Name: 에탄올에 리그 노 셀룰로즈의 생물에 대한 강력한 펜 토스 발효 효모의 진화를위한 기술 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: 배우세요 적응 진화 기법을 사용하여 Scheffersomyces stipitis 효모를 개량하고 리그노셀룰로스 수용액에서 혼합 당류를 효율적으로 에탄올로 발효하는 방법입니다. 이 기술은 생물 에너지 생산에 활용됩니다.

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우리는 이 프로젝트를 위해 스위치그래스를 친절하게 공급해 준 Kenneth Vogel, Robert Mitchell 및 Gautam Sarath 박사에게 진심으로 감사를 표하고 싶습니다. 또한 DOE Great Lakes Bioenergy Research Center(GLBRC) 보조금 DE-FC02-07ER64494를 통해 VB에 자금을 지원해 준 미국 에너지부에 감사드립니다.

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몇 가지 단계가 발전 처리의 성공에 매우 중요했다. 첫째, 성공적인 응용 프로그램에 필요한 원하는 표현형으로 인구의 진화를 구동하기 위해 적절한 선택 압력을 선택하는 것이 중요합니다. 다음 선택적 응력은 S. 위해 선택되었다 개발 stipitis 원하는 표현형 농축을 안내하도록 적절한 시간에 적용 : 12 % (아세트산 푸란 알데히드 및 다른 억제제 낮은 수준의 존재 하에서 성장하고 다양한 당류 발효 강제) 글루칸 AFEX CSH의 증가 강도; 이 자일 로스 (diauxic 지연을 감소 크실 로스 효소 유도 강제) 에탄올 농도가 증가함에 따라 연속 배양을 공급; 및 (높은 아세트산, 푸란 및 다른 억제제의 존재하에 성장 및 크실 로스의 발효를 강제로) 20 % 고형분 로딩 PSGHL의 강도를 증가시킨다. 둘째, 글리세롤의 동결하여 발전 효모 개체군을 유지하는 것이 중요인구 샘플 tocks 농축 공정이 진행됨. 인구의 이러한 스냅 샷은 진화 과정을 문서화하고 필요에 따라 이후의 절연 부를 수 있도...

