 마스터하려면 연습과 인내가 필요합니다. 그러나 일단 학습되고 연구자의 실험 목표에 최적화되면 뛰어난 생체 내 신경 생리학적 데이터를 얻을 수 있습니다.

초파리 눈 여기 구성된 같이 날카로운 미세 기록 방법은, 확실하게 그들 사이 4,5,7,8,10,33 신경 정보의 샘플링 처리 망막 및 점막 세포와의 통신을 정량화하는데 사용될 수있다. 다른 야생형 주식, 돌연변이 또는 유전자 조작 플라이 균주 인코딩 공부를 사용함으로써,이 방법은 그 값을 입증되었다; 뿐만 아니라 변이, 온도, 다이어트 또는 선택된 발현 3,4,6,9,10,14,30,34의 효과를 정량화 할뿐만 아니라 변경된 시각적 행동 14, 34에 대한 역학적 원인을 공개한다. 상기 방법은 또한 neuroethological 비전 연구를 실어 다른 곤충 제제 (35, 36)에 용이하게 적용될 수있다. 다음에 우리는 성공적인 응용 프로그램의 몇 가지 예를 소개. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig7.jpg" /> 그림 7. 전압빛 (20)의 펄스와에 과일 플라이 R1-R6 광 수용체의 응답 (25) 오 날카로운 미세 관통은 종종 매우 안정적이기 때문에 C.,에서 주어진 빛 자극에 동일한 R1-R6의 광 수용체의 전압 응답을 기록 할 수있다 온난화 또는 즉시 냉각하여 다른 주위 온도. 우리의 셋업에서, 파리 홀더 가까운 루프 펠티에 소자 기반의 온도 제어 시스템에 배치됩니다. 이 초 파리의 헤드 온도를 변경하는 우리를 할 수 있습니다. 높은 온도는 전압 응답을 가속화하고 특징적으로 (빨간색 화살표로 표시된 바와 같이) R1-R6의 광 수용체의 휴식 가능성을 낮춘다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 광 수용체 출력에 온도의 효과를 공부 O를 C (그림 7)에서 동일한 R1-R6의 광 수용체에 기록 밝은 10 밀리 긴 펄스에 전압 응답을 보여줍니다. 4,9 전에 정량으로, 온난화는 어둠 속에서 감광체의 휴식 가능성을 낮추고, 그 전압 응답을 가속화합니다. <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig8.jpg" /> 그림 8. 시그널링 성능 과일 플라이 R1-R6 광 수용체는 빛의 강도와 개선 (A) 시각 출력 (아래) 어둡게하고 밝은. (위의 10,000 배 밝은 빛) 같은 미세 전극에 의해 기록 자연 빛의 강도의 시계열을 반복20 O C.에서 같은 셀 그들은 더 많은 샘플, 단일 광자 4,5,7,8에 대한 기본 응답 (범프)를 통합하기 때문에 밝은 자극에 대한 반응이 크다. (B) 20 연속 1 초 동안 전압 응답이 중첩된다. 개별 응답 (밝은 회색) (A에서 화살표) 적응 동향 후 찍은 것은 (A에서 점선 상자) 물러했다. 대응하는 응답 수단 (신호)는 어두운 흔적이다. 신호 및 각 응답의 차이는 잡음이다. (C) 세포를 표준 방법을 사용하여 4,5,7,8 신호대 잡음비 (SNR) &#39;시그널링 성능은 기록에 의해 정량 하였다.&#39; 광 수용체 출력들과 함께 &#39;(20 Hz에서 최대, 중국식 ≥1 SNR) 희미한보다 (밝은 ≥1, 최대 84 Hz의 밝은 자극에 안정적인 신호의 약 64 Hz의 넓은 범위의 SNR)&#39;이있다ignal 잡음비 크게 개선; SNR 중국식 MAX = SNR 밝은 MAX 87 = 1868에서. