Name: 인간의 심장 조직에서 혈관 주위 능성 전구체 세포 집단의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: 학습하세요 인간 심장 조직에서 CD146+CD34- 페리사이트와 CD34+CD146- 어드벤티셜 세포를 분리하는 방법을. 이 기술은 심장 재생 연구와 허혈성 심질환 치료에 활용됩니다.

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저자는 유세포 분석에 대한 전문적인 도움을 준 에든버러 대학의 Shonna Johnston, Claire Cryer, Fiona Rossi 및 Will Ramsay와 피츠버그 대학의 Alison Logar 및 Megan Blanchard에게 감사의 뜻을 전합니다. 또한 인체 조직을 확보하는 데 도움을 준 Anne Saunderson과 Lindsay Mock에게도 감사드립니다. 인간 성인 및 태아 심장 조직 샘플은 각각 NHS 스코틀랜드 테이사이드 의료 연구 윤리 위원회와 NHS 로디언 연구 윤리 위원회(REC08/S1101/1)의 완전한 윤리 허가를 받아 조달되었습니다. 이 연구는 의학연구위원회(Medical Research Council, BP), 영국심장재단(British Heart Foundation, BP), 펜실베이니아 연방(Commonwealth of Pennsylvania, BP), 피츠버그 아동병원(Children's Hospital of Pittsburgh, BP), 국립보건원(National Institute of Health R01AR49684, JH) 및 R21HL083057(BP), 피츠버그 대학교(University of Pittsburgh)의 Henry J. Mankin 기부 의장(Henry J. Mankin Endowed Chair)의 보조금으로 지원되었습니다. JEB는 영국심장재단(British Heart Foundation) 우수 연구 센터(Centre of Research Excellence) 박사 연수상(RE/08/001/23904)의 지원을 받았습니다. WC는 미국심장협회(American Heart Association)의 박사 전 연구원(predoctoral fellowship, 11PRE7490001)의 일부 지원을 받았습니다.

