증식하는 연속 고해상도 현미경으로 관찰 신진 효모의 노화

이 절차의 전반적인 목표는 전체 복제 수명 동안 단일 하플로 효모 세포를 추적하는 것입니다. 첫 번째 단계는 마이크로 패드 어레이를 포함하는 미세유체 칩을 만드는 것입니다. 다음으로, 효모 세포는 미세유체 칩에 적재되며, 마이크로 패드 아래의 영역은 효모 세포의 직경과 비슷한 높이를 갖기 때문에 세포가 그곳에 침전됩니다.

그 후, 갇힌 효모 세포 위에 신선한 배지의 지속적인 흐름이 적용되고, 떠오르는 딸 세포는 배지 명시야와 형광의 흐름에 의해 씻겨 나갑니다. 현미경 검사는 노화 효모 세포에서 발생할 수 있는 세포 또는 세포 소기관 형태, 단백질 발현 및 단백질 국소화의 변화를 시각화하는 데 사용됩니다. 기존 현미해부 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 노동 집약적이지 않고 개별 효모 세포의 전체 수명에 대한 장기간 연속 현미경 이미지를 얻을 수 있다는 것입니다.

이 방법은 복제 노화에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 장기간에 걸쳐 지속적인 현미경 관찰이 필요한 연구에도 사용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 마이크로 파이크 칩 생산의 특정 단계에서 주의를 기울여야 하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 더하여, micro feic 칩으로 세포의 선적은 약간 경험을 요구할지도 모른다.

실리콘 웨이퍼 몰드는 소프트 리소그래피로 생산됩니다. 제작에 대한 자세한 내용은 동봉된 프로토콜을 참조하십시오. 텍스트: 거친 태그 조각을 약 0.5mm x 3mm의 얇은 스트립으로 자릅니다.

메스를 사용하여 입구 채널과 마이크로 파드레 사이의 채널 구조 위에 약간 있는 실리콘 웨이퍼 몰드에 스트립을 조심스럽게 놓습니다. 다음으로, 유리 페트리 접시를 알루미늄 호일의 이중층으로 덮고 웨이퍼를 페트리 접시에 넣습니다. 알루미늄 호일은 미세유체 칩을 생산하는 동안 웨이퍼와 페트리 접시 사이에서 PDMS가 작동하는 것을 방지합니다.

미세유체 칩을 만드는 절차를 시작하려면 저울에 빈 플라스틱 컵을 놓고 저울을 찢습니다. 플라스틱 컵에 PDMS 베이스 40g을 붓습니다. PDMS 경화제를 1:10의 중량 대 중량 비율로 첨가하며, 이 경우 약 4밀리리터입니다.

몇 분 동안 철저히 혼합된 일회용 플라스틱 피펫을 사용하여 나중에 PDMS의 적절한 중합을 보장하기 위해 혼합물을 잘 혼합하는 것이 중요합니다. 유리 페트리 접시의 웨이퍼 위에 PDMS를 붓습니다. 페트리 접시의 PDMS 혼합물에는 Degas에 많은 거품이 포함되어 있습니다.

PDMS는 모든 기포가 제거되면 약 30분 동안 진공 펌프에 연결된 건조제에 페트리 접시를 놓습니다. 핫 플레이트 위에 웨이퍼가 있는 페트리 접시를 1시간 동안 섭씨 120도에서 놓고 섭씨 65도에서 다시 한 시간 동안 놓아 PDMS를 중합합니다. 2시간 후, 유리 페트리 접시에서 알루미늄 호일 웨이퍼와 중합 PDMS를 제거합니다.

웨이퍼 뒷면에서 알루미늄 호일을 PDMS로 벗겨냅니다. 그런 다음 웨이퍼 상단에서 PDMS 층을 조심스럽게 들어 올립니다. 채널이 벤치를 향하도록 PDMS 레이어를 거꾸로 놓고 메스로 PDMS에 각인된 단일 칩 디자인을 조심스럽게 잘라냅니다.

