에탄올에 리그 노 셀룰로즈의 생물에 대한 강력한 펜 토스 발효 효모의 진화를위한 기술

이 적응 진화 절차의 전반적인 목표는 비톡소 가수분해물에서 헥소스 및 펜토스 당을 경제적으로 회수 가능한 에탄올로 보다 빠르게 발효시킬 수 있는 천연 자일로스 발효 효모 scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124의 강력한 균주를 도출하는 것입니다. 이 방법은 복잡한 변형을 가진 균주에 대한 로드맵을 제공하여 미생물 억제제를 포함하는 가수분해물에서 당을 발효할 수 있도록 함으로써 리그노셀룰로오스를 에탄올 산업으로 발전시킵니다. 여기서, 표적 진화의 주요 이점은 강력한 균주가 자일로스를 발효시킬 수 있는 천연 효모에서 성형되어 산업용 사카로마이세스 균주를 엔지니어링할 필요가 없다는 것입니다.

우리는 단일 효모 균주가 AFEX 전처리된 옥수수 스토버 또는 묽은 산 전처리된 스위치그래스와 같은 다른 유형의 가수분해물에서 견고하지 않을 가능성이 있다는 것을 깨달았습니다. 유성 생식 주기를 겪는 셰퍼마이세스 스티피티스(scheffersomyces stipitis)의 능력은 개발된 다양한 균주가 이러한 다양한 특성을 갖는 균주의 짝짓기를 통해 보다 강력한 단일 균주로 결합될 수 있기 때문에 본 연구에서 더 많은 활용에 유익합니다. 이 절차를 시연하는 사람은 공동 저자인 Stephanie Thomson과 Maureen Shea-Andersh인데, 이들은 제 실험실의 생물학 기술자입니다.

이 농축 절차를 시작하기 전에 125ml 플라스크에 균주 NRRL Y-7124의 사전 배양과 효소 당화 암모니아 섬유 팽창 전처리된 옥수수 스토버 가수분해물 또는 AFEX CSH의 희석 시리즈를 준비합니다. 반복 피펫을 사용하여 96웰 마이크로플레이트에 웰당 15마이크로리터, 가수분해물 희석당 8웰을 채웁니다. 웰당 몇 마이크로리터의 사전 배양을 접종하여 620나노미터 또는 0.1 이상의 A620에서 초기 흡광도를 허용합니다.

습도를 위해 젖은 종이 타월과 함께 플라스틱 상자에 마이크로플레이트를 넣고 섭씨 25도에서 24-28시간 동안 정적으로 배양합니다. 다음으로, 마이크로플레이트 판독 분광 광도계를 사용하여 가장 농축된 가수분해물 희석에서 1.0보다 큰 A620으로 물리적으로 성장한 배양물을 식별합니다. 식별된 웰을 마이크로분리관에 모으고 충전 플레이트에 분배합니다.

충진 플레이트에서 새로운 가수분해물 희석 시리즈의 각 웰로 1-5마이크로리터를 이동하여 초기 A620이 0.1 이상임을 달성하고 이전과 같이 플레이트를 배양합니다. 마이크로플레이트 판독 분광광도계로 마이크로플레이트에서 배양물의 성장을 모니터링하십시오. 적응 배양의 글리세롤 스톡을 정기적으로 준비합니다.

cryofile에 집락화된 가장 큰 가수분해물 농도의 웰 4개를 풀링하고 20% 멸균 글리세롤과 일대일로 혼합합니다. 섭씨 영하 80도에서 세포를 동결합니다. 12%글루칸 AFEX CSH의 성장이 24시간 동안 일관되게 보일 때까지 이 농축 절차를 반복합니다.

이 절차를 시작하기 위해 streak은 효모 맥아 펩톤 포도당 또는 YM 한천에 대한 적응 배양의 글리세롤 스톡을 선택했습니다. 그런 다음 성장 후 줄무늬를 사용하여 3개의 마이크로플레이트 웰 각각에 50마이크로리터의 3% 또는 6%글루칸 AFEX CSH를 접종합니다. 마이크로플레이트를 섭씨 25도에서 24시간 동안 배양합니다.

풀은 강한 성장과 함께 가장 높은 가수분해물 강도로 식민지화된 우물을 복제합니다. 그리고 YM 또는 6%glucan AFEX CSH 한천에 희석 플레이트. 플레이트를 섭씨 25도의 인큐베이터에서 24-48시간 동안 배양합니다.