리그 노 셀룰로오스 바이오 매스의 추정 연간 13 억 건조 톤의 에탄올 생산을 지원하고 미국은 30 %의 석유 소비를 줄일 수 있습니다. 1 포도당과 자일 로스 풍부한 식물 바이오 매스 가수 분해 수율 설탕 혼합물, 발효 억제제가 필요한 화학적 전처리에 의해 생성되지만 헤미 셀룰로스를 분해 및 효소 공격 셀룰로오스를 노출합니다. 아세트산, 푸르 푸랄, 및 (HMF) hydroxymethylfurfural는 전처리 중에 형성 많은 억제제 중 주요 구성 요소로 생각된다. 전방 목질 에탄올 산업을 이동하기 위해 연구 절차 생존 효율적 필요한 같은 억제 화합물의 존재하에 육탄 당 및 오탄당 당 모두를 사용하는 기능 할 효모의 진화를 허용한다. 이러한 사카 cerevisiae의 전통 산업 효모 균주의 중요한 추가 약점은, 효율적으로 fermen 할 수 없다는 것입니다식물 바이오 매스의 가수 분해물에서 사용할 수있는 자일 로스에서 t. 피 키아 stipitis 형 균주 NRRL Y-7124 (5773 CBS)는 최근 이름을 바꾼 Scheffersomyces의 stipitis는 잘 에탄올에 자일 로스를 발효하는 것으로 알려져 기본 펜 토스 발효 효모이다. 2,3 여기 추진 된 균주 NRRL Y-7124의 진화가에 문서화되어 있기 때문에 작은 자일리톨 부산물로 40g / L을 초과하는 경제적 복구 에탄올을 축적하는 기본 효모 균주의 가장 큰 잠재력을 가지고있다. 4,5,6을 최적의 미디어, S.에서 stipitis 균주 NRRL Y-7124은 0.41 ± 0.06 g / g 높은 세포 밀도 문화 (6 g / L 세포)이다. 7, 8 저항의 수율 40 시간 (1.75 g / L / 시간) 70 g /의 L의 에탄올을 생산 발효 억제제 에탄올, 푸르 푸랄 및 HMF에도 9 및 S.,보고 된 stipitis은 상업적 규모의 에탄올 블라우스 가능한 가장 유망한 기본 펜 토스 발효 효모 중에서 선정되었습니다N 리그 노 셀룰로즈에서. (10) 우리의 목표는 산업용 애플리케이션에 적합한 균주 NRRL Y-7124의보다 강력한 파생 상품으로 진화를 강제로 다양한 undetoxified 리그 노 셀룰로오스 가수 분해물과 에탄올의 선택 압력을 적용하는 것이 었습니다. 추구 향상된 기능 중 핵심은 농축 된 가수 분해물의 빠른 설탕 흡수 속도,보다 효율적으로 혼합 된 설탕 이용을위한 감소 diauxy, 에탄올 및 억제제의 높은 허용 오차했다. S.의 응용 프로그램 undetoxified 가수 분해물에 stipitis는 overliming 같은 가수 해독 프로세스와 연관된 추가 운영비를 제거하기 위해 연구의 핵심이 있었다. 두 산업 유망 가수 분해물은 진화를 강제로 적용했다 :. (PSGHL)을 당화 암모니아 섬유 확장 전처리 옥수수 여물 가수 분해물 (AFEX CSH)을 효소와 산 - 전처리 지팽이 가수 분해물의 술을 희석 11, 12 AFEX 전처리 기술로 개발되고있다묽은 산 전처리 가장 일반적으로 현재는 낮은 비용 기술을 나타내는 효소 당화위한 바이오 셀룰로오스 노출되도록 실시하면서 발효 억제제의 생산을 최소화한다. PSGHL는 전처리 후 남아있는 셀룰로오스로부터 분리하고 포도당에서 특징적으로 가수 분해 된 헤미셀룰로오스에서 자일 로스 풍부하지만 낮습니다. AFEX의 CSH 및 PSGHL 조성물은 진화 과정을 관리하는 데 이용 된 주요 측면에서 서로 다르다. AFEX CSH PSGHL은 (표 1)에 비해 아미노산 및 암모니아 질소원의 푸란 알데히드 및 아세트산 억제제 낮은하지만 높다. PSGHL는 주된 설탕을 사용할 수있는 자일 로스의 추가 도전을 선물한다. 따라서 PSGHL 특히, 가수 개선 자일 로스 활용 가능 효모의 상업적 사용을 방지 약점을 풍부하게하는 것이 적절하다. 심지어 기본 탄당 발효 효모 사이의 최적 설탕 xylo에 대한 의존도SE는 세포의 성장을 지원하기 위해 수리 더욱 도전 때문에 다양한 이유의 가수가된다 :. 의한 환원 불균형 대사 구조적 무결성 및 중단 셀 대폭 손상 될 영양소 결핍 억제제 9 질소 보충 특히 형태 아미노산은 발효의 중요한 운영 비용을 나타낼 수있다. 분리 선별 및 순위에 질소 보충의 영향은 지팽이 가수로 탐구했다. 향상된 개인은 S.의 자연적인 유전 적 다양성에 의존 다중 선택 압력을 사용하여 진화 인구 풍부한했다 이 다양한 가수 분해물, 에탄올 또는 UV 방사선에 노출에 의해 유도 stipitis 인구와 돌연변이. 선택 압력은 S.의 진화 과정을 탐구하는 병렬 및 직렬 적용되었다 성장하고 가수 분해물에 효율적으로 발효 할 수 원하는 파생 상품으로 stipitis(그림 1). 점점 도전 가수 분해물의 기능성 인구의 반복 배양이 중 12 % 글루칸 AFEX의 CSH의 희석 시리즈를 사용하거나 다른 PGSHL 20 % 고체로드에서 제조 된 마이크로 플레이트에서 수행 하였다. 연속 배양에서 자일 로스에 에탄올 도전 성장의 응용 프로그램은 더 자일 로스 활용의 억압을 에탄올 적은 감수성을 보여주는 표현형에 대한 풍부하여 AFEX의 CSH 적용 인구를 개선. 후자의 기능은 최근에 포도당 발효 다음 균주 NRRL Y-7124에 의해 펜 토스 이용에 문제가 나타났다. PSGHL 8 농축 다음 가수 분해물 기능을 확대 탐구했다. S.의 추정 개선 파생 상품 stipitis NRRL Y-7124은 가장 일반적인 개체군에서 콜로니를 선택하는 응력 조건으로 희석 도금하에 농축하여 표적 진화 과정의 각 단계에서 분리 하였다. 차원 상대성능 지수 (RPI가)의 반응 속도가 적용된 다른 가수 분해물 형태와 영양 보충제 평가 하였다 전반적인 성능에 기초하여 변형을 평가하기 위해 사용되었다. 다양한 적응 절차의 성공은 S.의 기능을 향상시킬 수 있지만 리그 노 셀룰로오스 가수 분해물의 stipitis 이전 undetoxified 가수 분해물에 경제적 인 에탄올 생산을 보여주는 균주는 이전에보고되지 않은 문서화되어있다. 13-17 진화 절차를 사용하여 여기보다 상세하게 시각화 할, Slininger 등. (18)는 크게 이상 향상 균주 개발 모 균주 NRRL Y-7124 및 AFEX의 CSH에&gt; 40g / L의 에탄올을 생산하고 적절 질소원 보충 당화 지팽이 분해물 (SGH)를 효소 수있다. 이 새로운 균주는 에탄올 산업 개발 리그 노 셀룰로즈 향후 관심을 추가 유전체학 연구 건물의 과목과 같습니다이전 염기 서열을 변형 NRRL Y-11545의 사람들에. 19 균주 개량 연구를 촉진하기위한 전주곡으로 개발하는 동안 발생 유전 적 변화의 역사를 규명 할 그림 1에 도식화 진화의 여러 단계에서 생산 된 최고 균주의 게놈 연구.