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 반복적 인 자극에 의해 적응과 신경 인코딩 공부 망막과 얇은 판 구조에서 상대적으로 적은 손상을 일으키는 방법의 비 침습적은 생체 내에서 자신의 근처의 자연 생리 학적 상태에서 다른 빛의 자극에 개별 세포의 신호 전달 성능을 공부에 이상적이다. 8 쇼에게 R1-의 전압 응답도 20 O C에서 희미하고 밝은 반복 자연 빛의 강도의 시계열 자극에 대한 R6의 광 수용체, 그림 9 반면, </strong는&gt; 25 오 C.에서 다른 자연 자극에 다른 R1-R6의 광 수용체와 LMC의 응답을 보여줍니다 동일한 플라이 두 예리한 마이크로 전극, 망막 하나 라미의 다른 세포에 의해 동시 기록이 가능한 30하기에는 너무 곤란하기 때문에 사전 및 시냅스 기록은 두 개의 다른 플라이에서 별도로 수행 하였다. <img alt="그림 9" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig9.jpg" /> 25 오 C. (A) (회색) R1-R6와 LMC (검정)에서 반복 자연주의 자극에 과일 플라이 R1-R6 광 수용체와 LMC 그림 9. 전압 응답은 다른 파리와 다른 미소 전극에 의해 기록 된 출력한다. (B) 빛에 표시된 어느 정도의 빛 적응 20 연속 전 (위) 및 개별 응답과 같은 자연 자극 패턴 시냅스 (아래) 응답을 회색어두운 트레이스로서 D 대응하는 응답 수단 (신호). 신호 및 각 응답의 차이는 잡음이다. (C) 세포의 신호대 잡음비 (SNR) &#39;시그널링 성능은 기록에 의해 정량 하였다.&#39; LMC 출력 &#39;(최대 94 Hz의에 R ≥1, SNR) R1-R6 출력보다 (104 Hz에서 최대 LMC ≥1, SNR)&#39;신뢰할 수있는 신호의 약 10 Hz의 넓은 범위를 가지고있다. 두 신호 - 대 - 잡음 비율 (SNR LMC MAX = 142 SNR R MAX = 752) 높고, 기록 노이즈가 낮고 같은 차이점은 셀 간의 실제 인코딩 차이를 반영한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig9large.jpg" target="_blank">더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요 이 그림.</a> 자극 발병 후, 녹음 전형적인LY 빠른 크게 5 ~ 6 초 이내에 가라 동향을 적응 보여줍니다. 그때부터, 세포를 각 1 초 긴 자극 프레 젠 테이션에 매우 일관된 응답 (각 점선이 20을 둘러싸)을 생산하고 있습니다. 이 (그림 8B 및도 9b)를 중첩 할 때 응답의 반복은 분명해진다. 개별 응답은 얇은 회색 추적하고, 자신은 두꺼운 어두운 추적을 의미한다. 신경 노이즈 평균과 각 응답 4,5,9,37,38 차이 인 반면, 평균 응답은 신경 신호로한다. 주파수 영역에서 각각의 신호 - 대 - 잡음비 (도 8c 및도 9c)는 파워 스펙트럼으로 신호 및 잡음 데이터 청크를 푸리에 변환하고, 대응하는 평균 잡음 전력 스펙트럼 4 평균 신호 전력 스펙트럼을 나눔으로써 얻어졌다 5,9,37,38. 특징적으로, 최대 신호대 잡음비 O자연 자극 기록 신경 출력 (100 - 1000) &gt;&gt; f를 높은 값에 도달 할 수 있고, 매우 낮은 기록 노이즈 가장 안정한 제제 1,000 (예를 들면,도 8c.). 공지 사항은 또한 온난화는 세포 확장 &#39;신호 신뢰성의 대역폭을 4 (SNR&#39;밝은 ≥ 1); 예를 들어,도 8 및 9 개의 R1-R6s 사이의 상대적인 차이는 각각 10 헤르츠 (Hz 84 20 O C 및 94 Hz에서 25 ℃로)이다. 