인간의 심장 조직에서 혈관 주위 능성 전구체 세포 집단의 분리

이 절차의 전반적인 목표는 인간 심장 조직에서 다능성 혈관 주위 전구 세포의 두 개의 개별 집단을 분리하는 것입니다. 이 방법은 혈관 주위 세포 집단의 하위 집합이 이 과정에 기여하는 것과 같은 심장 재생 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이질성이 감소하고 주요 접착 기술의 생존력이 향상된 전구 세포 집단을 생성한다는 것입니다.

이 기술은 혈관 주위 줄기 세포 아형이 심근성 잠재력을 가지고 있는 것으로 나타났기 때문에 허혈성 심장 질환 치료에 영향을 미칩니다. 이 방법은 심장 재생에서 혈관 주위 세포의 역할에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 심근 섬유증과 같은 심장 질환의 다른 측면에 대한 조사에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 조직의 신선도로 인해 생존 가능한 세포 사용으로 인해 어려움을 겪을 것입니다.

이 절차를 시작하려면 심낭, 주요 혈관 및 심방을 제거한 후 샘플을 페트리 접시의 세척 매체에 넣습니다. 다음으로, 심실 심근을 약 1입방밀리미터의 작은 조각으로 자르고 즉시 처리하여 가장 높은 세포 수율을 얻습니다. 그런 다음 신선한 소화액을 만들고 수조에서 섭씨 37도까지 데웁니다.

그런 다음 100미크론 스트레이너를 통해 부유 조직 조각을 걸러내고 PBS로 두 번 씻습니다. 티슈 조각을 단단히 밀봉된 뚜껑이 있는 멸균 30ml 용기로 옮깁니다. 소화 용액을 넣고 밀봉된 비닐 봉지에 용기를 넣고 섭씨 37도의 흔들림 수조에서 120RPM으로 설정합니다.

15분 후 용기를 세 번 뒤집습니다. 그런 다음 다시 수조에 15분 더 넣으십시오. 그 후, 20% FBS가 보충된 5ml의 DMEM으로 콜라겐 분해 효소를 제거하고 담금질합니다.

그런 다음 10ml 혈청학적 피펫으로 10-20회 부드럽게 피펫팅하여 조직 덩어리를 분해하여 소화된 조직을 분쇄합니다. 다음으로, 100 미크론, 70 미크론 및 마지막으로 40 미크론 셀 스트레이너를 통해 현탁액을 순차적으로 필터링하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 그런 다음 200 x g에서 4분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다.

상등액을 조심스럽게 디캔팅하고 펠릿을 1 밀리리터의 적혈구 용해 완충액에 실온에서 2 분 동안 재현탁시킨 후 4 밀리리터의 세척 매체로 희석합니다. 원심분리 단계를 반복하고 펠릿을 1ml의 세척 매체에 재현탁시킵니다. 10마이크로리터의 세포 현탁액을 90마이크로리터의 세척 매체로 희석하여 세포 현탁액을 1-10 희석합니다.

10마이크로리터의 희석된 세포 현탁액과 10마이크로리터의 트리판 블루 염색제를 혼합하고 10마이크로리터의 혼합물을 세포 계수를 위해 표준 혈구계에 올려놓습니다. 이 절차에서는 세포 현탁액에 50마이크로리터의 마우스 혈청을 추가하고 섭씨 4도에서 20분 동안 배양하여 비특이적 항체 결합을 차단합니다. 다음으로, 200 x g에서 4분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다.

상층액을 제거하고 세척 매체에 다시 현탁시킵니다. 다음으로, isotype 및 unstained control을 위해 두 개의 polystyrene round bottom flow cytometry tube 각각에 세포 현탁액 50μl를 분취하고 multicolor staining을 위해 나머지 부피를 세 번째 튜브에 넣습니다. multicolor staining을 위해 single cell suspension에 5개의 항체를 추가합니다.

항체와 세포를 혼합하기 위해 부드럽게 피펫팅하고 모든 튜브를 섭씨 4도에서 어둠 속에서 20분 동안 배양합니다. 5개의 유세포 분석 튜브에 있는 100마이크로리터의 세척 배지에 포지티브 비드 1방울을 추가하여 보상 제어 비드를 준비합니다. 5개의 튜브 각각에 항체를 개별적으로 추가합니다.

그런 다음 모든 튜브를 섭씨 4도에서 어둠 속에서 20분 동안 배양합니다. 그 동안 각각 500마이크로리터의 EGM-2 배양 배지가 들어 있는 세포 수집 튜브를 준비하고 섭씨 4도에 놓습니다. 항체 배양 후 5ml의 세척 배지를 첨가하여 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 세포와 비드를 세척합니다.

모든 튜브를 200 x g에서 4분 동안 원심분리기합니다. 세척 및 원심분리 단계를 반복하고 상층액을 조심스럽게 디캔팅합니다. 그런 다음, 250 마이크로 리터 당 6 번째 세포에서 10 배의 농도로 세척 배지에 세포를 재현 탁시킵니다.

그 후, 100 마이크로 리터의 세척 매체에 구슬을 다시 현탁시킵니다. cell 및 bead 현탁액을 어두운 곳에서 얼음 위의 cell sorter로 옮깁니다. positive bead compensation control tube에 negative bead 한 방울을 추가하고 이를 사용하여 형광 보정을 설정합니다.

그런 다음 염색되지 않은 대조 세포를 실행하여 배경 형광을 설정하고 전압을 설정합니다. 그런 다음, 대조군 isotypes를 실행하여 비특이적 결합과 관련된 배경 형광 임계값을 설정합니다. 다색으로 염색된 샘플을 실행하고 pericyte 및 adventitial cell population을 수집 튜브에 수집합니다.

이 절차에서는 성장 면적의 평방 센티미터당 100마이크로리터의 멸균 0.2% 젤라틴 용액을 추가하고 수동으로 교반하여 웰 전체를 코팅합니다. 그 후, 4°C에서 10분 동안 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 젤라틴 용액을 완전히 제거하십시오.

배양 플레이트를 준비하는 동안 수집된 세포를 얼음 위에 보관하십시오. 다음으로, 갓 채취한 세포를 200 x g에서 4분 동안 원심분리하고 세포 펠릿을 적절한 양의 EGM-2로 부드럽게 재현탁합니다. 그런 다음 젤라틴으로 코팅된 플레이트에 세포를 뿌립니다.

이 그림에서 살아있는 세포는 CD45 양성 세포를 먼저 배제한 다음 CD56 양성 세포를 배제하도록 게이트되었습니다. 그런 다음 CD144 양성 내피 세포를 CD56 음성 분획에서 제거했습니다. 이 최종 집단에서 CD146 양성, CD34 음성 주피세포 및 CD146 음성, CD34 양성 외래 세포를 선택한 후 수집했습니다.

FACS가 정제된 심근주피세포와 외래세포의 두 배양은 모두 방추체에서 성상 세포 형태를 나타냅니다. 이 기술을 완전히 익히면 제대로 수행할 경우 약 5시간이 걸립니다. 이 절차를 시도하는 동안 가장 신선한 샘플이 생존 가능한 세포의 최상의 수율을 제공한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 허혈성 심장 질환 치료에서 이러한 세포의 적합성과 같은 추가 질문에 답하기 위해 세포 심근 성형술과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.