<table><tbody><tr><td>Cellic Ctec, Xylanase (endo-1,4-)</td> <td>Novozymes</td> 포함 <td>제품 번호</td><td>www.novozymes.com, 1-919-494-3000</td></tr><tr><td>Cellic Htec, 셀룰라제 및 Xyalanase</td><td>Novozymes</td> 포함 <td>제품 번호</td><td>없음 www.novozymes.com, 1-919-494-3000</td></tr><tr><td>Toasted Nutrisoy Flour</td><td>Archer Daniels Midland Co. (ADM)</td> <td>63160</td><td>ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL&nbsp; 1800-37-5843</td></tr><tr><td>Pluronic F-68 (계면활성제)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1300</td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Difco 비타민 분석 Casamino Acids</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>228830</td><td>여러 공급업체: e., Fisher Scientific, VWR, Daigger</td></tr><tr><td>D,L-tryptophan&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3300</td><td>여러 공급업체: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger</td></tr><tr><td>L-cysteine&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7352</td><td>여러 공급업체: 예: , Fisher Scientific, Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>214010</td><td>여러 공급업체: 예: , Fisher Scientific, VWR, Daigger</td></tr><tr><td>Bacto Malt Extract</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>218630</td><td>여러 공급업체: e., Fisher Scientific, VWR, Daigger</td></tr><tr><td>Bacto 효모 추출물</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>212750</td><td>여러 공급업체: e., Fisher Scientific, VWR, 대두의 Daigger</td></tr><tr><td>Peptone Type IV</td><td>Fluka</td><td>P0521-500g</td><td>여러 공급업체: 예: , Fisher Scientific, VWR, Daigger</td></tr><tr><td>Adenine, >99% 분말</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8626</td><td>CAS 73-24-5. 다른 브랜드를 사용할 수 있습니다. 여러 공급업체: 예: , Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC</td></tr><tr><td>사이토신, >99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3506</td><td>CAS 71-30-7. 다른 브랜드를 사용할 수 있습니다. 여러 공급업체: 예: , Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC</td></tr><tr><td>Guanine, SigmaUltra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6779</td><td>CAS 73-40-5. 다른 브랜드를 사용할 수 있습니다. 여러 공급업체: 예: , Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC</td></tr><tr><td>Thymine, 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0376</td><td>CAS 65-71-4. 다른 브랜드를 사용할 수 있습니다. 여러 공급업체: 예: , Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC</td></tr><tr><td>Uracil, 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U0750</td><td>CAS 66-22-8. 다른 브랜드를 사용할 수 있습니다. 여러 공급업체: 예: , Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC</td></tr><tr><td>포도당(D-글루코스), 무수, 인증 ACS</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16-500</td><td>CAS 50-99-7. 다른 브랜드를 사용할 수 있습니다. 여러 공급업체: 예: , Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>D-Xylose, 분석 >99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X1500</td><td>CAS 58-86-6. 다른 브랜드를 사용할 수 있습니다. 여러 공급업체: 예: , Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>96-well, 평평한 바닥 플레이트</td><td>Becton Dickinson Falcon</td><td>351172</td><td>여러 공급업체: e., Thermo-Fisher, VWR, Daigger</td></tr><tr><td>Wypall L40 와이퍼</td><td>Kimberly-Clark</td> 가습을 위해 물을 흡수하는 마이크로플레이트 상자에 담긴 Kimberly-Clark <td></td><td>타월, 여러 공급업체예: , Thermo-Fisher, uline, Daigger</td></tr><tr><td>Corning 눈금 파이렉스 플라스크, 125 ml, 좁은 입구(스토퍼 #5)</td><td>Corning Life Science Glass</td><td>4980-125</td><td>여러 공급업체: 예: , Thermo-Fisher, VWR, Daigger</td></tr><tr><td>Innova 42R shaker/incubator, 2.5 cm (1") 회전</td><td>New Brunswick Scientific (1-800-631-5417)</td><td>M1335-0016</td><td>여러 공급업체: 예: , Eppendorf, Thermo-Fisher. 2.5cm(1") 던지기가 있는 다른 셰이커/인큐베이터를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>4개의 딥 웰 MTP 플레이트용 Duetz 커버 클램프</td><td>Applikon Biotechnology</td><td>Z365001700</td><td>applikon-biotechnology.com(미국), 1-650-578-1396</td></tr><tr><td>96개의 딥 웰 플레이트용 Duetz 시스템 샌드위치 커버</td><td>Applikon Biotechnology</td><td>Z365001296</td><td>applikon-biotechnology.com(미국), 1-650-578-1396</td></tr><tr><td>Duetz 시스템 실리콘 씰(0.8mm 검정색 저 증발) 96 딥 웰 플레이트 커버</td><td>Applikon Biotechnology</td><td>V0W1040027</td><td>applikon-biotechnology.com(미국), 1-650-578-1396</td></tr><tr><td>Duetz 시스템 샌드위치 커버용 파란색 극세사 층</td><td>Applikon Biotechnology</td><td>V0W1040001</td><td>applikon-biotechnology.com(미국), 1-650-578-1396</td></tr><tr><td>96 웰, 2ml 정사각형 웰 피라미드 바닥 플레이트, 천연 포피프로필렌</td><td>Applikon Biotechnology</td><td>ZC3DXP0240</td><td>applikon-biotechnology.com(미국), 1-650-578-1396</td></tr><tr><td>Bellco 32mm 실리콘 스폰지 플러그 클로저, 125ml 플라스크용 25</td>개 <td>Bellco</td><td>1924-00032</td><td>Thomas Scientific, 카탈로그 번호는 1203K27</td></tr><tr><td>Bellco 스피너 플라스크, 1968-유리 돔, 밀봉 가능한 플랜지 유형, 100ml 작업 용량입니다. 이 디자인은 더 이상 제조되지 않습니다.</td><td>Bellco</td><td>1968-00100 (본래 Cat. 아니요.)</td><td>재킷 용기에는 순환 수조로 온도 제어를 위한 하부 입구 및 상부 출구 포트가 있습니다. 용기는 외부 직경이 75mm, 높이가 200mm입니다. ~45&#176에는 4개의 측면 포트가 있습니다. 각도와 하나의 상단 포트. 포트 개구부: 크기 0 네오프렌 스토퍼(포트의 내경 21-22mm)에 적합한 크기입니다.</td></tr><tr><td>Mathis Labomat IR 건조기 오븐</td><td>MathisAg</td><td>Typ-NBR BFA12 215307</td><td>Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157</td></tr><tr><td>이중 채널 생화학 분석기</td><td>YSI Life Sciences</td><td>2900D-UP</td><td>www.ysi.com, 96웰 마이크로플레이트 형식의 급속 당 분석을 위한 로봇 시스템</td></tr><tr><td>PowerWave XS 마이크로플레이트 분광 광도계</td><td>Bio-Tek Instruments, Inc</td><td>MQX200R</td><td><a href="http://www.biotek.com/">www.biotek.com</a></td></tr></tbody></table>