하나는 상기 샤논 수학 식 32를 사용하여 또는 트리플 외삽 법 (39)을 통해 응답 &#39;엔트로피 노이즈 엔트로피 율의 차이를 산출하여 신호대 잡음비의 정보 전송의 각 셀의 속도를 추정 할 수있다. 더 많은 정보 이론적 분석에 대한 세부 사항 및 사용 제한특히이 방법으로 이전 출판물 7,8,39에 나와있다 s의. <img alt="그림 10" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig10.jpg" /> 19 오 C. (A) R1-R6 (회색)와 LMC (블랙) 같은 파리에서 같은 미세 전극에 의해 기록 된 출력에서 반복 자연주의 자극에 킬러 플라이 R1-R6 광 수용체와 LMC 그림 10. 전압 응답; 전극이 눈에 진행되었을 때 이후 시냅스 처음 postsynaptically 및. 같은 자연 자극 패턴 (B) (위) 20 연속 사전 및 시냅스 (아래) 응답 (밝은 회색 추적)이 초기 적응 (A에서 점선 상자) 후 촬영 하였다. 각각의 응답에 각각의 차이는 노이즈를 제공하면서 그들의 수단은 신호 (상단에 어두운 흔적을)입니다. (C) 해당 시그나L 잡음비 (SNR)는도 8c 및도 9c에 다음과 같이 계산 하였다. LMC 출력 &#39;(134 Hz에서 최대 R MAX ≥1 SNR) R1-R6 출력 이상 (최대 234 Hz의에 LMC MAX ≥1, SNR)&#39;신뢰할 수있는 신호의 100 Hz의 넓은 범위에 대해이 있습니다. 두 신호 - 대 - 잡음 비율 (SNR LMC MAX = 137 SNR R MAX = 627) 높고, 동일한 미세이 녹음에 사용 된 바와 같이, 그 차이가 사전 및 시냅스 신경 출력에서 실제 차이를 반영한다. 이러한 결과는 기록 시스템이 낮은 노이즈가 있고, 분석에 미치는 영향이 한계였다. 것을 의미하는 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig10large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> Neuroethological 비전 연구 </p&gt; 상기 방법은 또한 시각적 정보 처리 neuroethological 비교 연구를 허용하는 다른 곤충 7,8,35,36 종의 화합물의 눈 (도 10)의 사전 및 시냅스 전압 응답을 기록하는데 사용될 수있다. 제시된 기록 시스템의 경우, 필요한 유일한 적응은 연구 종에 대한 적절한 크기의 구멍을 가진 새로운 준비 홀더, 각이다. 이 예시적인 기록은 여성 킬러 비행 (Coenosia의 attenuata)의 출신. 이들은도 9에 대응 초파리에서 사용 된 것과 동일한 반복 광 자극에 R1-R6 수광부와 LMC 전압의 세포 내 반응을 보여 주지만, 19 ℃에서 O 이 경우, 사전 및 시냅스 데이터 모두 동일한 플라이로 기록되었다; 하나의 제 횡 박판으로 진행 (3 M KCl을 가득) 동일한 기록 전극과, 다른 하나는 이전에 입력 한 후정면 망막을 보내고. 심지어 냉각기 온도 - - 25 O C의 Coenosia 데이터의 초파리 데이터와 비교하여 빠른 반응 역학을 나타낸다 안정적인 신호 (신호 대 잡음비 &gt;&gt; 1)는 넓은 주파수 범위의 범위를 확대. 자연 자극의 신경 인코딩에서 이러한 기능 적응이 빠른 공중 사냥 행동을 달성하기 위해 고정밀 시공간 정보를 필요로 Coenosia의 약탈 라이프 스타일 (36)과 일치한다.