인간의 심장 샘플 1. 처리 <ol><li> 모든 유체, 용기, 악기 및 전용 운영 지역은 멸균 있는지 확인합니다. </li><li> 20 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 얼음에 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (P / S)을 함유하는 냉각 된 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM)으로 이루어지는 기억 매체 (조직 은행 또는 수술 팀 조달) 심장 조직 샘플을 놓고 교통 3. </li><li> 기억 매체로부터 심장 샘플을 제거하고, 2 % FBS와 1 % P / S가 보충 인산 완충 용액 (PBS)으로 이루어지는 세척 배지로 세척 하였다. 샘플을 취급 할 경우, 대형 선박 또는 심낭을 파악하고 심근의 분쇄 최소화하기 위해 좋은 팁 집게를 사용합니다. </li><li> 페트리 접시에 세척 매체에 샘플을 잠수함과 3 설명한 바와 같이 살균 홍채 가위와 뾰족한 집게로 심낭, 내막과 큰 혈관을 제거합니다. </li><li> 나머지 myoca 컷하나의 측면 면도날이나 날카로운 홍채 가위를 사용하여 약 1mm 3의 작은 조각으로 rdium. 참고 : 샘플을 즉시 처리하는 경우 최고 세포 수율을 얻을 수 있습니다. 지연이 불가피한 경우, 새로운 기록 매체에 처리 된 심장 조직의 스토리지 (&gt; 1cm 3 조직 당 5 ㎖)를 72 시간 동안 4 ℃에서 그러나 아마도 셀 수율 관련된 감소로 가능하다. </li></ol> 세포의 조직과 분리 2. 소화 <ol><li> 갓 1.5 ml를 포함하는 소화 솔루션을 구성하는 콜라겐의 각 I하는 수조에서 37 ° C 따뜻한 (0.5 밀리그램 / DMEM에서 ml의 모든) 콜라게나 제 II, 및 콜라게나 제 IV. 참고 : 볼륨 및 콜라게나의 농도가 약 1cm 3의 샘플에 적합하다. </li><li> 100 μm의 스트레이너를 통해 정지 조직 조각을 필터와 PBS로 두 번 씻는다. 멸균 30 ML의 컨테이너에 조직 조각을 전송단단히 밀봉 뚜껑. 참고 : 짧은 넓은 냄비보다는 키가 좁은 튜브가 더 나은 결과를 제공합니다. 대안 적으로, 멸균 50 ㎖ 튜브에 조직 조각을 넣고, 30 ml의 용기를 사용할 수없는 경우에는 가로로 배치했다. </li><li> 모든 소화 용액 (4.5 ml의 총)를 추가하고 120 rpm으로 설정 37 ° C 흔들어 물을 욕조에 밀봉 된 비닐 봉투 안에 용기를 놓습니다. 또한, 120 rpm으로 설정 가열 궤도 통에 파라핀 필름과 장소 용기를 밀봉. </li><li> 15 분 후 제거하고, 추가로 15 분 동안 교체하기 전에 세 번 포트를 반전. 분리하고 20 % FBS와 1 % P / S가 보충 된 DMEM 5 ㎖로 급냉 콜라게나. </li><li> 부드럽게 어떤 조직 덩어리를 파괴하는 10 ㎖의 혈청 학적 피펫으로 10-20 회 피펫 팅하여 다이제스트를 씹다. 소화되지 않은 물질을 제거하여 단일 세포 현탁액을 얻었다 100 μm의 70 ~ 40 μm의 마지막 μm의 셀 스트레이너 현탁액 순차적 필터. 