표적 약물 전달을 위해 독소루비신으로 로드된 압타머-PEI-g-PEG 수정 금 나노 입자의 합성

약물 내성 및 독성으로 인해 독소루비신의 사용은 클리닉에서 제한됩니다. 이 프로토콜은 이 치료제의 방출을 유지하기 위한 분해성 운반체를 제공합니다. 이 방법의 장점은 합성된 담체를 사용하여 약물을 암세포에 직접 전달하여 암세포에서만 세포 사멸을 유도할 수 있다는 것입니다.

CT-PEG 합성을 위해 먼저 100ml의 둥근 바닥 플라스크에 숙신산 무수물 1.46g과 4-디메틸아미노피리딘 209mg을 추가합니다. 다음으로, 플라스크에 15ml의 무수 테트라하이드로푸란을 넣고 유리 마개를 플라스크에 끼운 후 섭씨 0도에서 30분 동안 반응을 배양합니다. 배양하는 동안 PEG 4.208g, 트리에틸아민 1.8ml, 무수 테트라하이드로푸란 15ml를 새 플라스크에 넣고 유리 마개로 플라스크를 닫습니다.

배양이 끝나면 질소 분위기에서 주사기를 사용하여 두 번째 용액을 첫 번째 플라스크로 천천히 옮깁니다. 새 용액을 섭씨 0도에서 2시간 동안 저어준 후 밤새 실온에서 반응을 계속합니다. 다음날 아침, 섭씨 40도 및 0.1메가파스칼에서 회전 증발기를 사용하여 반응 용액을 농축하고 테트라하이드로푸란 용매를 제거합니다.

한 시간 후, 반응 용액을 실온에서 디클로로 메탄 1 밀리리터 당 1.325 그램 15 밀리리터에 용해시킨 후, 15 밀리리터의 차가운 디 에틸 에테르를 첨가하여 PEG 이산 침전 생성물을 얻는다. 그런 다음 여과지를 통해 용매를 제거하고 실온에서 48시간 동안 진공 상태에서 침전물을 건조시킵니다. PEI-g-PEG 공중합체 합성을 위해 새 플라스크에 CT-PEG 침전물 305.47mg과 DMSO 5ml를 추가하고 CT-PEG가 완전히 용해될 때까지 실온에서 반응을 교반합니다.

다음으로, 49.46mg의 EDC를 5ml의 DMSO에 용해시키고 용액을 플라스크에 첨가합니다. 실온에서 30분 동안 반응을 교반한 후 N-하이드록시숙신이미드 29.69mg과 DMSO 5밀리리터를 용해시키고 생성된 용액을 플라스크에 첨가합니다. 실온에서 3시간 동안 반응을 계속 저어줍니다.

배양이 끝날 무렵 28.6 마이크로 리터의 PEI를 10 밀리리터의 DMSO에 용해시키고 용액을 플라스크에 적어 넣으십시오. 적어도 3일 동안 실온에서 반응을 교반합니다. 배양이 끝나면 반응된 용액을 분자량 1000 컷오프가 있는 투석 백으로 옮기고 투석액으로 500ml의 초순수가 들어 있는 1리터 비이커에 백을 넣습니다.

투석의 끝에, 10, 000의 분자량 커트오프를 가진 투석 부대로 해결책을 옮기고 투석액으로 매우 순수한 물의 500 밀리리터를 가진 1개의 리터 비커로 부대를 두었다. 두 번째 투석이 끝나면 섭씨 40도 및 0.1메가파스칼에서 회전 증발기를 사용하여 용액을 농축하고 샘플을 동결 건조하여 PEI-g-PEG 분말을 얻습니다. PEI-g-PEG 제품으로 금 나노 입자를 코팅하려면 준비된 PEI-g-PEG 5mg을 새 플라스크에 5ml의 초순수에 녹이고 플라스크에 유리 마개를 끼웁니다.