Sharp microelectrodes는 살아있는 초파리에서 광수용체 및 시각 중간뉴런 출력의 정확한 전기생리학적 특성을 가능하게 합니다. 여기에서는 이 방법을 사용하여 제어된 광 자극에 대한 개별 셀의 고품질 전압 응답을 기록하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 곤충 겹눈의 신경 정보 처리를 연구하는 데 이상적입니다.

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

이 절차의 전반적인 목표는 제어된 광 자극에 대한 초파리 광수용체와 시각 중간뉴런의 세포 내 전기 반응을 기록하는 것입니다. 이 방법은 광 자극이 어떻게 반응 중 하나로 인코딩되는지, 또는 시각적 정보와 광수용체 및 인터뉴런이 광 자극에서 어떻게 추출되는지와 같은 신경 코딩 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포 내 환경 및 정보 샘플링에 대한 손상이 거의 없이 연구에서 오래 지속되는 고품질 녹음을 제공한다는 것입니다.이것이 영향을 미칠 수 있는 시연의 기능은 다양한 단계를 않고 올바르게 수행하는 방법을 배우기 어렵기 때문에 중요합니다. 표준 피펫 풀러를 사용하여 필라멘트 붕규산염 또는 석영 유리 튜브에서 기준 미세전극을 당깁니다. 짧고 점진적인 테이퍼를 달성하십시오.정확한 설정은 기기마다 다릅니다. 끝부분의 기공 크기는 실험을 위해 파손되기 때문에 중요하지 않습니다. 그런 다음 동일한 유리관에서 기록 전극을 당겨 10-15mm 길이의 미세한 점진적 테이퍼를 얻으십시오.광학 현미경에서 여러 접착제가 있는 유리 면에 전극을 장착하고 40x 공기 대물렌즈를 사용하여 팁을 검사합니다. 좋은 전극은 눈에 보이지 않을 정도로 작은 팁으로 부드럽게 가늘어지며, 그 주위에서 연속적인 평행, 더 어둡고 가벼운 간섭 패턴을 볼 수 있습니다. 실험 직전에 입자 필터에 연결된 5ml 주사기를 사용하여 미세한 플라스틱 팁으로 기준 전극을 플라이 링거로 다시 채웁니다.광수용체 실험의 경우, 큰 말단에 물방울이 형성될 때까지 기록 전극에 3몰 염화칼륨을 로드합니다. 이렇게 하면 녹음하는 동안 액체 접합부로 인한 소음이 최소화됩니다. 히스타민성 LMC로 작업하려면 기록 전극을 3몰 아세트산 칼륨, 0.5 밀리몰 염화칼륨으로 채워 세포의 염화물 배터리에 미치는 영향을 최소화합니다.5일에서 10일 된 파리를 신선한 파리 바이알에 넣는 것으로 시작합니다. 어린 파리는 더 연약하지만 기록할 수 있습니다. 전기생리학을 위한 첫 번째 플라이를 선택합니다.몸집이 큰 암컷은 함께 일하기 가장 쉽습니다. 캐칭 튜브에 있을 때, 파이펫 팁으로 위쪽으로 올라가 더 작은 팁을 덮는 타고난 경향을 활용하십시오. 다음으로, 유연한 플라스틱 호스가 있는 100ml 주사기를 피펫 팁에 연결하고, 피펫 팁은 초파리가 통과할 수 있도록 확대되고 다른 쪽 끝을 플라이 홀더에 부착된 큰 피펫 팁에 연결합니다.그런 다음 주사기에서 소량의 공기를 짜서 플라이 홀더로 플라이를 배출합니다. 실체 현미경을 통해 보고 파리의 머리가 플라이 홀더의 원뿔형 끝에서 튀어나올 때까지 더 많은 공기를 부드럽게 투여합니다. 파리가 흉부에 단단히 갇혀 있는지 확인하십시오.그런 다음 밀랍으로 파리를 고정합니다. 왁스 히터의 가장 낮은 온도를 사용하여 왁스를 깨끗하게 녹이면 투명하게 보입니다. 너무 뜨거우면 왁스가 타버립니다.각막을 피해 주둥이와 오른쪽 눈가에 약간의 밀랍을 발라 파리의 머리를 고정시킵니다. 이 두 점을 플라이 홀더에 고정하십시오. 파리가 타지 않도록 이 단계를 빨리 완료하십시오.다음으로 고글을 착용하고 마이크로 나이프를 제작합니다. 스테인리스 스틸이 아닌 면도날에 두 개의 플랫 그립 블레이드 홀더를 고정하고 날카로운 모서리의 작은 스트립을 깨뜨립니다. 이상적으로는 첨탑을 닮은 면도날처럼 날카로운 모서리를 만드는 것이 좋습니다.이제 신중하고 세심한 주의를 기울여 마이크로나이프를 사용하여 파리의 왼쪽 눈의 몇 개의 오마티디아를 엽니다(예: 눈의 적도 바로 위에 있는 등쪽 표피에서 4-5개의 오마티디아). 이것은 기록 미세전극을 위한 통로를 제공할 것입니다. 이것은 매우 도전적이고 잘 만들어진 칼이 필요하며 연습을 통해 배워야 합니다.그런 다음 구멍에서 작은 각막 조각을 부드럽게 제거하여 아래의 망막을 노출시킵니다. 이제 바셀린 어플리케이터의 가는 털을 사용하여 작은 바셀린 덩어리로 구멍을 빠르게 덮습니다. 