인간의 심장 조직에서 혈관 주위 능성 전구체 세포 집단의 분리

본 절차의 전체적인 목표는 인간 심장 조직에서 두 개의 별개 다능성 혈관주위 전구세포 집단을 분리하는 것입니다. 이 방법은 혈관주위 세포 집단의 하위 집합이 심장 재생 과정에 어떻게 기여하는지와 같은 심장 재생 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 선택된 주요 세포 부착 제거 기술을 통해 이질성이 감소하고 생존력이 향상된 전구세포 집단을 얻을 수 있다는 점입니다.

혈관주위 줄기세포 아형이 심근 형성 잠재력을 가지고 있음이 밝혀졌기 때문에, 이 기술은 허혈성 심장 질환의 치료에 응용될 수 있습니다. 이 방법은 심장 재생에서 혈관주위 세포의 역할에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 심근 섬유화와 같은 심장 질환의 다른 측면을 조사하는 데에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 조직의 신선도로 인해 생존 세포를 사용해야 하므로 어려움을 겪을 수 있습니다.

이 실험 절차를 시작하려면, 심낭, 주요 혈관 및 심방을 제거한 후 샘플을 페트리 접시의 세척액에 넣습니다. 다음으로, 심실 근육을 약 1㎟ 크기의 작은 조각으로 자르고, 세포 회수율을 극대화하기 위해 즉시 처리합니다. 그런 다음, 신선한 소화액을 제조하고 항온수조에서 37 °C로 가온합니다.

그 후, 부유된 조직 조각들을 100 micron 체로 걸러내고 PBS로 2회 세척합니다. 조직 조각들을 밀폐 뚜껑이 있는 멸균된 30 milliliter 용기로 옮깁니다. 소화 용액을 첨가하고, 밀폐된 플라스틱 백에 넣은 용기를 120 RPM으로 설정된 37 degrees Celsius 진탕 항온수조에 넣습니다.

15분 후, 용기를 세 번 뒤집어 섞어줍니다. 그런 다음, 다시 워터 배스에 넣고 15분 동안 더 반응시킵니다. 이후 용기를 꺼내어 20% FBS가 첨가된 5 mL의 DMEM으로 콜라게나제(collagenases)를 중화시킵니다.

그 후, 10 mL 세롤로지컬 피펫으로 10~20회 정도 부드럽게 파이펫팅하여 소화된 조직을 마쇄함으로써 조직 덩어리를 제거합니다. 다음으로, 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 현탁액을 100 µm, 70 µm, 그리고 마지막으로 40 µm 세포 스트레이너에 순차적으로 여과합니다. 이어서 세포 현탁액을 200 x g에서 4분 동안 원심분리합니다.

상층액을 조심스럽게 따라내고, 펠릿을 1 mL의 적혈구 용혈 완충액에 현탁하여 실온에서 2분 동안 둔 다음, 4 mL의 세척 배지로 희석합니다. 원심분리 단계를 반복하고 펠릿을 1 mL의 세척 배지에 현탁합니다. 세포 현탁액 10 µL를 세척 배지 90 µL로 희석하여 세포 현탁액을 1:10으로 희석합니다.

희석된 세포 현탁액 10 µL를 트립판 블루 염색약 10 µL와 혼합하고, 세포 수를 측정하기 위해 혼합물 10 µL를 표준 혈구계산판에 점적합니다. 이 과정에서는 비특이적 항체 결합을 차단하기 위해 세포 현탁액에 마우스 혈청 50 µL를 첨가하고 4 °C에서 20분 동안 배양합니다. 그다음, 세포 현탁액을 200 x g에서 4분 동안 원심분리합니다.

상층액을 제거하고 세척액에 다시 현탁합니다. 다음으로, 세포 현탁액 50 µL를 동형 대조군(isotype control) 및 무염색 대조군(unstained control)을 위한 두 개의 폴리스티렌 라운드 바텀 유세포 분석 튜브에 각각 분주하고, 나머지 부피는 다색 염색을 위해 세 번째 튜브에 넣습니다. 다색 염색을 위해 단일 세포 현탁액에 5가지 항체를 첨가합니다.

항체를 세포와 혼합하기 위해 조심스럽게 피펫팅하고, 모든 튜브를 4°C의 암소에서 20분 동안 배양합니다. 5개의 유세포 분석 튜브에 각각 100 µL의 세척액을 넣고 양성 비드를 한 방울씩 추가하여 보정 대조군 비드를 준비합니다. 5개의 튜브에 각각 항체를 개별적으로 첨가합니다.

그런 다음 모든 튜브를 4 °C의 암소에서 20분 동안 배양합니다. 그동안 EGM-2 배양액 500 µL가 담긴 세포 수집 튜브를 각각 준비하여 4 °C에 둡니다. 항체 배양 후, 결합하지 않은 항체를 제거하기 위해 5 mL의 세척액을 넣어 세포와 비드를 세척합니다.

모든 튜브를 200 x g에서 4분 동안 원심분리합니다. 세척 및 원심분리 단계를 반복하고 상층액을 조심스럽게 따라냅니다. 그런 다음, 세척액에 세포를 1 x 10⁶ cells/250 µL 농도로 재현탁합니다.

그 후, 100 µL의 세척 용액에 비드를 재현탁합니다. 세포 및 비드 현탁액을 얼음 위 암소 상태로 세포 분석기(cell sorter)로 옮깁니다. 양성 비드 보정 대조군 튜브에 음성 비드 한 방울을 추가하고, 이를 사용하여 형광 보정(fluorescence compensation)을 설정합니다.

그 다음, 염색되지 않은 대조군 세포를 분석하여 배경 형광을 설정하고 전압을 조절합니다. 이어서, 비특이적 결합과 관련된 배경 형광 임계값을 설정하기 위해 아이소타입 대조군(control isotypes)을 분석합니다. 다색 염색된 시료를 분석하여 페리사이트(pericyte)와 외막세포(adventitial cell) 집단을 수집 튜브에 수집합니다.

본 절차에서는 성장 면적 1cm²당 100 µL의 멸균 0.2% 젤라틴 용액을 첨가하고, 웰 전체에 코팅되도록 수동으로 흔들어 줍니다. 그 후, 플레이트를 4 °C에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음, 젤라틴 용액을 완전히 제거합니다.

배양 플레이트를 준비하는 동안 수집한 세포를 얼음 위에 둡니다. 다음으로, 갓 수집한 세포를 200 x g에서 4분 동안 원심 분리하고, 세포 펠렛을 적절한 양의 EGM-2에 부드럽게 재현탁합니다. 그 후, 젤라틴이 코팅된 플레이트에 세포를 접종합니다.

이 그림에서, 생존 세포를 게이팅하여 먼저 CD45 양성 세포를 제외한 후 CD56 양성 세포를 제외하였습니다. 그다음 CD56 음성 분획에서 CD144 양성 혈관내피세포를 제거하였습니다. 이 최종 세포군으로부터 CD146 양성 및 CD34 음성인 혈관주위세포와 CD146 음성 및 CD34 양성인 외막세포를 선택하여 수집하였습니다.

FACS로 정제된 심근 периcyte(pericytes)와 외막 세포(adventitial cells) 배양액 모두 방추형에서 성상세포 모양의 세포 형태를 나타냅니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 약 5시간이 소요됩니다. 이 절차를 시도할 때, 가장 신선한 시료를 사용해야 생존 세포의 수율이 가장 높다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차를 마친 후, 허혈성 심장 질환 치료에 있어 이러한 세포들의 적합성과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 세포 심근성형술과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.