에탄올에 리그 노 셀룰로즈의 생물에 대한 강력한 펜 토스 발효 효모의 진화를위한 기술

Techniques for the Evolution of Robust Pentose-fermenting Yeast for Bioconversion of Lignocellulose to Ethanol

리그노셀룰로오스 바이오매스는 연료 등급 에탄올 및 기타 바이오 제품 생산에 유용한 풍부하고 재생 가능한 공급 원료입니다. 전처리 및 효소 당화 공정은 효모에 의해 발효될 수 있는 당을 방출합니다. 전통적인 산업용 효모는 크실로스(식물 당의 최대 40%를 차지)를 발효하지 않으며 농축된 가수분해물에서 기능할 수 없습니다. 경제적인 에탄올 회수를 지원하기 위해 농축된 가수분해물이 필요하지만 전처리 중에 생성된 독성 부산물이 함유되어 있습니다. 해독 방법은 가수분해물을 발효 가능하게 만들 수 있지만 비용이 많이 들고 폐기물 처리 책임이 발생합니다. 여기에서는 적응 진화 및 분리 기술을 설명하고 시연하여 불리한 배양 조건에도 불구하고 가수분해물을 경제적으로 회수 가능한 에탄올로 효율적으로 전환할 수 있는 천연 Scheffersomyces stipitis 균주 NRRL Y-7124의 유도체를 생성합니다. 개선된 개체는 S. stipitis 개체군의 자연적인 유전적 다양성과 두 가지 다양한 가수분해물, 에탄올 또는 자외선에 대한 노출에 의해 유도된 돌연변이에 의존하는 다중 선택 압력을 사용하여 진화하는 개체군에서 풍부해집니다. 최종 진화 배양은 우세한 분리물을 수확하기 위해 희석 도금된 반면, 다양한 진화 단계에서 글리세롤에 동결된 중간 집단은 적절한 응력 구배를 사용하여 선택적 배지에서 농축되어 희석 도금을 통해 가장 유망한 분리물을 회수합니다. 분리물은 다양한 가수분해물 유형에 대해 스크리닝되고 크실로스 흡수율 및 에탄올 수율 데이터의 무차원 상대 성능 지수(RPI) 변환과 관련된 새로운 절차를 사용하여 순위를 매깁니다. RPI 통계 매개변수를 사용하여 전체 상대 성능 평균을 계산하여 배양 조건(영양소 및 억제제의 변화) 및 운동 특성을 포함한 여러 요인을 기반으로 분리물의 순위를 매깁니다. 이러한 기술의 적용을 통해, 모 균주의 유도체는 pH 5-6에서 효소 당화 가수분해물에서 다음과 같은 개선 된 기능을 가졌습니다 : 성장 전 초기 지연 단계 감소, 포도당 - 자일 로스 전이 중 이음향 지연 감소, 발효 속도 현저히 향상, 에탄올 내성 개선 및 40g / L까지의 축적.