노트:효소 분해 과정에서 debrisgenerated 셀을 피하기 위해 셀 스트레이너 사이에 세척하지 마십시오. </li><li> 원심 4 분 동안 200 XG에 세포 현탁액을 조심스럽게 상층 액을 디 캔트 세척 배지 4 ㎖로 희석하기 전에 실온에서 2 분 동안 버퍼 용균 적혈구 1 ㎖의 펠릿을 다시 일시. </li><li> 원심 분리 단계를 반복하여 세척 배지 1 ㎖의 펠릿을 다시 일시. 잘 혼합 셀 카운트하는 세포 현탁액 10 μL를 취할. </li><li> 트리 판 블루 염색의 10 μL와 세포 현탁액의 10 μl를 혼합 세포 계수에 대한 표준 혈구의 혼합물의 10 μl를 배치합니다. 코너 광장 당 평균을 얻기 위해 4로 네 모서리의 사각형에 존재하는 밝은 둥근 세포의 수 (각각 여섯 작은 사각형으로 분할)과 격차를 계산합니다. 스테인 희석 인자를 고려하여 2 평균 곱 후 104 샘플 1 ㎖ 당 세포의 수를 수득함으로써. </li></ol><ol><li> 세포 현탁액에 마우스 혈청 50 μl를 추가하고 20 분 결합 비 특이 항체를 차단하기 위해 4 ° C에서 품어. </li><li> 원심 4 분 동안 200 XG에 마우스 혈청과 세포 현탁액, 상등액을 제거하고 100 ㎕의 당 1 × 106 세포의 농도로 세척 배지에 재현 탁. </li><li> 나누어 두 폴리스티렌 둥근 바닥에 50 ㎕의 이소 타입 및 염색 컨트롤의 세포 현탁액을 각 튜브에 다음 다색 염색하는 제 튜브에 남아있는 볼륨을 배치 유세포. </li><li> 멀티 컬러 염색에 대한 단일 세포 현탁액에 : (100 모두 1) CD34-PE, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-를 PerCP-Cy5.5 및 CD146-AF647 항체를 추가합니다. 이소 타입 제어를 위해, PE-, APC-Cy7-, PE-Cy7-,를 PerCP-Cy5.5- 및 AF647 - 복합 이소 항체의 동등한 볼륨을 추가합니다. 조심스럽게 피펫은 세포와 항체를 혼합하고 20 4 ° C에서 모든 관을 배양하기어둠 속에서 분. </li><li> 바닥 유동 세포 계측법 튜브 라운드 다섯 폴리스티렌에 세척 배지 100 ㎕에 긍정적 인 구슬 한 방울을 추가하여 보상 제어 구슬을 준비합니다. 개별적으로 5 튜브의 각 : (100 모두 1) CD34-PE, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-를 PerCP-Cy5.5 및 CD146-AF647 항체를 추가합니다. 어둠 속에서 20 분 동안 4 ° C에서 모든 튜브를 품어. </li><li> 배양시 세포 수집 관 내피 성장 중간 2 ~ 4 ° C에서 (EGM-2) 배지 및 장소 500 μl의 각을 준비합니다. </li><li> 항체 부화 후, 언 바운드 항체를 제거하기 위해 세포와 구슬을 씻어 세척 매체의 5 mL를 추가합니다. 원심 분리기 4 분 200 XG에 모든 튜브. 세척 및 원심 분리 단계를 반복합니다. 