플라스크에 0.3 밀리몰 오라 염화물 용액 100 밀리리터를 넣고 실온에서 3 시간 동안 용액을 저어줍니다. 색상은 밝은 노란색에서 짙은 노란색으로 즉시 변경되어야 합니다. 배양이 끝나면 플라스크에 수소화붕소나트륨 용액 1밀리리터당 1밀리리터를 추가합니다.

색상은 즉시 짙은 노란색에서 황금색으로 변해야 하며 실온에서 3시간 더 용액을 저어줍니다. 그런 다음 PEI-g-PEG 코팅된 금 나노 입자 용액을 얻기 위해 입증된 바와 같이 1000 분자량 차단 투석 백으로 반응 생성물을 3일 동안 투석합니다. PEI-g-PEG 코팅 금 나노 입자에 독소루비신을 접목합니다.

새 플라스크에 2.2밀리리터의 독소루비신 용액 1ml와 PEI-g-PEG 코팅된 금 나노입자 용액 20ml를 넣고 플라스크에 유리 마개를 끼웁니다. 다음으로, 초순수 1ml에 EDC 0.727mg을 용해시키고 EDC 용액을 플라스크에 첨가합니다. 초순수 1ml에 N-Hydroxysoxynimide 0.437mg을 녹이고 N-Hydroxysuccinimide 용액을 플라스크에 첨가하여 실온에서 교반하면서 1시간 동안 배양합니다.

배양 종료 시 1000 분자량 차단 투석 백에 반응 생성물을 3일 동안 투석하여 독소루비신 g-PEI-g-PEG 코팅된 금 나노입자 용액을 얻습니다. AS1411 압타머를 DOX-g-PEI-g-PEG에 접목합니다. 독소루비신 DOX-g-PEI-g-PEG 코팅된 금 나노입자 용액 20ml를 AS1411의 약 4 광학 밀도 농도에 첨가합니다.

초순수 1ml에 EDC 28.76mg을 녹이고 EDC 용액을 플라스크에 넣습니다. 초순수 1ml에 N-Hydroxysuccinimide 17.27mg을 녹이고 N-Hydroxysuccinimide 용액을 플라스크에 첨가하여 실온에서 교반하면서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 AS1411-g-Doxorubicin-g-PEI-g-PEG 코팅된 금 나노 입자를 얻기 위해 입증된 바와 같이 1000 분자량 차단 투석 백에 반응 생성물을 3일 동안 투석합니다.

양성자 NMR 분광법은 CT-PEG 폴리머와 PIE-g-PEG 공중 합체의 성공적인 합성을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 자외선 분광법을 수행하여 금 나노 입자에 대한 준비된 공중 합체의 성공적인 기능화와 점진적인 로딩을 결정할 수 있습니다. X선 광전자 분광법은 금 나노 입자에 대한 공중 합체의 화학 결합을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

동적 광 산란을 수행하여 준비된 나노 입자의 크기 분포를 결정할 수 있습니다. 이 분석에서 투과 전자 현미경은 균일한 형태를 가진 비클러스터 나노 입자를 밝혀냈습니다. 세포 생존율 분석은 시간이 지남에 따라 그리고 나노 입자의 농도 증가에 대한 반응으로 A549 세포 수가 감소하는 것을 밝혔습니다.

그러나 유리 독소루비신 그룹과 비교하면 세포 수가 증가하여 독성이 감소했음을 나타냅니다. 또한, 독소루비신 방출 프로파일을 분석한 결과, 기능화된 나노입자에서 독소루비신이 지속적으로 방출되면 A549 세포가 감소하는 것으로 나타났습니다. PEI-g-PEG 공중합체 준비 및 AS1411 이식 단계는 절차의 성공적인 구현에 중요합니다.

약물을 이식하기 전에 AS1411을 이식하여 동일한 약물 전달체를 얻을 수 있지만 약물 로딩 효율이 감소합니다.