S.의 stipitis은 AFEX의 CSH, PSGHL 및 에탄올 도전 자일 로스 - 공급 연속 문화를 포함 세 가지 선택 문화의 조합을 사용하여 진화 하였다. 그림 1 균주와 함께 수행 진화 실험의 개략도 중 하나를 가장 효과적으로 수행하는 것으로 보여 전체적으로 또는 가장 효과적으로 테스트 가수 분해물 중 하나. 표 3은 이러한 우수한 균주의 NRRL에 수탁 번호를 나타내고, 각각의 균주를 단리하는 농축 된 집단을 실현하는 처리에 적용되는 적응 응력을 요약 한 것이다. 이들의 대부분은 노출되어 진화하는 동안 단 하나의 유형으로 감염시켰다하더라도, 약간 분리 한 두 가수 유형 우수한 상대적인 성능을하는 것으로하였으나,도 7 (11)의 분리 물은 가수 분해물 형태의 모두에 잘 수행 하였다. 다양한 진화의 성공은 그림 2에서 보여 여기에 촬영 접근법 -7 표 4....

적응 진화와 분리 기술을 설명하고 신속하게 육탄 당과 효소의 오탄당의 혼합 당이 undetoxified 가수 분해물을 당화 및 40g / L의 에탄올을 통해 축적 소비 할 수있는 Scheffersomyces stipitis 변형의 파생 상품 NRRL Y-7124을 얻었다 증명된다.

Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme ...