세포를 다시 일시 중단 할 때 조심스럽게 조심스럽게 상층 액과 피펫을 가만히 따르다. </li><li> 250 μL 당 약 1 × 106 세포의 농도로 세척 배지에 재현 탁. 세척 m 100 ㎕의 구슬을 다시 중단edium. </li><li> 어둠 속에서 얼음에 셀 소터 모든 세포와 비드 현탁액을 전송. 긍정적 인 비드 보상 제어 튜브에 부정적인 구슬 1 방울을 추가하고 형광 보상을 설정하려면 다음을 사용합니다. </li><li> 백그라운드 형광을 확립하고, 다음에 전압을 설정하기 위해 제조자의 지시에 따라 염색 대조군 세포 실행 FSC 150V 단계; SSC 290V; V450 / 50 350V; V710 / 50 620V; B530 / 30 400V; B710 / 50 530V; YG780 / 60 (460); R670 / 30 480V; R780 / 60 460V. 제조자의 지시에 따라 실행 아이소 타입 컨트롤 비특이적 결합과 관련된 배경 형광 임계 값을 설정한다. (그림 1) 멀티 색상을 염색 샘플을 실행하고 수집 튜브에 주연 세포 및 외막 세포 인구를 수집합니다. 참고 : 최적의 생균 수익률은 혈관 주위 세포의 총 살아있는 세포 분리의 약 3 %와 외막 세포를 4 %이다. </li></ol> 4. 세포 배양 <ol><li> FACS 정렬의 결과에 따라 적당한 크기 배양 플레이트를 선택합니다. 전체 우물을 성장 영역의 cm 2 당 멸균 0.2 % 젤라틴 용액 100 μl를 추가하고 코트에 수동으로 선동. 10 분 동안 4 ° C에서 접시를 품어 완전히 젤라틴 용액을 제거합니다. 배양 플레이트를 준비하는 동안 얼음에 수집 된 세포를 유지합니다. 참고 : 젤라틴 코팅 문화 표면에 30,000 40,000 세포 / cm 2의 밀도로 접종 할 때 갓 분류 혈관 주위 세포 및 외막 세포가 잘 성장한다. </li><li> 4 분 동안 200 XG에 새로 수집 된 세포를 가볍게 원심 EGM-2.Seed 적당량 젤라틴 - 코팅 된 플레이트에 대한 세포의 세포 펠렛을 다시 일시. 주 : 셀의 실제 개수는 잘 EGM-2 첨가되는 양에 따라 시드되는 판의 선택에 의존한다. 예를 들어, 0.5 mL 및 1 ml의 EGM-2는 각각 48, 24 웰 플레이트 웰 당 필요하다. </li><li> 환 EGM-2 혈관 주위 세포 성장 매체 (셀 ()은 적어도 72 시간 후 플레이트에 정착하여 부착 한 후 DMEM 모두 외막 세포 및 외막 세포를 20 % FBS, 1 % P / 초)로 보충. 그때부터 미디어마다 72 시간을 변경합니다. C 5 % CO 2, 37 ℃에서 초기 및 이후의 모든 배양을 수행하십시오. </li><li> 혈관 주위 세포 및 외막 세포가 80~90%의 합류에 도달하면 0.05 % 트립신 EDTA를 사용하여 세포를 떼어 놓다. 코팅 폴리스티렌 배양 플레이트 상에 3 비율 : 1 다음에 통로 혈관 주위 세포를 세포 배양 배지에 재현 탁하고, PBS 20 % FBS, 4 분 동안 200 XG 원심 분리기로 켄 칭하고. 전방 통로 (2)에서, 1 유로에 세포 : 5의 비율 (또는 대략 7,000 세포 / cm 2) 코팅 폴리스티렌 배양 접시 또는 플라스크이다. </li></ol>