채널 가장자리 주위에 약 3mm의 PDMS를 유지하십시오. 다음 단계는 이 다이어그램에 표시된 대로 PDMS의 입구 출구와 측면 채널 끝에 구멍을 뚫는 것입니다. 구멍을 뚫으려면 20게이지 루어 스터브를 PDMS를 직선으로 끝까지 밀어 넣습니다.

스텁을 빼내기 전에 루어 스텁에서 PDMS 열을 제거하십시오. 다시 말하지만, 이렇게 하면 PDMS 컬럼이 새로 펀칭된 구멍을 막는 것을 방지할 수 있습니다. 모든 구멍이 뚫리면 스카치 테이프를 바르고 즉시 테이프를 제거하여 칩 표면에 먼지 입자와 잔류 PDMS가 없는지 청소합니다.

마찬가지로 칩이 부착될 덮개 유리를 청소합니다. 칩과 커버 유리를 벤치탑 UV 오존 클리너의 UV 램프 아래에 놓고 함께 접착해야 하는 측면이 램프를 향하도록 하고 램프를 6-8분 동안 UV 광선에 노출시키고 노출된 표면을 서로 위에 놓습니다. 칩 측면을 부드럽게 두드려 PDMS를 커버 유리에 부착하고 기포를 제거합니다.

마이크로 패드가 커버에 부착될 수 있으므로 채널 구조 상단을 두드리지 마십시오. 유리도. 새로 만든 미세유체 설정을 섭씨 100도의 핫 플레이트에 1시간 동안 놓습니다.

그런 다음 PDMS 칩의 가장자리를 약간 들어 올려 커버 유리와 PDMS 칩의 접착을 확인합니다. 이것이 가능하지 않으면 본딩이 성공하고 칩을 사용할 준비가 된 것입니다. 셀 로딩을 위해 미세유체 칩을 준비하려면 칩의 유리와 홀더의 금속 부분 사이에 실리콘 젤이 있는 금속 홀더에 칩을 놓습니다.

방수 씰을 만들려면 유리가 깨지지 않도록 너트를 부드럽게 조입니다. 얇은 튜브를 칩의 측면 채널과 출구 채널에 연결합니다. 핀셋을 사용하면 펀칭된 구멍에 튜브를 더 쉽게 삽입할 수 있습니다.

50ml 루어 잠금 주사기에 배양 배지를 채웁니다. 주사기에서 공기를 제거하고 주사기에 순차적으로 연결합니다. 20게이지 루어 스터브, 짧고 두꺼운 튜브 및 얇은 튜브를 필터링합니다.

주사기를 주사기 펌프에 넣고 얇은 튜브가 매체로 완전히 채워질 때까지 펌프를 빨리 감습니다. 주사기에 연결된 얇은 튜브를 주사기의 입구 채널로 밀어 넣고 매체가 분당 10마이크로리터의 속도로 칩을 통해 흐르도록 합니다. 페트리 접시에 칩을 남기는 매체를 수집합니다.

매체는 사이드 채널을 통해 소진됩니다. 큰 터프 태그로 만든 사이드 채널과 콘센트 채널 사이의 저항 차이 때문입니다. 현미경 스테이지에 칩을 놓고 패드에 현미경의 초점을 설정합니다.

이 절차를 시작하려면 5밀리리터 루어 팁 주사기를 20게이지 루어 스터브와 두꺼운 튜브에 연결합니다. 칩에 로드할 약 1ml의 셀 현탁액을 주사기에 로드합니다. 로딩을 위해 선호되는 셀 수는 밀리리터당 6개 셀 중 10개에 1을 곱한 값에서 5개 사이입니다.

주사기 펌프의 유속을 분당 0.5마이크로리터로 줄입니다. 이 절차에서 가장 어려운 부분은 세포를 마이크로메 칩에 로드하는 것입니다. 이것은 일반적으로 약간의 연습이 필요합니다.