이 적응 진화 절차의 전반적인 목표는 독성 제거를 거치지 않은 가수분해물 내의 헥소스 및 펜토스 당을 경제적으로 회수 가능한 에탄올로 더 빠르게 발효시킬 수 있는 야생형 자일로스 발효 효모 scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124의 강건한 균주를 도출하는 것입니다. 이 방법은 미생물 억제제가 포함된 가수분해물 내의 당 발효를 가능하게 하는 복합 변이 균주에 대한 로드맵을 제공함으로써 리그노셀룰로오스-에탄올 산업을 발전시킵니다. 여기서 표적 진화의 주된 장점은 자일로스를 발효할 수 있는 야생형 효모로부터 강건한 균주를 형성함으로써, 산업용 saccharomyces 균주를 공학적으로 설계할 필요성을 제거한다는 점입니다.우리는 단일 효모 균주가 AFEX 전처리된 옥수수 대나 희석 산 전처리된 스위치그라스와 같은 다양한 유형의 가수분해물에서 강건한 성능을 보일 가능성이 낮다는 점을 인식했습니다. *Scheffersomyces stipitis*가 유성 생식 주기를 거칠 수 있는 능력은 본 연구의 추가적인 활용에 유리한데, 이는 개발된 다양한 균주들을 교배함으로써 여러 특성을 가진 균주들을 하나의 더 강건한 단일 균주로 결합할 수 있기 때문입니다. 이 절차의 시연은 본 연구실의 생물과학 기술자인 공동 저자 Stephanie Thomson과 Maureen Shea-Andersh가 담당할 것입니다.이 농축 절차를 시작하기 전, 125 milliliter 플라스크에 NRRL Y-7124 균주의 예비 배양액을 준비하고, 효소 당화된 암모니아 섬유 팽창 전처리 옥수수대 가수분해물(AFEX CSH)의 희석 계열을 준비하십시오. 리피팅 파이펫을 사용하여 96웰 마이크로플레이트의 웰당 15 microliters씩, 가수분해물 희석 단계당 8개의 웰을 채웁니다. 620 nanometers에서의 초기 흡광도(A620)가 0.1 이상이 되도록 웰당 몇 microliters의 예비 배양액을 접종하십시오.습도를 유지하기 위해 젖은 종이 타월이 들어있는 플라스틱 상자에 마이크로플레이트를 넣고, 25 °C에서 24~28시간 동안 정적으로 배양합니다. 그 다음, 마이크로플레이트 리딩 분광광도계를 사용하여 가장 고농도의 가수분해물 희석액에서 A620 수치가 1.0보다 크게 성장한 배양물을 확인합니다. 확인된 웰들을 마이크로 원심분리 튜브에 모은 후, 필 플레이트에 분배합니다.초기 A620 값이 0.1 이상이 되도록 충전 플레이트(fill plate)에서 새 가수분해물 희석 시리즈의 각 웰로 1~5 µL를 옮기고, 이전과 동일하게 플레이트를 배양합니다. 마이크로플레이트 판독 분광광도계를 사용하여 마이크로플레이트 내 배양물의 성장을 모니터링합니다. 적응 배양물의 글리세롤 스톡을 정기적으로 준비합니다.가장 높은 가수분해물 농도에서 군락을 형성한 4개의 웰을 크라이오파일(cryofile)에 모으고, 20% 멸균 글리세롤과 1:1 비율로 혼합합니다. 세포를 -80 °C에서 동결합니다. 12% glucan AFEX CSH에서 24시간 후 성장이 지속적으로 관찰될 때까지 이 증식 과정을 반복합니다.이 절차를 시작하려면, 선택한 적응 배양액의 글리세롤 스톡을 yeast malt peptone dextrose 또는 YM agar에 스트리킹합니다. 그 후, 균이 성장하면 스트리킹된 균을 사용하여 3개 각각의 마이크로플레이트 웰에 3% 또는 6% glucan AFEX CSH 50 µL를 접종합니다. 마이크로플레이트를 25 °C에서 24시간 동안 배양합니다.강한 성장을 보인 가장 높은 가수분해물 농도의 군락 형성 웰들을 풀링(pooling)합니다. 그 후 YM 또는 6% glucan AFEX CSH 한천 배지에 희석 도말합니다. 도말한 플레이트를 25 °C 배양기에서 24에서 48시간 동안 배양합니다.성장이 관찰되는 가장 높은 희석 배지 플레이트에서 단일 콜로니 5개를 선택하여 글리세롤 스톡 배양액으로 냉동 보관합니다. 각 콜로니를 YM 플레이트에 스트리킹하고 24시간 동안 배양합니다. 멸균 루프를 사용하여 성장한 세포 스트리크를 소량의 10% glycerol에 옮겨 세포를 현탁시킨 후, 2~3개의 cryofile에 나누어 담아 -80 °C에서 냉동 보관합니다.단순 6% glucan AFEX CSH 회분 배양에서 분리 균주를 테스트하려면, 글리세롤 스톡에서 스트리킹하여 48시간 동안 배양한 플레이트의 세포를 pH 7 인산칼륨 완충액으로 옮겨 세포 현탁액을 준비합니다. 각 세포 현탁액의 광학 밀도를 측정한 후, 추가 완충액으로 부피를 조절하여 A620 값을 10으로 맞춥니다. 각 현탁액 1 µL를 사용하여 3% glucan 가수분해물 50 µL가 담긴 4개의 웰 각각에 접종하여 초기 A620 값을 0.2로 설정합니다.마이크로플레이트를 24시간 동안 배양합니다. 다음으로, 24시간 배양된 마이크로플레이트 웰 2개를 옮겨 pH 5의 6% glucan AFEX CSH 전배양액 25 milliliter에 접종합니다. 플라스크를 실리콘 스폰지 마개로 닫고 25 degrees Celsius, 150 RPM에서 24시간 동안 배양합니다.6% glucan AFEX CSH 전배양액을 사용하여 초기 A620이 0.1이 되도록 25 milliliter 성장 배양액을 두 개의 중복 시료로 접종합니다. 성장 배양액을 25 degrees Celsius, 150 RPM에서 24시간 동안 배양합니다. 혼합 당이 포함된 최적 정의 배지(optimal defined medium, ODM)의 회분 배양에서 분리 균주의 dioxic lack을 테스트하려면, 150 grams per liter의 xylose가 포함된 75 milliliters ODM 전배양액을 실리콘 스폰지 마개로 밀폐된 125 milliliter 플라스크에 접종합니다.25 °C, 150 RPM에서 24시간 동안 배양합니다. 이 전배양액을 사용하여 glucose 75 g/L와 xylose 75 g/L가 포함된 pH 6.5의 ODM 배지가 담긴 75 mL 시험 배양액 2개(중복 시료)에 A620 0.1이 되도록 접종합니다. 삼각플라스크를 25 °C, 150 RPM에서 진탕 배양합니다.