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</ol>

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증가 증거는 부상 후 성인 인간의 마음의 제한된 재생 능력을 지원합니다. 부상 마음에 이러한 재생 반응에 대한 책임 네이티브 전구 세포의 식별 및 특성화 관련 메커니즘 및 신호 전달 경로의 이해와 치료 이러한 세포를 활용하는 방법의 개발 모두에 중요하다. 이전 프로토콜 인간 골격근 (25)로부터 혈관 주위 전구 세포 서브 세트의 분리를 설명 하였다. 그러나, 심장 조직에 이러한 기술의 직접적인 응용 프로그램은 종종 매우 가난한 세포 수율을 초래한다. 따라서, 우리는 인간 심근 생검에서 혈관 주위 세포 전구체, 즉, 외막 세포 및 외막 세포의 두 개의 분리 된 부분 집단을 풍부하게하는 두 서브 세트들의 동시 정제를 용이하게하기 위해 프로토콜에 큰 조정을 만들었다. 의 S에서 모두 세포 집단의 분리AME 샘플뿐만 아니라 소중한 심장 조직 생검의 사용을 최적화뿐만 아니라 별개의 혈관 주위 세포 하위 집합의 직접 비교를 할 수 있습니다. <p class="...

마음은 긴 후 유사 분열 기관으로 간주되고있다. 그러나 최근의 연구는 성인 인간의 마음 (1) 제한 심근 매출의 존재를 증명하고있다. 심근 분화 가능성을 가진 기본 줄기 / 전구 세포는 혈관 주위 전구 세포 2, 3, 가장 최근에 성인 설치류와 무서-1 +를 포함하여 인간의 마음, C-키트 +, cardiosphere 형성의 심근 내에서 확인할하고있다. 이러한 세포는 세포 이식 또는 원위치 증식 자극으로 심장 수선 / 재생을 향상시키는 목적으로 치료를위한 매력적인 후보를 나타낸다. 중간 엽 줄기 / 간질 세포 (MSC)가 심혈관 수리 6으로 MSC의 치료 응용 4,5- 임상 시험은 여러 병리학 적 조건에서 수행 된 거의 모든 인간의 조직으로부터 분리 된, 이식편 대 숙주 질병 7 </sup&gt; 및 간경변 8. 유익한 효과에 중간 엽 줄기 세포의 능력에 기인 한 : 염증 9의 사이트에 홈; 상이한 세포 유형으로 분화 10; 프로 수복 분자 (11)을 분비; 호스트 면역 반응 (12)을 변조한다. 중간 엽 줄기 세포의 분리는 전통적으로 플라스틱 기판에 자신의 우선 준수에 의존하고있다. 그러나, 세포의 생성은 일반적 인구 13 현저 균질하다. 에서 주요 혈관 주위 세포 마커의 조합 (FACS)을 정렬 형광 활성화 된 세포를 사용하여, 우리는 다 능성 MSC와 같은 전구체 인구 (- / CD34 - / CD45 - - / CD56 CD146 + / CD31)를 분리하고 정제 할 수 있었다 성인 골격 근육과 흰색 지방 (14) 등 다양한 인체 조직. 다양한 비 심장 조직에서 혈관 주위 세포 집단은 줄기 / 전구 세포의 특성있는 것으로 나타났다차 심장 혈관 설정에서 임상 적 사용을 위해 연구되고있다. 주위 세포, 가장 잘 알려진 혈관 주위 세포의 서브 세트 중 하나가 새로운 용기 (15)의 개발을 포함하여 여러 병태 생리 학적 역할을 이종 집단이며, 혈압 (16), 및 혈관 완전성 (17, 18)의 유지의 조절. 여러 조직에 도시 된 바와 같이, 혈관 주위 세포의 특정 서브 세트는 기본적 MSC 항원을 발현하고 FACS 정제 후 14 주 배양에서의 MSC와 같은 표현형을 유지. 또한, 이들 세포는 안정하게 배양 내에서의 장기 표현형을 유지하고, MSC들 (19, 20)과 유사한 다중 - 계통 분화 잠재력을 나타낸다. 이러한 결과는 혈관 주위 세포가 어려운 MSC (14)의 기원 중 하나입니다 것이 좋습니다. 혈관 주위 세포의 치료 가능성은 심근 흉터의 감소와 함께 시연 및 ischemically 부상으로 이식 다음 심장 기능을 향상되었습니다마음 21. 최근에, 우리는 성공적으로 인간의 심근에서 혈관 주위 세포를 정제 및 골격 근육 생성 3의 부재로 자신의 MSC와 같은 표현형과 다 능성 (지방 조직, 연골 및 골 형성)을 보여 주었다. 또한, 심근 혈관 주위 세포는 다른 기관으로부터 정제 대조와 비교하여 차등 cardiomyogenic 전위 및 혈관 신생 능력을 나타냈다. 혈관 주위 능성 줄기 / 선조 세포의 세포 외막의 제 인구 양성 CD34 식 (22)에 기초하여 인간 복재 정맥으로부터 분리되었다. 정맥 외막 세포 클론 원성 포텐셜 중배엽 분화 능력 및 체외 proangiogenic 가능성이있는 것으로 밝혀졌다. 마우스의 ischemically 부상 마음에서 이러한 세포 이식 간질 성 섬유증의 감소, 혈관과 심근 혈류의 증가, 감소, 심실 DIL 초래ATION, 증가 된 심장 배출 분율 23. 흥미롭게도, 지방 외막 세포를 자극 (24)와 주연 세포 표현형의 채택을 제안, CD34의 발현을 잃고 안지 오포 이에 틴 II 치료에 대한 반응에 문화에서 CD146 발현을 상향 조절하는 것으로 나타났다. 심장 내에서, 그러나, 외막 세포 집단은 아직 전향 FACS 및 / 또는 잘 특징으로 정제되지 않았다. 다음 절에 설명 된 세포 격리 절차를 활용하여, 우리는 현재 심근 외막 세포의 특성 및 재생 응용 프로그램에 대한 자신의 가능성을 조사하고있다. 여기서 우리는 분리하고 인간의 태아 또는 성인 심근의 혈관 주위 줄기 / 전구 세포의 두 개체군을 정화하는 방법을 설명합니다. 이 미래의 세포 분리 방법을 비교 연구하고 furthe에 대한 인간의 마음 생검에서 동종 혈관 주위 줄기 / 전구 세포 하위 집합을 얻기 위해 연구를 가능하게 할 것이다R 다양한 심장의 병리 적 상태에서의 치료 가능성을 탐구한다.