젤리는 피펫의 벽내 커패시턴스를 줄이는 추가적인 이점이 있습니다.눈을 번뜨리면 광학 장치가 흐려지므로 피하십시오. 미세 전극을 작동할 때 amp정전기를 방지하기 위해 항상 패러데이 케이지의 금속 표면이나 진동 방지 테이블을 만져 접지하십시오. 장착된 플라이를 플라이 준비 플랫폼 기둥에 고정합니다.플라이의 왼쪽 눈이 조사자를 직접 향하도록 플라이 홀더를 회전합니다. 다음으로, 소형 코스 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 파리의 ocelli를 통해 뭉툭한 참조 전극을 헤드 캡슐에 부드럽게 삽입합니다. 파리가 여전히 건강해 보이고 안테나를 움직여는지 확인하십시오.준비는 녹음할 가치가 있을 만큼 훌륭해야 합니다. 이제 젤리로 코팅된 구멍을 통해 날카로운 기록 미세 전극을 왼쪽 눈으로 밀어 넣습니다. 조직에 들어갈 때 전극 팁 위치는 반사율 패턴으로 분명해야 합니다.깨지기 쉬운 전극 팁은 완벽하게 안내되어야 하며 그렇지 않으면 파손될 수 있으며 이는 매우 어려운 일입니다. 기록되는 세포 유형에 따라 파리의 머리 방향은 약간 달라야 합니다. 전극이 제자리에 있는 상태에서 미세 전극을 켭니다.그런 다음 차가운 광원을 끄고 주전원에서 플러그를 뽑은 다음 중앙 접지에 연결하여 접지 루프로 인한 전기 노이즈를 최소화합니다. 다음으로, Carden 암 시스템이 플라이 주위를 자유롭게 이동할 수 있도록 구즈넥 라이트 가이드를 조정합니다. 그런 다음 실내 조명을 끄고 파리 준비를 비교적 어두운 곳에 두십시오.이제 눈의 기록 전극의 저항을 측정합니다. 100에서 260메가옴 사이여야 합니다. 때때로 팁이 막히고 증폭기의 용량성 버즈 및 전류 펄스 기능을 사용하여 제거할 수 있습니다.그래도 문제가 해결되지 않으면 새 전극을 사용하십시오. 다음으로, 설정 ampliifier를 전류 cl로 설정합니다.amp 또는 브리지하고 전극 사이의 전압을 0으로 설정합니다. 파리가 몇 분 동안 어두워진 후 피에조 스테퍼를 사용하거나 미세 해상도 노브를 부드럽게 돌려 0.1에서 1미크론 단계로 기록 전극 팁을 눈에 밀어 넣습니다.각 단계에서 1-10밀리초의 섬광으로 눈을 자극합니다. 각 표시등이 깜박일 때마다 전압이 잠시 떨어집니다.tage 또는 ERG. 전극 팁이 얇은 판에 들어가 LMC에서 닫히면 ERG가 역전됩니다.그런 다음 측정을 진행합니다. 비침습성으로 인해 개별 세포의 신호 성능을 거의 자연 상태에서 연구할 수 있습니다. 희미하고 밝은 빛에 대한 R1-R6 광수용체에 의한 전압 응답은 섭씨 20도에서 측정되었습니다.다음으로, R1-R6 광수용체를 섭씨 25도의 LMC와 비교했습니다. 각각은 동일한 플라이에서 두 개의 날카로운 미세 전극에 의한 세포 내 기록이 너무 어렵기 때문에 서로 다른 플라이에서 측정되었습니다. 응답의 반복성은 데이터가 중첩될 때 분명해집니다.주파수 영역의 신호 대 잡음비는 신호 및 잡음 데이터 청크를 파워 스펙트럼으로 변환한 다음 평균 신호 파워 스펙트럼을 해당 평균 노이즈 파워 스펙트럼으로 나누는 4년 동안 구했습니다. 그 결과 최상의 준비에서 신호에 매우 민감할 수 있습니다. 이 기술은 많은 종을 기록하는 데 사용할 수 있습니다.코에노시아 파리는 섭씨 19도에서 동일한 자연주의적이고 반복적인 빛 자극을 받았습니다. 데이터는 기록 전극을 전진시킴으로써 동일한 플라이로부터 사전 및 사후 시냅스방식으로 취해졌습니다. 녹음의 빠른 역학은 이 종의 포식성 특성과 일치합니다.일단 마스터링되면 이 기술은 제대로 수행되면 항상 긴 고품질 녹음을 가능하게 합니다. 이 절차를 시도하는 동안 깨닫는 것이 중요합니다, 내 말은 피아노 연주를 배우는 것과 같다는 것입니다. 더 많이 연습할수록 더 나은 결과를 얻을 수 있습니다.이 절차에 따라 약물 개입과 같은 다른 방법을 수행하여 반응을 형성하는 데 있어 신경 조절제의 역할과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 신경 생물 물리학 분야의 연구자들이 광 정보, 캡처 및 전달을 최적화하는 방법과 광 변환 기계 및 다음 생물학에서 부식성 생화학 반응을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 세포 내 실험을 위해 초파리를 준비하는 방법과 광수용체와 중간뉴런에서 신경 반응을 깨우는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

