증식하는 연속 고해상도 현미경으로 관찰 신진 효모의 노화

본 실험 절차의 전반적인 목표는 단일 반수체 효모 세포의 전체 복제 수명을 추적하는 것입니다. 첫 번째 단계는 마이크로 패드 배열이 포함된 미세유체 칩을 제작하는 것입니다. 다음으로 효모 세포를 미세유체 칩에 주입하며, 마이크로 패드 하단 영역의 높이가 효모 세포의 직경과 비슷하기 때문에 세포들이 그곳에 안착하게 됩니다.

그 후, 포획된 효모 세포 위로 신선한 배지를 지속적으로 흘려주며, 생성되는 딸세포들은 배지의 흐름에 의해 씻겨 나갑니다. 명시야 및 형광 현미경을 사용하여 노화하는 효모 세포에서 발생할 수 있는 세포 또는 소기관의 형태, 단백질 발현 및 단백질 위치의 변화를 시각화합니다. 이 기술이 기존의 미세절제법보다 갖는 주요 장점은 노동 강도가 더 낮으며, 개별 효모 세포의 전체 수명 동안 장기적이고 연속적인 현미경 이미지를 얻을 수 있다는 점입니다.

이 방법은 복제 노화에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 장기간의 지속적인 현미경 관찰이 필요한 연구에도 활용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자들은 마이크로 유체 칩 제작의 특정 단계에서 세심한 주의가 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 또한, 마이크로 유체 칩에 세포를 로딩하는 과정에서도 어느 정도의 숙련도가 필요할 수 있습니다.

실리콘 웨이퍼 몰드는 소프트 리소그래피로 제작됩니다. 제작에 관한 자세한 내용은 함께 제공된 프로토콜을 참조하십시오. 질긴 태그 조각을 약 0.5 millimeters × 3 millimeters 크기의 얇은 스트립 형태로 자릅니다.

메스로 스트립을 조심스럽게 들어 올려, 입구 채널과 마이크로 파드레 사이의 채널 구조 약간 위쪽의 실리콘 웨이퍼 몰드 위에 배치합니다. 그다음, 유리 페트리 접시를 알루미늄 호일로 두 겹 덮고 웨이퍼를 페트리 접시에 넣습니다. 알루미늄 호일은 미세유체 칩 제작 과정에서 PDMS가 웨이퍼와 페트리 접시 사이로 흘러 들어가는 것을 방지합니다.

미세유체 칩 제작 절차를 시작하려면, 빈 플라스틱 컵을 저울 위에 올리고 영점을 조절합니다. 플라스틱 컵에 PDMS base 40 grams를 붓습니다. PDMS 경화제를 중량 대비 중량비 1:10으로 추가하며, 이 경우 약 4 milliliters가 됩니다.

일회용 플라스틱 피펫을 사용하여 수 분 동안 충분히 혼합하십시오. 이후 PDMS의 적절한 중합 반응을 보장하기 위해 혼합물을 잘 섞어주는 것이 중요합니다. 유리 페트리 접시에 담긴 웨이퍼 위에 PDMS를 붓습니다. 페트리 접시 속의 PDMS 혼합물에는 탈기(Degas)해야 할 기포가 많이 포함되어 있을 것입니다.

기포가 모두 제거될 때까지 약 30분 동안 진공 펌프가 연결된 데시케이터 내의 페트리 접시에 PDMS를 둡니다. 웨이퍼가 올려진 페트리 접시를 핫플레이트 위에 놓고 120 °C에서 1시간, 이어서 65 °C에서 다시 1시간 동안 가열하여 PDMS를 중합시킵니다. 2시간 후, 유리 페트리 접시에서 알루미늄 호일 웨이퍼와 중합된 PDMS를 제거합니다.

웨이퍼 뒷면에서 PDMS가 붙은 알루미늄 호일을 벗겨냅니다. 그런 다음 웨이퍼 상단에서 PDMS 층을 조심스럽게 들어 올립니다. 채널이 위를 향하도록 PDMS 층을 벤치 위에 뒤집어 놓고, 메스를 사용하여 PDMS에 각인된 단일 칩 디자인을 조심스럽게 잘라냅니다.