<table><tbody><tr><td>AbC 안티 마우스 비드 키트</td><td>분자 프로브</td><td>A-10344</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 I</td><td>Gibco</td><td>17100-017</td><td>필요에 따라 분말을 재구성하고 필터 살균</td></tr><tr><td>Collagenase II</td><td>Gibco</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Gibco</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human CD34-PE</td><td>BD Pharmingen 555822</td><td></td><td>멸균 유지</td></tr><tr><td>안티 휴먼 CD45-APC-Cy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>557833</td><td>멸균</td></tr><tr><td>안티 휴먼 CD56-PE-Cy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>557747</td><td>멸균</td></tr><tr><td>안티 휴먼 CD144-PerCP-Cy5.5</td><td>BD Pharmingen</td><td>561566</td><td>멸균</td></tr><tr><td>안티 휴먼 CD146-AF647</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA2141A647</td><td>멸균 유지</td></tr><tr><td>EGM2-BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 고포도당, 피루브산나트륨이 없는 GlutaMAX</td>가 부착될 때까지 세포 수집 및 배양용 <td>ThermoFischer Scientific</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>10500-064</td><td>분취량에서 동결하고 멸균 상태로 유지</td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1393</td><td>멸균수로 희석</td></tr><tr><td>IgG1k-PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>559320</td><td>멸균 유지</td></tr><tr><td>IgG1k-APC-Cy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>557873</td><td>멸균 유지</td></tr><tr><td>IgG1k-PE-Cy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>557872</td><td>멸균 유지</td></tr><tr><td>IgG1k-PerCP-Cy5.5</td><td>BD Pharmingen</td><td>561566</td><td>멸균 유지</td></tr><tr><td>IgG1k-647</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA1209A647</td><td>멸균</td></tr><tr><td>마우스 혈청</td><td>유지 Sigma Aldrich</td><td>M5905</td><td>Keep 멸균</td></tr><tr><td>파라핀 필름 - Parafilm M</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15979-063</td><td>분취량에 동결하고 멸균 유지</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 pH 7.4</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>10010-023</td><td>멸균 적</td></tr><tr><td>혈구 용해 완충액 유지 Hybri-Max</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R7757</td><td>멸균</td></tr><tr><td>Trypan 유지 블루 솔루션</td><td>시그마 알드리치</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA 0.5%(10x)</td><td>인비트로젠</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; FACSARIA FUSION</td><td>BD Pharmingen</td><td></td><td>형광 활성 세포 분류기</td></tr></tbody></table>

인간의 심장 조직에서 혈관 주위 능성 전구체 세포 집단의 분리

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

다분화능 중간엽 줄기세포/기질 세포(MSC)는 해부학적 조직 위치가 불분명한 상태에서 1차 조직 소화물로부터 플라스틱 부착을 통해 일반적으로 분리되었습니다. 최근 우리 그룹과 다른 연구자들이 여러 조직에서 혈관 주위 세포에 의해 정의된 혈관 주위 및 MSC 세포 마커 발현을 발견한 것은 다분능 혈관 주위 전구 세포의 특정 균질한 하위 집단을 전향적으로 분리하고 정제할 수 있는 기회를 제공했습니다. 우리는 이전에 인간 골격근에서 미세혈관 CD146+CD34- 주피세포 및 혈관 CD34+CD146- 외래 세포를 정제하기 위해 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하는 것을 입증했습니다. 본 명세서에서는 양성 및 음성 선택에 대해 정의된 세포 표면 마커 세트의 발현을 기반으로 FACS에 의해 인간 심근에서 이러한 두 개의 혈관 주위 세포 하위 집합을 동시에 분리하는 방법을 설명합니다. 따라서 이 방법은 기초 연구 및/또는 치료 조사에 사용하기 위해 다분출 심장 MSC 유사 전구체 세포의 두 가지 특정 하위 모집단을 사용할 수 있도록 합니다.

단일 세포를 전방 및 측면 산란 분포에 기초하여 파편과 이중선 구별 하였다. 라이브 세포는 DAPI 염색을 차지하기 위해 자신의 실패에 의해 확인되었다. 게이팅 전략이 라이브 전체 심근 세포의 분리 (도 1)의 이소 제어 라벨에 기초하여 선택되었다. 살아있는 세포에서 CD45 + 세포는 먼저 밖으로 게이트 된 CD56 + 세포 하였다. CD144 + 내피 세포 다음 CD56에서 제거 - 분획. 마지막 인구에서 CD146 + / CD34 - 혈관 주위 세포와 CD146 - / CD34 + 외막 세포는 수집 된 이후에 (그림 2)을 선택했다. 즉시 세포 수집 한 후, 각 모집단의 작은 샘플 (500 ~ 1,000 세포) 초기 정렬에 기록 된대로였습니다 세포의...

