친 유성 독소루비신 전구 약물 미셀의 제조 및 특성화

이 프로토콜의 전반적인 목표는 친유성 독소루비신 전구약물 적재 미셀 제형을 준비하고 특성화하는 절차를 설명하는 것입니다. 이 방법은 micell 제형을 위한 간단하고 신뢰할 수 있는 접근 방식을 제공합니다. 독소루비신의 친유성 전구약물의 합성은 약물 로딩 및 안정성을 향상시킬 수 있으므로 미셀 제형 개발의 중요한 문제를 해결할 수 있습니다.

미셀 제형은 종양에 대한 약물 표적화를 향상시킬 수 있으므로 암 치료의 독성을 줄일 수 있습니다. 이 프로젝트에 설명된 응용 프로그램 외에도 이 기술은 제제를 위한 나노 의학을 준비하는 데에도 사용할 수 있습니다. 친유성 독소루비신 전구약물 DOX-PA를 합성하려면 독소루비신 390mg과 팔미트산 하이드로자이드 243mg의 무게를 측정하고 둥근 바닥 플라스크에 옮깁니다.

유리 주사기로 플라스크에 무수 메탄올 150ml를 추가합니다. 그런 다음 피펫으로 39마이크로리터의 트리플루오로아세트산(TFA)을 추가합니다. 자석 교반기를 사용하여 반응 혼합물을 실온에서 어두운 곳에서 18시간 동안 교반합니다.

실리카겔 컬럼을 사용하여 DOX-PA를 정제하려면 먼저 회전 증발기로 반응 혼합물에서 용매를 제거합니다. 혼합물의 부피가 약 20밀리리터로 감소한 후 3g의 실리카겔을 첨가하십시오. 건조 분말을 생성하고 제품이 실리카겔에 흡수될 수 있도록 회전 증발을 계속합니다.

건조 분말이 형성된 후 추가로 30분 동안 샘플을 진공 상태로 보관하십시오. 디클로로메탄을 용매로 사용하여 50g의 실리카겔을 컬럼에 포장합니다. 흡수된 생성물이 포함된 실리카겔 샘플을 컬럼에 조심스럽게 첨가합니다.

디클로로메탄과 메탄올의 혼합물로 컬럼을 용리시키면서 메탄올의 비율을 점차적으로 증가시켜 용매 극성을 증가시킵니다. 튜브당 25ml의 속도로 시험관에서 엘루엔트 분획을 수집하고 박층 크로마토그래피(TLC)로 진행 상황을 모니터링합니다. 순수한 DOX-PA를 함유한 모든 분획을 결합하고 건조 분말이 형성될 때까지 회전 증발기를 사용하여 용매를 제거합니다.

밤새 진공 상태에서 제품을 추가로 건조시키십시오. 미셀을 준비하려면 10ml 유리 바이알에 DSPE-PEG 40mg과 DOX-PA 4mg을 메탄올 2ml와 함께 용해합니다. 바이알에 박막이 형성될 때까지 회전 증발기를 사용하여 진공 상태에서 유기 용매를 제거합니다.

다음으로, pH 7.4의 Dulbecco의 인산염 완충 식염수 2ml를 유리 바이알에 옮깁니다. 얇은 고분자 약물 필름을 분산시키기에 충분한 초음파 출력을 생성할 수 있는 초음파 수조를 선택하십시오. 이 프로토콜에 사용되는 초음파 수조의 출력 전력은 110와트입니다.

바이알을 초음파 수조에 3분 동안 놓고 온화한 실내에서 미셀을 생성합니다. 단기 보관을 위해 미셀을 섭씨 4도로 유지하고 장기 보관을 위해 섭씨 영하 20도로 유지하십시오. 미셀이 준비되면 다양한 특성화를 수행하여 미셀의 약물 농도, 입자 크기 및 체외 항암 활성을 측정합니다.

