의 기록 세포 내 전압 응답에 대한 전기 생리 방법 초파리 빛 자극에 광수와의 interneurons 생체

이 절차의 전반적인 목표는 제어된 광 자극에 대한 초파리 광수용체와 시각 중간뉴런의 세포 내 전기 반응을 기록하는 것입니다. 이 방법은 광 자극이 어떻게 반응 중 하나로 인코딩되는지, 또는 시각적 정보와 광수용체 및 인터뉴런이 광 자극에서 어떻게 추출되는지와 같은 신경 코딩 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포 내 환경 및 정보 샘플링에 대한 손상이 거의 없이 연구에서 오래 지속되는 고품질 녹음을 제공한다는 것입니다.

이것이 영향을 미칠 수 있는 시연의 기능은 다양한 단계를 않고 올바르게 수행하는 방법을 배우기 어렵기 때문에 중요합니다. 표준 피펫 풀러를 사용하여 필라멘트 붕규산염 또는 석영 유리 튜브에서 기준 미세전극을 당깁니다. 짧고 점진적인 테이퍼를 달성하십시오.

정확한 설정은 기기마다 다릅니다. 끝부분의 기공 크기는 실험을 위해 파손되기 때문에 중요하지 않습니다. 그런 다음 동일한 유리관에서 기록 전극을 당겨 10-15mm 길이의 미세한 점진적 테이퍼를 얻으십시오.

광학 현미경에서 여러 접착제가 있는 유리 면에 전극을 장착하고 40x 공기 대물렌즈를 사용하여 팁을 검사합니다. 좋은 전극은 눈에 보이지 않을 정도로 작은 팁으로 부드럽게 가늘어지며, 그 주위에서 연속적인 평행, 더 어둡고 가벼운 간섭 패턴을 볼 수 있습니다. 실험 직전에 입자 필터에 연결된 5ml 주사기를 사용하여 미세한 플라스틱 팁으로 기준 전극을 플라이 링거로 다시 채웁니다.

광수용체 실험의 경우, 큰 말단에 물방울이 형성될 때까지 기록 전극에 3몰 염화칼륨을 로드합니다. 이렇게 하면 녹음하는 동안 액체 접합부로 인한 소음이 최소화됩니다. 히스타민성 LMC로 작업하려면 기록 전극을 3몰 아세트산 칼륨, 0.5 밀리몰 염화칼륨으로 채워 세포의 염화물 배터리에 미치는 영향을 최소화합니다.

5일에서 10일 된 파리를 신선한 파리 바이알에 넣는 것으로 시작합니다. 어린 파리는 더 연약하지만 기록할 수 있습니다. 전기생리학을 위한 첫 번째 플라이를 선택합니다.

몸집이 큰 암컷은 함께 일하기 가장 쉽습니다. 캐칭 튜브에 있을 때, 파이펫 팁으로 위쪽으로 올라가 더 작은 팁을 덮는 타고난 경향을 활용하십시오. 다음으로, 유연한 플라스틱 호스가 있는 100ml 주사기를 피펫 팁에 연결하고, 피펫 팁은 초파리가 통과할 수 있도록 확대되고 다른 쪽 끝을 플라이 홀더에 부착된 큰 피펫 팁에 연결합니다.

그런 다음 주사기에서 소량의 공기를 짜서 플라이 홀더로 플라이를 배출합니다. 실체 현미경을 통해 보고 파리의 머리가 플라이 홀더의 원뿔형 끝에서 튀어나올 때까지 더 많은 공기를 부드럽게 투여합니다. 파리가 흉부에 단단히 갇혀 있는지 확인하십시오.

그런 다음 밀랍으로 파리를 고정합니다. 왁스 히터의 가장 낮은 온도를 사용하여 왁스를 깨끗하게 녹이면 투명하게 보입니다. 너무 뜨거우면 왁스가 타버립니다.

각막을 피해 주둥이와 오른쪽 눈가에 약간의 밀랍을 발라 파리의 머리를 고정시킵니다. 이 두 점을 플라이 홀더에 고정하십시오. 파리가 타지 않도록 이 단계를 빨리 완료하십시오.

다음으로 고글을 착용하고 마이크로 나이프를 제작합니다. 스테인리스 스틸이 아닌 면도날에 두 개의 플랫 그립 블레이드 홀더를 고정하고 날카로운 모서리의 작은 스트립을 깨뜨립니다. 이상적으로는 첨탑을 닮은 면도날처럼 날카로운 모서리를 만드는 것이 좋습니다.

이제 신중하고 세심한 주의를 기울여 마이크로나이프를 사용하여 파리의 왼쪽 눈의 몇 개의 오마티디아를 엽니다(예: 눈의 적도 바로 위에 있는 등쪽 표피에서 4-5개의 오마티디아). 이것은 기록 미세전극을 위한 통로를 제공할 것입니다. 이것은 매우 도전적이고 잘 만들어진 칼이 필요하며 연습을 통해 배워야 합니다.

그런 다음 구멍에서 작은 각막 조각을 부드럽게 제거하여 아래의 망막을 노출시킵니다. 이제 바셀린 어플리케이터의 가는 털을 사용하여 작은 바셀린 덩어리로 구멍을 빠르게 덮습니다. 젤리는 피펫의 벽내 커패시턴스를 줄이는 추가적인 이점이 있습니다.