인간의 심장 조직 심근 재생에 적합 할 수있는 다 능성 혈관 주위 전구체 세포 집단을 항구. 주연 세포와 CD34 + CD146 - - 외막 세포, 인간 심근에서 여기에 설명 된 기술은 원시 혈관, 즉 CD34 + CD146와 연관된 두 능성 간질 세포 집단의 동시 분리 및 정제를 허용한다.

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

본 절차의 전체적인 목표는 인간 심장 조직에서 두 개의 별개 다능성 혈관주위 전구세포 집단을 분리하는 것입니다. 이 방법은 혈관주위 세포 집단의 하위 집합이 심장 재생 과정에 어떻게 기여하는지와 같은 심장 재생 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 선택된 주요 세포 부착 제거 기술을 통해 이질성이 감소하고 생존력이 향상된 전구세포 집단을 얻을 수 있다는 점입니다.혈관주위 줄기세포 아형이 심근 형성 잠재력을 가지고 있음이 밝혀졌기 때문에, 이 기술은 허혈성 심장 질환의 치료에 응용될 수 있습니다. 이 방법은 심장 재생에서 혈관주위 세포의 역할에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 심근 섬유화와 같은 심장 질환의 다른 측면을 조사하는 데에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 조직의 신선도로 인해 생존 세포를 사용해야 하므로 어려움을 겪을 수 있습니다.이 실험 절차를 시작하려면, 심낭, 주요 혈관 및 심방을 제거한 후 샘플을 페트리 접시의 세척액에 넣습니다. 다음으로, 심실 근육을 약 1㎟ 크기의 작은 조각으로 자르고, 세포 회수율을 극대화하기 위해 즉시 처리합니다. 그런 다음, 신선한 소화액을 제조하고 항온수조에서 37 °C로 가온합니다.그 후, 부유된 조직 조각들을 100 micron 체로 걸러내고 PBS로 2회 세척합니다. 조직 조각들을 밀폐 뚜껑이 있는 멸균된 30 milliliter 용기로 옮깁니다. 소화 용액을 첨가하고, 밀폐된 플라스틱 백에 넣은 용기를 120 RPM으로 설정된 37 degrees Celsius 진탕 항온수조에 넣습니다.15분 후, 용기를 세 번 뒤집어 섞어줍니다. 그런 다음, 다시 워터 배스에 넣고 15분 동안 더 반응시킵니다. 이후 용기를 꺼내어 20% FBS가 첨가된 5 mL의 DMEM으로 콜라게나제(collagenases)를 중화시킵니다.그 후, 10 mL 세롤로지컬 피펫으로 10~20회 정도 부드럽게 파이펫팅하여 소화된 조직을 마쇄함으로써 조직 덩어리를 제거합니다. 다음으로, 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 현탁액을 100 µm, 70 µm, 그리고 마지막으로 40 µm 세포 스트레이너에 순차적으로 여과합니다. 이어서 세포 현탁액을 200 x g에서 4분 동안 원심분리합니다.상층액을 조심스럽게 따라내고, 펠릿을 1 mL의 적혈구 용혈 완충액에 현탁하여 실온에서 2분 동안 둔 다음, 4 mL의 세척 배지로 희석합

isolation-perivascular-multipotent-precursor-cell-populations-from

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 프로토콜에서는 전자 와트 심방 부정맥 쥐에 트리거에 기여 쥐와 인간의 마음에서 (또한 심장 멜라닌 세포라고도 함) 멜라닌 세포와 같은 세포의 새로운 인구를 확인했다.

마우스의 심장에서 차 멜라닌 세포와 같은 세포를 분리

재생 애플리케이션에 이상적이다 인간의 골격 근육 항구 여러 멀티 혈통 전구체 집단 내에서 혈관. 내막 근육 조직에서 혈관 내피 세포, 혈관 주위 세포 매체 및 외막 세포 외막에서이 분리 방법은 혈관의 세 층 구조에서 각각 세 능성 전구 세포 집단의 동시 정제를 허용한다.