가장 높은 희석 플레이트에서 5개의 단일 콜로니를 선택하여 글리세롤 스톡 배양으로 동결되는 성장을 보여줍니다. 각 콜로니를 YM 플레이트에 줄무늬를 만들고 24시간 동안 배양합니다. 멸균 루프를 사용하여 개발된 세포 줄무늬를 소량의 10%글리세롤이 혼합되어 세포를 현탁시키고 섭씨 영하 80도에서 동결하기 위해 2-3개의 극저온 파일로 분배합니다.

간단한 6%글루칸 AFEX CSH 배치 배양에서 분리물을 테스트하려면 글리세롤 스톡에서 줄무늬가 있는 48시간 플레이트에서 pH 7 인산칼륨 완충액으로 세포를 이동하여 세포 현탁액을 준비합니다. 각 셀 현탁액의 광학 밀도를 측정한 후 추가 버퍼로 볼륨을 조정하여 A620 10에 도달합니다. 각 현탁액 1마이크로리터를 사용하여 3%글루칸 가수분해물 50마이크로리터의 4개 웰 각각을 0.2의 초기 A620에 접종합니다.

마이크로플레이트를 24시간 동안 배양합니다. 다음으로, 2개의 24시간 마이크로플레이트 웰을 옮겨 pH 5에서 6%글루칸 AFEX CSH의 25ml 전배양을 접종합니다. 실리콘 스폰지 마개로 플라스크를 닫고 섭씨 25도, 150RPM에서 24시간 동안 배양합니다.

6%글루칸 AFEX CSH 전배양을 사용하여 초기 A620 0.1과 중복으로 유사한 25ml 성장 배양액을 접종합니다. 섭씨 25도 및 150RPM에서 24시간 동안 성장 배양을 배양합니다. 혼합 설탕을 사용하여 최적으로 정의된 배지 또는 ODM의 배치 배양에서 분리물의 이산화물 결핍을 테스트하려면 실리콘 스폰지 마개가 있는 125ml 플라스크에서 75ml ODM의 1리터당 150g의 자일로스를 접종합니다.

섭씨 25도 및 150RPM에서 24시간 동안 배양합니다. 사전 배양을 사용하여 pH 6.5에서 포도당 리터당 75g과 자일로스 리터당 75g을 포함하는 ODM으로 0.1 유사한 중복 75ml 테스트 배양의 A620에 접종합니다. 섭씨 25도 및 150RPM으로 플라스크를 흔듭니다.

연속 배양을 접종하기 24시간 전에 125ml 플라스크에서 에탄올이 없는 ODM에서 대표적인 AFEX CSH 내성 콜로니의 사전 배양을 준비합니다. 5-10 밀리리터의 AFEX CSH 허용 분리 배양 전배양을 사용하여 재킷 100 밀리리터 스피너 플라스크에 100 밀리리터의 ODM을 접종하여 0.5의 초기 A620을 얻습니다. 배양 유지량을 섭씨 25도로 유지하십시오.

200RPM으로 저어주고 멸균 가능한 pH 전극, pH 컨트롤러 및 온도 제어 순환 수조를 장착합니다. 처음에는 에탄올 노출로 인해 세포 성장이 느려지기 때문에 배양 발효로 pH가 5.4로 감소할 때 펌프가 pH 6.3 ODM에 자일로스 리터당 100g, 에탄올 리터당 50g을 공급하여 추가 pH 감소를 막도록 pH 작동 펌프를 설정합니다. 부피를 100ml로 유지하고 폐수 펌프가 배양 표면을 지속적으로 훑어봅니다.

수집된 폐수량을 측정하고 원고에 설명된 대로 생존 가능한 세포 농도, 생성물 및 기질을 분석하기 위해 48-72시간마다 연속 배양에서 샘플을 채취합니다. 30-100개의 콜로니를 형성하는 완충된 샘플 희석액의 생존 플레이트에서 콜로니를 분리하여 정기적으로 글리세롤 스톡을 저장하며, 이는 당시 농축에서 가장 널리 퍼진 강력한 콜로니를 나타냅니다. 플레이트에 10%글리세롤 5ml를 주입하여 중복 cryofile을 준비할 수 있도록 합니다.

배양액이 리터당 25g 이상의 에탄올이 존재하는 상태에서 크실로스에서 시간당 0.01 이상의 특정 비율로 꾸준히 성장할 수 있는 경우, 100ml 보유 부피에 대해 시간당 약 0.01의 낮은 희석 비율로 연속 배양 사료를 시작합니다. 시간이 지남에 따라 사료의 에탄올을 리터당 50g으로 올리십시오. 연속 배양을 다시 시작하기 위한 접종물의 자외선 조사는 돌연변이 속도를 가속화하는 옵션입니다.