채널 가장자리 주변으로 약 3mm의 PDMS를 남겨두십시오. 다음 단계는 이 도식에 표시된 것과 같이 입구, 출구 및 사이드 채널의 끝부분에 있는 PDMS에 구멍을 뚫는 것입니다. 구멍을 뚫으려면 20 gauge 루어 스텁을 PDMS에 수직으로 완전히 밀어 넣으십시오.

스터브를 뽑아내기 전에 루어 스터브 내의 PDMS 컬럼을 제거하십시오. 이는 PDMS 컬럼이 새로 뚫린 구멍을 막는 것을 방지하기 위함입니다. 모든 구멍을 다 뚫은 후에는 칩 표면에 스카치테이프를 붙였다가 즉시 떼어내어 먼지 입자와 잔류 PDMS를 제거하십시오.

마찬가지로, 칩이 부착될 커버 글라스를 세척합니다. 칩과 커버 글라스를 벤치탑 UV 오존 세척기의 UV 램프 아래에 두고, 서로 접합될 면이 램프를 향하게 하여 6~8분 동안 UV 광선에 노출시킨 후, 노출된 표면을 서로 겹쳐 놓습니다. PDMS가 커버 글라스에 잘 부착되도록 하고 기포를 제거하기 위해 칩의 측면 주변을 가볍게 두드립니다.

채널 구조의 윗부분을 두드리지 마십시오. 마이크로 패드가 커버나 유리에 부착될 수 있기 때문입니다. 새로 제작한 미세유체 셋업을 100 °C의 핫플레이트 위에 1시간 동안 놓아둡니다.

그 후, PDMS 칩의 가장자리를 살짝 들어 올려 커버 글라스와 PDMS 칩의 접합 상태를 확인합니다. 가장자리가 들리지 않는다면 접합이 성공적으로 이루어진 것이며, 칩을 사용할 준비가 된 것입니다. 세포 주입을 위해 미세유체 칩을 준비하려면, 칩의 유리 부분과 홀더의 금속 부품 사이에 실리콘 겔을 넣고 칩을 금속 홀더에 배치합니다.

방수 씰을 형성하려면 유리가 깨지지 않도록 너트를 조심스럽게 조입니다. 칩의 측면 채널과 배출 채널에 가는 튜브를 연결합니다. 핀셋을 사용하면 펀칭된 구멍에 튜브를 더 쉽게 삽입할 수 있습니다.

50 milliliter 루어락 주사기에 배양액을 채웁니다. 주사기 내의 공기를 제거하고 이를 순차적으로 주사기에 연결합니다. 20 gauge 루어 스터브, 짧고 두꺼운 튜브 및 얇은 튜브를 통해 여과합니다.

시린지를 시린지 펌프에 장착하고 얇은 튜브가 배지로 완전히 채워질 때까지 펌프를 빠르게 작동시킵니다. 시린지에 연결된 얇은 튜브를 입구 채널에 삽입하고, 10 µL/min의 속도로 배지가 칩을 통해 흐르도록 합니다. 칩에서 나오는 배지를 페트리 접시에 수집합니다.

배지는 측면 채널을 통해 배출됩니다. 이는 대형 터프 태그(tough tag)로 제작된 측면 채널과 배출 채널 사이의 저항 차이 때문입니다. 칩을 현미경 스테이지 위에 놓고 패드에 초점을 맞추십시오.

본 절차를 시작하려면, 5 mL 루어 팁 시린지를 20게이지 루어 스터브와 두꺼운 튜브에 연결하십시오. 칩에 주입할 세포 현탁액 약 1 mL를 시린지에 채웁니다. 권장되는 세포 주입 농도는 mL당 1~5 × 10⁶ cells입니다.

시린지 펌프의 유량을 0.5 µL/min으로 낮춥니다. 이 절차에서 가장 어려운 부분은 마이크로칩에 세포를 로딩하는 단계입니다. 이 과정은 대개 어느 정도의 숙련도가 필요합니다.