인간의 골격 근육에서 혈관 유래 다 능성 전구체의 분리

내피 전구 세포 (내피 전구 세포는) 결정적으로 허혈성 조직의 혈관 신생에 관여한다. 이 방법은 말초 혈액에서 인간 내피 전구 세포의 분리뿐만 아니라, 심장 수술 환자의 혈청 샘플에 대한 그들의 이동성 전위의 식별을 설명한다.

심장 수술 후 혈청 샘플의 영향을 건강한 자원 봉사자와 그들의 철새 잠재력에서 내피 전구 세포의 분리

여기, 우리는 기능, 계약, cardiomyocyte 같은 세포를 생성 하기 위해서는 인간 중간 엽 줄기 세포의 젊은 소스의 심장 감 별 법 잠재력을 효율적으로 활용 하는 방법을 제시 생체 외에서.

생체 외에서 기능 Cardiomyocyte-같은 세포로 인간 중간 엽 줄기 세포의 분화

여기 우리 Activin A와 overexpression-lentivirus 중재 Id1의 간단한 조합을 사용 하 여 첫 번째 심장 필드 같은 심장 창시자와 같은 심 실 cardiomyocytes 인간 만능 줄기 세포에서 생성 하는 확장 메서드를 설명 합니다.

첫 번째 심장 필드 같은 심장 창시자와 같은 심 실 Cardiomyocytes 인간 만능 줄기 세포에서의 세대

이 프로토콜 심장 조상 세포는 내 피 분화 기법을 설명합니다. 그것은 특히 혈 청 농도 셀 시드 밀도 미치는 내 피 분화 가능성에 초점을 맞추고.

낮은 혈 청 조건 하에서 심장 조상 세포에서 내 피 분화의 유도

이 글의 전반적인 목표, 특성화, 고립과 성인 마우스 심장에서 심장 줄기 세포 (CSCs)의 분화에 대 한 프로토콜을 표준화 하입니다. 여기, 우리가 murine CSCs 분리 밀도 그라데이션 원심 분리 방법 및 CSC, 확산, 문화와 cardiomyocytes로 차별화에 대 한 정교한 방법을 설명 합니다.

절연, 특성, 및 성인 마우스 심장에서 심장 줄기 세포의 분화

우리는 그들의 생물학 과 치료 잠재력의 기본적인 연구 그리고 조사를 위한 뮤린 심장 pericytes를 격리하고 정화하는 프로토콜을 설치했습니다.

뮤린 심장 pericytes의 격리 및 정화

이 방법의 목적은 전구 세포 사양 및 기능적 특성을 연구하기 위해 시험관 내에서 심장 필드 특이적 심장 전구 세포를 생성하고 심장 질환 모델링을 위한 챔버 특정 심장 세포를 생성하는 것이다.

마우스 심장 필드 특정 심장 전구 세포의 시험관 내 생성

여기서, 우리는 미리 분화된 인간 유도만능 줄기 세포 유래 심근세포, 심장 섬유아세포 및 내피 세포로 구성된 3D 자가 조립 심장 미세 조직 배열을 생성하는 사용하기 쉬운 방법론을 기술합니다. 심장 미세 조직을 생성하는 기술을 요구하는 이 사용자 친화적이고 낮은 세포는 질병 모델링 및 약물 개발의 초기 단계를 위해 구현될 수 있습니다.

인간 iPSC 유래 심근세포, 심장 섬유아세포 및 내피 세포를 사용하여 3D 심장 미세 조직 배열의 제조

여기서, 우리는 환자 말초 혈액 단핵 세포에서 인간 심근세포를 강력하게 생성하고 확장하는 프로토콜을 제시합니다.

환자 말초 혈액 단핵 세포에서 인간 심근세포의 생성 및 확장

학습하세요 인간 심장 조직에서 CD146+CD34- 페리사이트와 CD34+CD146- 어드벤티셜 세포를 분리하는 방법을. 이 기술은 심장 재생 연구와 허혈성 심질환 치료에 활용됩니다.

인간의 심장 조직에서 혈관 주위 능성 전구체 세포 집단의 분리

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