DOX-PA 농도 및 약물 캡슐화 효율을 측정하기 위해 25마이크로리터의 약물 적재 미셀을 500마이크로리터의 DMSO로 희석합니다. UV-VIS 분광계로 490나노미터에서 흡수를 측정하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 약물 농도 및 캡슐화 효율을 계산합니다. 체외 항암 활성을 평가하려면 희석된 세포 현탁액을 웰당 100마이크로리터의 96웰 세포 배양 플레이트에 추가합니다.

세포 배양 인큐베이터에서 18시간 동안 세포를 배양하여 세포가 부착될 수 있도록 합니다. 다음으로, DOX DMSO 용액과 DOX-PA DMSO 용액을 세포 배양 배지로 희석하여 최종 약물 농도를 얻습니다. 모든 샘플의 최종 DMSO 농도를 0.5%로 유지한 다음 DOX-PA 미셀을 세포 배양 배지로 희석하여 최종 약물 농도를 얻습니다.

블랭크 세포 배양 배지를 대조군으로 사용합니다. 인큐베이터에서 96웰 세포 배양 플레이트를 제거하고 세포 배양 배지를 다른 처리제를 함유한 100마이크로리터의 배지로 교체합니다. 세포 배양 인큐베이터에서 세포를 추가로 72시간 동안 배양합니다.

다음으로, 배지를 흡인하고 MTT 밀리리터당 0.5밀리그램을 포함하는 100마이크로리터의 배지를 추가합니다. 세포 배양 인큐베이터에서 세포를 추가로 2시간 동안 배양합니다. 매체를 조심스럽게 제거하고 100 마이크로 리터의 DMSO를 첨가하여 포르마 잔 결정을 용해시킵니다.

마이크로플레이트 분광광도계를 사용하여 570나노미터의 파장과 670나노미터의 기준 파장에서 흡광도를 측정합니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포 생존율을 계산합니다. DOX-PA의 합성 방식은 다음과 같습니다.

팔미트산은 pH에 민감한 히드로진 링커를 통해 독소루비신과 결합됩니다. DOX-PA의 구조는 양성자 NMR 스펙트럼으로 추가로 확인되었습니다. 독소루비신(doxorubicin)과 팔미트산(palmitic acid)의 특징적인 NMR 피크가 관찰됩니다.

문자는 피크와 구조 내에서 해당 부분을 나타냅니다. 약물이 없는 빈 DSPE-PEG 미셀은 투명한 액체로 나타나는 반면, DOX-PA DSPE-PEG 미셀은 붉은 액체로 나타나는데, 이는 미셀에 DOX-PA가 로드되어 있기 때문입니다. 블랭크 DSPE-PEG 미셀의 평균 입자 크기는 약 17.0나노미터입니다.

DOX-PA의 로딩은 미셀 입자 크기를 약간 증가시켰으며, DOX-PA DSPE-PEG 미셀의 평균 입자 크기는 약 25.7나노미터였습니다. DU145 세포를 유리 독소루비신, 유리 DOX-PA 또는 DOX-PA 미셀로 처리함으로써 세포 생존율의 농도 의존적 감소를 달성했습니다. 유리 독소루비신이 낮은 농도에서 유리 DOX-PA 또는 DOX-PA 미셀보다 더 효과적이지만, DOX-PA 그룹은 높은 농도에서 유리 독소루비신보다 세포 생존율이 더 크게 감소하는 것으로 나타났습니다.

또한 DOX-PA와 DOX-PA 미셀 사이에는 높은 농도와 낮은 농도 모두에서 큰 차이가 없는 것으로 보입니다. 이 비디오를 시청한 후에는 필름 분산 방법으로 미셀 제형을 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 설명된 방법은 다양한 약물 및 운반체 물질로 미셀을 제조하는 데 사용할 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다.

캐리어 재료의 설계는 제형 성능을 향상시키는 데 중요합니다. 이러한 절차에 따라, 미셀 제형은 항암 활성을 시험하기 위해 동물 종양 모델과 함께 생체 내에서 추가로 평가할 수 있습니다.