세포 현탁액이 담긴 주사기를 배출 채널의 튜브에 연결합니다. 주사기의 플런저를 눌러 세포를 주입합니다. 접안렌즈나 컴퓨터 화면을 통해 세포가 들어와 마이크로 패드 아래에 안착하는 모습을 조심스럽게 관찰합니다.

패드 아래에 충분한 세포가 안착될 때까지 플런저를 계속 눌러 압력을 유지하십시오. 최적의 부하량은 패드당 1~3개의 세포입니다. 세포 로딩에 사용한 시린지를 분리하고, 사이드 채널을 더 높은 유속으로 몇 분간 플러싱하여 기포나 아직 칩을 빠져나가지 않은 세포를 제거하십시오.

시린지 펌프의 유량을 다시 0.5 µL/min으로 낮추고, 끝부분에 카테터 플러그가 있는 굵은 튜브를 연결하여 사이드 채널을 폐쇄합니다. 시린지 펌프의 유량을 최종적으로 1~5 µL/min까지 높입니다. 유량은 배지와 효모 균주에 따라 달라질 수 있습니다.

실험 목적에 적합한 현미경 및 카메라 설정으로 동영상 촬영을 시작하십시오. 이것은 YPD에서 성장하는 단일 야생형 E 세포의 타임랩스 동영상 예시입니다. 배지 이미지는 10분마다 촬영되었으며, 표시된 스케일 바는 5 µm를 나타냅니다.

세포는 사멸 전까지 총 30개의 출아(bud)를 생성합니다. 복제 수명은 단일 모세포가 생성한 출아의 수를 측정하여 결정할 수 있습니다. 이 데이터는 생성된 출아의 수 또는 세대 수를 기준으로 생존 세포의 백분율을 도식화하여 수명 곡선으로 변환합니다.

이 그림은 야생형 효모 균주와 두 가지 돌연변이 균주에서 얻은 수명 곡선의 예를 보여줍니다. SER2 유전자의 결손은 수명을 단축시키는 반면, FOB1 유전자의 결손은 수명을 연장시킵니다. 연령에 따른 미토콘드리아 형태는 미세유체 장치를 사용하여 연구할 수 있습니다.

미토콘드리아로 표적되는 ILV 3G FP를 발현하는 BY 7 42 야생형 효모 세포를 사용하여 노화 실험을 수행하였습니다. 이 그림에서, 단일 세포 내 미토콘드리아 형태의 노화 관련 변화를 보여주는 대표적인 예시가 흰색 화살표로 표시되어 있습니다. 모든 이미지는 동일한 배율로 조정되었으며, 스케일 바는 5 µm를 나타냅니다.

두 번째 타임랩스 영상은 연령에 따른 미토콘드리아 형태를 관찰한 실험에서 ILV 3G FP를 발현하는 단일 세포를 촬영한 것입니다. 이미지는 30분마다 촬영되었으며, 스케일 바는 5 µm를 나타냅니다. 이 마지막 그림은 동일한 세포 집단에서 첫 번째 출아 전, 10회의 출아 후, 그리고 사멸 전의 서로 다른 복제 연령에서 관찰된 미토콘드리아 형태를 보여줍니다.

관형, 분절된 관형, 점 및 큰 점을 포함하는 각 형태학적 클래스의 예시 이미지가 포함되어 있습니다. 중년 세포에서 관찰되는 형태학적 변화는 세포 분열 과정을 지속적으로 모니터링하여 이전에 보고된 결과와 유사합니다. 이 방법은 효모 세포가 왜 노화하는지, 어떤 표현형 변화가 일어나고 있는지, 그리고 이러한 변화가 효모의 복제 수명에 어떻게 영향을 미치는지와 같은 효모 복제 노화의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 영상을 시청하신 후에는 기본적으로 모든 형광 현미경을 사용하여 직접 마이크로 칩을 제작하고 세포의 복제 노화를 연구하는 방법을 익히게 될 것입니다.