여기 Drosophila의 유충의 신경근육학 교차점에서 시냅스 전송을 측정 electrophysiological 방법을 설명합니다. Evoked 릴리스는 모터 신경의 axons을 자극하여 인공적으로 시작되며, NMJ을 통해 전송은 근육에 evoked postsynaptic 반응에 의해 측정할 수 있습니다.

Drosophila의 애벌레의 NMJ에서 시냅틱 후보를 녹음 Electrophysiological 방법

에 Electrophysiological 녹음 Drosophila 엠브료

이 비디오는 움직이지 못하는 초파리의 눈에서 광수용체 활동의 전기생리학적 기록을 위한 프로토콜을 간략하게 설명하여 광 자극에 대한 반응으로 전압 변화를 정밀하게 측정할 수 있도록 합니다.

빛 자극에 대한 초파리 망막 광수용체의 전압 반응에 대한 전기생리학적 기록

이 비디오는 전체 세포 구성을 설정하여 초파리의 옴마티듐(ommatidium)에 있는 광수용체 뉴런의 전기 활동을 기록하는 방법을 보여줍니다. 이는 광 펄스에 의한 일시적인 수용체 전위 채널의 활성화를 강조하여 측정 가능한 양자 범프를 생성합니다.

Whole-Cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptor(초파리 광수용체의 전체 세포 전압 클램프 기록)

세포 내 기록의 전기 생리 기술 시연과 나비의 화합물 눈에 하나의 광 수용체 세포의 스펙트럼 감도를 결정하는 데 사용됩니다.

에서 곤충 모델에서 시각 세포 스펙트럼 감도의 결정<em&gt; 생체</em&gt; 세포 내 녹음

Drosophila melanogaster photoreceptor의 전체 세포 기록은 다양한 조건 에서 자연스런 어두운 범프, 양자 범프, 빛에 대한 거시적 반응 및 전류 - 전압 관계를 측정 할 수있게합니다. D. melanogaster 유전자 조작 도구와 결합하여이 방법은 유비쿼터스 이노시톨 - 지질 신호 전달 경로와 그 표적 인 TRP 채널에 대한 연구를 가능하게합니다.

전 세포 전압 클램프 기록을위한 전기 생리 학적 방법<em&gt; Drosophila</em&gt; 광 수용체

이 프로토콜 비용 효율적이 고 편리한 약리학 대리인, 신경 단백질의 유전자 돌연변이의 테스트를 가능 하 게 초파리 melanogaster 중앙 신경 시스템의 하강 전기 활동을 기록 하는 방법을 설명 합니다. 또는 미개척된 생리 적인 통로의 역할입니다.

제 3-탈피 초파리 Melanogaster 의 중앙 신 경계 활동의 electrophysiological 녹음

이 프로토콜의 목표는 인간 질병과 관련된 희귀 유전자 변이체의 기능적 결과를 평가하기 위해 Drosophila melanogaster에서 생체 내 실험의 설계 및 성능을 설명하는 것입니다.

Drosophila를 사용하여 질병 관련 희소한 인간 이체의 생체 내 기능적인 연구

우리는 전기생리학적으로 이중 안정한 광안료를 특성화하기 위한 프로토콜을 제시한다: (i) 광자-흡수 및 광수용체에서의 그들의 엄청난 양에 뒤따르는 광안료 분자 내의 전하 변위를 이용하고, (ii) 로돕신과 메타로돕신 광안료 상태의 흡수-스펙트럼 차이를 이용한다. 이들 프로토콜은 이중-안정한 광안료 시스템에 영향을 미치는 돌연변이를 스크리닝하는데 유용하다.

초파리 광수용체에서 광안료 수준을 측정하기 위한 전기생리학적 방법

우리는 촉각과 화학적 단서의 부재에서 행동 시각적 단서의 효과를 연구를위한 두 가지 방법을 개발했습니다. 한 가지 방법은 수족관에서 반사 벽에 왕새우 찍고 답변을 포함, 다른 하나는 투명 파티션 뒤에 살아있는 왕새우가 제공하는 시각 입력의 효과를 검사합니다.

크레이 피쉬에 리플렉션하는 행동 응답 녹음

학습하세요 Drosophila 광수용체와 시각 중간뉴런의 세포내 전기생리학적 반응 기록 방법을. 이 기법은 최소한의 세포 손상으로 고품질 전압 기록을 제공하여 곤충 복합눈의 신경 정보 처리 연구에 적합합니다.

의 기록 세포 내 전압 응답에 대한 전기 생리 방법

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