세포 현탁액이 들어 있는 주사기를 출구 채널의 튜브에 연결합니다. 주사기의 플런저를 눌러 세포를 로드합니다. 세포가 들어오고 안구 또는 컴퓨터 화면을 통해 마이크로 패드 아래에 정착하는 것을 부드럽게 관찰하십시오.

패드 아래에 충분한 세포가 가라앉을 때까지 플런저에 대한 압력을 유지하십시오. 최적의 부하는 패드당 1-3개의 셀입니다. 세포 로딩에 사용되는 주사기를 분리하고 더 높은 유속으로 몇 분 동안 측면 채널을 플러시하여 기포 및/또는 아직 칩에서 빠져나오지 않은 세포를 제거합니다.

주사기 펌프의 유량을 다시 분당 0.5마이크로리터로 줄이고 끝에 카테터 플러그가 있는 두꺼운 튜브에 연결하여 측면 채널을 닫습니다. 주사기 펌프의 유량을 분당 1-5마이크로리터의 최종 유량으로 증가시킵니다. 유속은 배지 및 효모 균주에 따라 달라질 수 있습니다.

실험의 목적에 적합한 현미경과 카메라 설정으로 동영상을 시작합니다. 이것은 YPD에서 자라는 단일 야생 E형 세포의 타임랩스 동영상의 예입니다. 중간 크기의 이미지는 10분마다 촬영되었으며 방금 표시된 눈금 막대는 5마이크로미터를 나타냅니다.

세포는 죽기 전에 총 30개의 새싹을 생산합니다. 복제 수명은 단일 모세포가 생산하는 새싹의 수를 세어 결정할 수 있습니다. 이 데이터는 생산된 새싹의 수 또는 세대 수에 대해 생존 가능한 세포의 백분율을 표시하여 수명 곡선으로 변환됩니다.

이 그림은 야생형 효모 균주와 두 개의 돌연변이 균주에 대해 얻은 수명 곡선의 예를 보여줍니다. SER 2 유전자를 삭제하면 수명이 짧아지고, FOB 1 유전자를 삭제하면 수명이 길어집니다. 나이의 함수로서의 미토콘드리아 형태학은 미세유체 장치를 사용하여 연구할 수 있습니다.

미토콘드리아를 표적으로 하는 ILV 3G FP를 발현하는 BY 7 42 야생형 효모 세포로 노화 실험을 수행했습니다. 이 그림에서, 단일 세포에서 미토콘드리아 형태의 연령 관련 변화의 대표적인 예는 흰색 화살표로 표시됩니다. 모든 이미지의 크기는 동일하게 조정되며 배율 막대는 5마이크로미터를 나타냅니다.

두 번째 타임랩스 영상은 나이에 따른 미토콘드리아 형태학을 관찰한 실험에서 ILV 3G FP를 발현하는 단세포입니다. 이미지는 30분마다 촬영되었으며 눈금 막대는 5마이크로미터를 나타냅니다. 이 마지막 그림은 10개의 새싹이 생긴 후 그리고 죽기 전에 첫 번째 새싹을 생산하기 전에 서로 다른 복제 연령에서 동일한 세포 세트에서 관찰된 미토콘드리아 형태를 보여줍니다.

각 형태학 클래스의 예시 이미지에는 tubular, fragmented tubular, spot and large spots가 포함됩니다. 중년 세포에서 볼 수 있는 형태 변화는 세포가 분열할 때 지속적으로 모니터링함으로써 이전에 보고된 것과 유사합니다. 이 방법은 효모 세포가 노화되는 이유, 어떤 표현형 변화가 일어나고 있는지, 이러한 변화가 효모의 복제 수명에 어떤 영향을 미치는지와 같은 효모 복제 노화의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 기본적으로 모든 형광 현미경을 사용하여 자신만의 마이크로 칩을 만들고 세포의 복제 노화를 연구하는 방법을 알게 될 것입니다.