연속 배양을 접종하기 24시간 전에, 125밀리리터 플라스크 내의 에탄올이 없는 ODM에서 대표적인 AFEX CSH 내성 콜로니의 전배양액을 준비한다. AFEX CSH 내성 분리주 전배양액 5~10밀리리터를 사용하여 자켓형 100밀리리터 스피너 플라스크에 담긴 ODM 100밀리리터를 접종하여 초기 $\text{A}_{620}$ 값을 0.5로 맞춘다. 배양액 유지 부피를 25도로 유지한다.200 RPM으로 교반하고, 멸균 가능한 pH 전극, pH 컨트롤러 및 온도 조절 순환 수조를 장착합니다. 초기에는 에탄올 노출로 인해 세포 성장이 느리므로, 배양 발효로 인해 pH가 5.4로 감소할 때 펌프가 100 g/L의 자일로스와 50 g/L의 에탄올이 포함된 pH 6.3 ODM을 공급하여 pH가 더 이상 감소하는 것을 막도록 pH 작동 펌프를 설정합니다. 유출 펌프를 사용하여 배양액 표면을 지속적으로 스키밍함으로써 부피를 100 mL로 유지합니다.수집된 유출액의 부피를 측정하고, 원고에 기술된 대로 생존 세포 농도, 생성물 및 기질 분석을 위해 48~72시간마다 연속 배양액에서 샘플을 채취하십시오. 완충액으로 희석한 샘플의 생존력 플레이트에서 30~100개의 콜로니가 형성된 경우, 해당 시점의 농축 과정에서 가장 우세하고 강건한 콜로니를 분리하여 정기적으로 글리세롤 스톡을 저장하십시오. 플레이트에 5 mL의 10% glycerol을 충분히 부어 중복 냉동 보관 파일을 준비하십시오.25 g/L 이상의 에탄올이 존재하는 자일로스 배지에서 배양물이 시간당 0.01 이상의 특정 성장률로 안정적으로 성장할 수 있다면, 100 mL 유지 부피에 대해 시간당 약 0.01의 낮은 희석률로 연속 배양 공급을 시작하십시오. 시간이 지남에 따라 공급액 내의 에탄올 농도를 50 g/L까지 높이십시오. 연속 배양을 재시작하기 위한 접종균의 자외선 조사는 돌연변이율을 높이기 위한 선택 사항입니다.글리세롤 스톡에 고성능 집단을 보관합니다. 단일 세포 콜로니를 분리하기 전에, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 에탄올 존재 하에서 자일로스 발효 능력이 향상된 글리세롤 스톡 집단을 확인합니다. 이렇게 선별된 우수 집단을 사용하여 플레이트에 스트리킹합니다.스트리킹한 플레이트를 사용하여 A620 값이 5가 되도록 농축된 완충 세포 현탁액을 준비합니다. 그 다음, 이 세포 현탁액을 사용하여 96-deep well 플레이트에 예비 배양액을 접종합니다. 25 °C, 400 RPM, 1인치 궤도 조건에서 48시간 동안 배양합니다.다음으로, 각 예비 배양액을 사용하여 산 전처리된 스위치그래스 가수분해액과 ODM을 1:1로 혼합하고 L당 50g의 xylose 및 20, 30 또는 40g/L의 에탄올 농도로 challenge를 제공하는 배지에 초기 A620이 0.5가 되도록 1mL씩 16개의 반복 배양액을 접종하여 내성 콜로니를 농축합니다. 25°C, 400 RPM, 1인치 궤도 조건에서 48시간 동안 배양합니다. 각 글리세롤 스톡에 대해, 성장이 가능하고 xylose 이용이 이루어진 가장 높은 에탄올 농도의 배양 웰을 수확합니다.각 세포주를 YM agar에 도말하여 글리세롤에 보존할 대표적인 단일 콜로니를 확보합니다. 세포주당 10개의 콜로니를 선택하여 각각 YM agar 플레이트에 스트리킹하여 글리세롤 스톡을 준비합니다. AFEX CSH에 적응시킨 후, 모주와 적응된 집단의 ODM 내 발효 성능을 비교한 결과, 적응된 집단이 자일로스(xylose)를 더 효율적으로 사용하여 에탄올을 더 빠르게, 그리고 더 많은 양으로 생성함을 확인하였습니다.자일로스와 고농도의 에탄올이 포함된 ODM에서 연속 배양 선택을 통해 가수분해물 내성 균주를 추가로 개발하여 에탄올 내성을 향상시켰습니다. 적응된 모든 개체군은 40 g/L의 에탄올 존재 하에서 자일로스 대사를 유도하는 능력이 모균주보다 뛰어났습니다. 이 그래프들은 각 PSGHL 제형에 대해 모균주 대비 자일로스 흡수율과 에탄올 수율 측면에서 평가된 우수한 내성 분리주들의 성능을 요약한 것입니다.xylose가 풍부한 PSGHL의 1차 스크리닝에서 선정된 최적의 균주들을 이후 세 가지의 완전 가수분해물에서 다시 스크리닝하였으며, 각 가수분해물 내에서 각 분리 균주의 발효에 대한 상대적 성능 지수인 RPI를 계산하였다. 다음으로, 각 분리 균주의 통합 종합 성능 지수를 계산하였다. 분리 균주 3, 14, 27, 28 및 33의 5종이 60 이상의 종합 RPI를 기록하여, 가수분해물의 모든 변이와 영양 조건의 조합에 대해 가장 강건한 것으로 평가되었다.본 영상을 시청한 후, 귀하는 표적 진화 과정에서 *Scheffersomyces stipitis* NRRL Y-7124와 같은 자일로스 발효 효모를 선별하고, 독성 제거 과정을 거치지 않은 가수분해물 내의 혼합당을 더 효과적으로 발효시키는 더 강건한 유도체를 농축, 분리 및 평가하는 방법을 익히게 될 것입니다. 이 기술을 숙달하면 하루 평균 약 1시간 정도의 시간을 투자하여 수행할 수 있습니다. 진화 과정에서의 유의미한 변화는 짧게는 4개월 만에 기록될 수 있습니다.이 절차를 수행하는 동안, -80°C에서 냉동 보관할 글리세롤 스톡을 제작하여 진화 중인 집단을 정기적으로 저장하는 것이 중요합니다. 이를 통해 집단 회복, 주기적 평가, 분리 또는 진화 과정의 재시작이 가능해집니다. 다양한 돌연변이를 관리하기 위해, 공정 특이적 조건 하에서 효모를 정기적으로 스크리닝하여 다양한 표현형을 확인하시기 바랍니다.속도론적 파라미터를 기반으로 무차원 전체 상대 성능 지수(relative performance indices, RPIs)를 계산하면, 가수분해물 종류 및 영양분 보충과 같은 발효 조건의 변화에 대한 균주 순위와 강건성을 평가할 수 있습니다. 진화 과정의 각 단계에서 도출된 우수한 효모들은 게놈 시퀀싱의 후보가 되며, 이를 통해 저해제 내성과 같은 개선 사항의 본질이 규명되고 이중 산소 지체(dioxic lag) 현상을 이해함으로써 차세대 생촉매 균주 설계에 활용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