글리세롤 스톡에서 진행된 개체군을 포착합니다. 단세포 콜로니를 분리하기 전에, 에탄올의 존재 하에서 자일로스 발효가 개선된 글리세롤 스톡 집단은 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 식별됩니다. 이 우수한 모집단을 사용하여 플레이트를 줄무늬로 만듭니다.

줄무늬 플레이트는 5에 해당하는 A620의 조밀한 완충 세포 현탁액을 준비하는 데 사용됩니다. 그런 다음 세포 현탁액을 사용하여 96개의 깊은 웰 플레이트에서 사전 배양을 접종합니다. 섭씨 25도, 400RPM 및 1인치 궤도에서 48시간 동안 배양합니다.

다음으로, 각 사전 배양을 사용하여 16개의 1밀리리터 복제 배양물을 0.5의 초기 A620에 산성 전처리된 스위치그래스 가수분해물 주류에 접종하고, ODM과 일대일로 혼합하고 자일로스 리터당 50g, 그리고 리터당 20, 30 또는 40g의 에탄올 챌린지를 제공하기에 충분한 에탄올을 주입하여 내약성 콜로니를 풍부하게 합니다. 섭씨 25도, 400RPM 및 1인치 궤도에서 48시간 동안 배양합니다. 서로 다른 각각의 글리세롤 스톡에 대해 에탄올 농도가 가장 높은 배양 웰을 수확하여 성장 및 자일로스를 사용할 수 있습니다.

각 세포주를 YM 한천에 플레이트하여 글리세롤에 보존할 널리 퍼진 단일 콜로니를 얻습니다. 세포주당 10개의 콜로니를 선택하고 글리세롤 스톡 준비를 위해 각각 YM 한천 플레이트에 줄무늬를 만듭니다. AFEX CSH에 적응한 후, 모 균주와 적응된 집단 간의 ODM에서의 발효 성능을 비교한 결과, 적응된 집단이 자일로스를 더 효율적으로 사용하여 에탄올을 더 빠르고 더 많은 양으로 만드는 것으로 나타났습니다.

가수분해물 내성 콜로니는 크실로스와 높은 수준의 에탄올을 함유하는 ODM에서 지속적인 배양 선택에 의해 에탄올 내성을 개선하기 위해 추가로 개발되었습니다. 모든 적응 집단은 에탄올 리터당 40g의 존재 하에서 자일로스 대사를 유도하는 능력에서 부모를 능가했습니다. 이 그래프는 PSGHL의 각 제형에 대한 모 균주에 대한 자일로스 흡수율 및 에탄올 수율 측면에서 평가된 우수한 내성 분리물의 성능을 요약합니다.

크실로스가 풍부한 PSGHL의 1차 스크리닝에서 선택한 최상의 균주를 3개의 완전한 가수분해물에서 스크리닝하고 각 가수분해물 내 각 분리물의 발효에 대해 상대 성능 지수 또는 RPI를 계산했습니다. 다음으로, 각 분리체에 대한 결합된 전체 성능 지수를 계산했습니다. 3개, 14개, 27개, 28개 및 33개의 분리물은 전체 RPI가 60 이상이었으며, 이는 가수분해물과 영양 조건의 모든 변동에 대해 가장 견고한 것으로 평가되었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 표적 진화 과정에서 scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124와 같은 자일로스 발효 효모에 도전하고, 독소화되지 않은 가수분해물에서 혼합 설탕을 보다 효과적으로 발효시키는 보다 강력한 유도체를 농축, 분리 및 평가하는 방법을 알게 될 것입니다. 이 기술을 숙달하면 하루 평균 약 1시간의 시간을 투자하여 사용할 수 있습니다. 진화 과정의 중요한 변화는 4개월 이내에 문서화될 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 글리세롤 스톡이 섭씨 영하 80도에서 얼도록 준비하여 정기적으로 진행하는 개체군을 구하는 것이 중요합니다. 이를 통해 개체군 복구, 주기적 평가, 격리 또는 진화 과정을 다시 시작할 수 있습니다. 다양한 돌연변이를 관리하려면 일련의 표현형에 대한 공정 특정 조건에서 효모를 정기적으로 스크리닝하는 것을 잊지 마십시오.

운동 매개변수를 기반으로 전체 무차원 상대 성능 지수(RPI)를 계산하면 가수분해물 유형 및 영양분 보충과 같은 발효 조건의 변화에 대한 균주 순위 및 견고성을 평가할 수 있습니다. 진화 과정의 각 단계에서 발생하는 우수한 효모는 게놈 염기서열 분석의 후보가 되어 억제제 내성과 같은 개선의 특성을 줄이고 다이옥시 지연을 이해하고 차세대 바이오 촉매 균주 설계에 사용할 수 있습니다.