눈을 번뜨리면 광학 장치가 흐려지므로 피하십시오. 미세 전극을 작동할 때 amp정전기를 방지하기 위해 항상 패러데이 케이지의 금속 표면이나 진동 방지 테이블을 만져 접지하십시오. 장착된 플라이를 플라이 준비 플랫폼 기둥에 고정합니다.

플라이의 왼쪽 눈이 조사자를 직접 향하도록 플라이 홀더를 회전합니다. 다음으로, 소형 코스 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 파리의 ocelli를 통해 뭉툭한 참조 전극을 헤드 캡슐에 부드럽게 삽입합니다. 파리가 여전히 건강해 보이고 안테나를 움직여는지 확인하십시오.

준비는 녹음할 가치가 있을 만큼 훌륭해야 합니다. 이제 젤리로 코팅된 구멍을 통해 날카로운 기록 미세 전극을 왼쪽 눈으로 밀어 넣습니다. 조직에 들어갈 때 전극 팁 위치는 반사율 패턴으로 분명해야 합니다.

깨지기 쉬운 전극 팁은 완벽하게 안내되어야 하며 그렇지 않으면 파손될 수 있으며 이는 매우 어려운 일입니다. 기록되는 세포 유형에 따라 파리의 머리 방향은 약간 달라야 합니다. 전극이 제자리에 있는 상태에서 미세 전극을 켭니다.

그런 다음 차가운 광원을 끄고 주전원에서 플러그를 뽑은 다음 중앙 접지에 연결하여 접지 루프로 인한 전기 노이즈를 최소화합니다. 다음으로, Carden 암 시스템이 플라이 주위를 자유롭게 이동할 수 있도록 구즈넥 라이트 가이드를 조정합니다. 그런 다음 실내 조명을 끄고 파리 준비를 비교적 어두운 곳에 두십시오.

이제 눈의 기록 전극의 저항을 측정합니다. 100에서 260메가옴 사이여야 합니다. 때때로 팁이 막히고 증폭기의 용량성 버즈 및 전류 펄스 기능을 사용하여 제거할 수 있습니다.

그래도 문제가 해결되지 않으면 새 전극을 사용하십시오. 다음으로, 설정 ampliifier를 전류 cl로 설정합니다.amp 또는 브리지하고 전극 사이의 전압을 0으로 설정합니다. 파리가 몇 분 동안 어두워진 후 피에조 스테퍼를 사용하거나 미세 해상도 노브를 부드럽게 돌려 0.1에서 1미크론 단계로 기록 전극 팁을 눈에 밀어 넣습니다.

각 단계에서 1-10밀리초의 섬광으로 눈을 자극합니다. 각 표시등이 깜박일 때마다 전압이 잠시 떨어집니다.tage 또는 ERG. 전극 팁이 얇은 판에 들어가 LMC에서 닫히면 ERG가 역전됩니다.

그런 다음 측정을 진행합니다. 비침습성으로 인해 개별 세포의 신호 성능을 거의 자연 상태에서 연구할 수 있습니다. 희미하고 밝은 빛에 대한 R1-R6 광수용체에 의한 전압 응답은 섭씨 20도에서 측정되었습니다.

다음으로, R1-R6 광수용체를 섭씨 25도의 LMC와 비교했습니다. 각각은 동일한 플라이에서 두 개의 날카로운 미세 전극에 의한 세포 내 기록이 너무 어렵기 때문에 서로 다른 플라이에서 측정되었습니다. 응답의 반복성은 데이터가 중첩될 때 분명해집니다.

주파수 영역의 신호 대 잡음비는 신호 및 잡음 데이터 청크를 파워 스펙트럼으로 변환한 다음 평균 신호 파워 스펙트럼을 해당 평균 노이즈 파워 스펙트럼으로 나누는 4년 동안 구했습니다. 그 결과 최상의 준비에서 신호에 매우 민감할 수 있습니다. 이 기술은 많은 종을 기록하는 데 사용할 수 있습니다.

코에노시아 파리는 섭씨 19도에서 동일한 자연주의적이고 반복적인 빛 자극을 받았습니다. 데이터는 기록 전극을 전진시킴으로써 동일한 플라이로부터 사전 및 사후 시냅스방식으로 취해졌습니다. 녹음의 빠른 역학은 이 종의 포식성 특성과 일치합니다.

일단 마스터링되면 이 기술은 제대로 수행되면 항상 긴 고품질 녹음을 가능하게 합니다. 이 절차를 시도하는 동안 깨닫는 것이 중요합니다, 내 말은 피아노 연주를 배우는 것과 같다는 것입니다. 더 많이 연습할수록 더 나은 결과를 얻을 수 있습니다.

이 절차에 따라 약물 개입과 같은 다른 방법을 수행하여 반응을 형성하는 데 있어 신경 조절제의 역할과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 신경 생물 물리학 분야의 연구자들이 광 정보, 캡처 및 전달을 최적화하는 방법과 광 변환 기계 및 다음 생물학에서 부식성 생화학 반응을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 세포 내 실험을 위해 초파리를 준비하는 방법과 광수용체와 중간뉴런에서 신경 반응을 깨우는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.