식물 바이오 매스 샘플을 다수의 당화 잠재력을 결정하는 간단하고 빠른 방법을 설명합니다. 이 분석을 위해 자동화된 플랫폼은 96 접시와 잘 풀어 설탕의 전처리, 가수 분해 및 부량의 후속 성능 분석을위한 식물 바이오 매스의 준비를 포함한다.

리그노셀룰로오스성 자료에 대한 높은 처리량 당화 분석

식물 세포벽 구조 및 화학적 특성을 평가하여 바이오 연료 및 바이오 재료에 이상적인 공급 원료를 식별합니다. 표준 방법은 대규모 데이터 세트에 적용할 때 제한이 있습니다. 이러한 고처리량 전처리, 효소 당화 및 열분해 분자 빔 질량 분석 방법은 많은 수의 바이오매스 샘플을 비교하여 실험 시간과 비용을 줄입니다.

총 리그닌, 리그닌 단량체, 및 효소 설탕 자료 : 리그 노 셀룰로오스 바이오 매스의 반항의 변화의 높은 처리량 검열

우리는 Saccharomyces cerevisiae에서 지시된 진화 캠페인을 위한 돌연변이 라이브러리를 구축하고 스크리닝하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

진화 방법에 감독<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비지에</em&gt; : 돌연변이 라이브러리 생성 및 검사

예를 들어 L-크실 로스를 생산하여 보조 인자 재생 및 재사용을위한 개선 된 공동 고정화 전체 세포 생체 촉매에 대한 프로토콜이다 선보였다. 보조인 재생 기능적 상보 효소 발현이 대장균 균주를 결합함으로써 달성된다; 전체 세포 생 촉매 고정화 칼슘 알기 네이트 비드에 세포 캡슐화함으로써 달성된다.

공동 인자 재생 및 개선 재사용에 대한 알긴산 구슬의 다중 생체 촉매의 고정화

양성자성 저비용 이온 액체로 리그노셀룰로오스 바이오매스를 전처리하여 섬세한 셀룰로오스가 풍부한 펄프와 정제된 리그닌을 얻을 수 있습니다. 펄프는 효소 당화 후 높은 포도당 수율을 발생시킵니다.

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우리는 유전자 결실 효율 향상을 위한 Yarrowia lipolytica Po1g 균주의 분자 유전자 조작에 대한 방법을 보고합니다. 그 결과 엔지니어링된 Y. lipolytica 균주는 바이오 연료 및 생화학 생산에 잠재적으로 응용될 수 있습니다.

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미생물 대사의 광유전학적 조절은 발효 과정에 대한 유연한 동적 제어를 제공합니다. 여기의 프로토콜은 다양한 부피 규모에서 화학 및 단백질 생산을위한 청색광 조절 발효를 설정하는 방법을 보여줍니다.

미생물 화학 및 단백질 생산을 위한 광 조절 발효

이 프로토콜은 생물 발광 리포터를 사용하여 Saccharomyces eubayanus 의 전사 활성을 측정하여 포도당에서 맥아당으로의 전이를 모니터링함으로써 대사 적응의 실시간 분석을 가능하게 하고 다양한 조건에서 산업 발효를 위한 균주 최적화를 지원합니다.

생체 내 Monitoring of transcriptional activity during metabolic transition using a bioluminescent reporter in yeast(효모의 생물발광 리포터를 사용한 대사 전이 중 전사 활동 모니터링)

생리학 및 병리 학적 압력 조건에 심장 밸브 조직을 쓰는 수있는 순환 압력 생물 반응기는 설계되었습니다. LabVIEW 프로그램은 사용자가 압력 크기, 진폭 및 주파수를 제어할 수 있습니다. 이 장치는 심장 밸브 조직이나 격리 세포의 mechanobiology을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

의 순환 압력 생물 반응기 설계 예 VIVO</em대동맥 심장 밸브> 학습

우리는 여기에서 자신의 완전한 증식하는 및 / 또는 연대순 수명 기간 동안 하나의 신진 효모 세포의 연속 고해상도 현미경 이미징을 허용 microfluidic 장치의 동작을 설명합니다.

증식하는 연속 고해상도 현미경으로 관찰 신진 효모의 노화

배우세요 적응 진화 기법을 사용하여 Scheffersomyces stipitis 효모를 개량하고 리그노셀룰로스 수용액에서 혼합 당류를 효율적으로 에탄올로 발효하는 방법입니다. 이 기술은 생물 에너지 생산에 활용됩니다.

에탄올에 리그 노 셀룰로즈의 생물에 대한 강력한 펜 토스 발효 효모의 진화를위한 기술

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