세포 - 세포 연락이없는 두 세포 유형의 삽입 공동 배양 시스템 개발

이 절차의 전반적인 목표는 투과성 멤브레인이 있는 삽입물을 사용하여 두 가지 세포 유형의 세포 공동 배양 시스템을 만들어 분비된 용해성 인자의 확산을 허용하는 것입니다. 이는 두 번째 세포 유형을 포함하는 다중 웰 조직 배양 플레이트에 한 가지 세포 유형을 포함하는 삽입물을 미세하게 배치하는 일련의 단계를 통해 수행됩니다. 우리는 인서트에서 1번 파종 세포 유형을 시작하고 다중 웰 조직 배양 플레이트에서 2번 파종 세포 유형을 시작합니다.

두 번째 단계는 삽입물을 세포 유형 번호 2를 포함하는 플레이트의 웰로 옮기는 것입니다. 궁극적으로 이것은 두 가지 세포 유형과 각각의 상층액을 수확할 수 있는 능력을 제공합니다. 따라서, 관심 세포 유형에 대한 분비 용해성 인자의 효과를 평가할 수 있습니다.

다세포 유기체에서 분비된 용해성 인자는 부분비 신호의 결과로 다양한 세포 유형으로부터 반응을 이끌어냅니다. 이와 같이, 인서트 공동 배양 시스템의 가치는 세포-세포 접촉이 없을 때 분비된 용해성 인자에 의해 매개되는 세포 매개변수의 변화를 평가하는 독창적인 방법을 제공하는 능력에 있습니다. 인서트 공동 배양 시스템은 다음과 같은 다른 공동 배양 기술에 비해 다양한 이점을 제공합니다. 2개의 보존된 세포 극성; 및 세포 변화에 대한 3개의 집단별 감지.

lipopolysaccharide activated N9 microglia가 neuronal PC12 세포에 미치는 사이토카인의 독성 효과를 측정하기 위한 구체적인 프로토콜은 다음에 자세히 설명될 것이며, 이를 통해 insert co-culture 방법론에 대한 구체적인 이해를 제공할 것입니다. 먼저 포장에서 24웰 조직 배양 플레이트와 0.4미크론 포르 폴리테트라플루오로에틸렌 인서트의 포장을 풉니다. 그런 다음 멸균 핀셋을 사용하여 삽입물의 가장 위쪽 가장자리를 잡고 조직 배양 플레이트의 빈 웰에 삽입물을 놓습니다.

다음으로, 멤브레인이 완전히 덮일 때까지 인서트를 루틴 N9 배지로 채웁니다. 삽입물을 최소 1시간 또는 하룻밤 동안 배양하여 세포의 부착 능력을 향상시킵니다. 삽입물이 준비되면 루틴 N9 배지를 사용하여 N9 미세아교세포를 80-90% 합류로 분할하여 삽입물을 파종하는 데 사용할 세포 현탁액을 얻습니다.

그런 다음 마이크로피펫 팁으로 멤브레인에 구멍을 뚫지 않도록 주의하면서 인서트에서 일상적인 매체를 제거합니다. 다음으로, 60, 세포 현탁액의 50 마이크로리터를 가진 평방 센티미터 당 000의 세포에, 또는 삽입 제조자의 의정서에 따라 각 삽입을 씨를 뿌린다. 세포 현탁액을 분배하는 동안 때때로 튜브를 반전시켜 균질하게 유지되도록 합니다.

모든 인서트가 파종되면 세포를 고르게 분배하기 위해 플레이트를 앞뒤로 부드럽게 흔든 다음 왼쪽에서 오른쪽으로 흔듭니다. 원을 그리는 동작은 세포가 인서트 중앙에 쌓이게 되므로 피하십시오. 그 후, N9 미세아교세포 활성화를 추구하기 전에 삽입물을 포함하는 플레이트를 24시간 동안 배양합니다.

먼저 10mg의 리포다당류의 무게를 측정하고 나중에 사용할 수 있도록 1.5ml Eppendorf Tube에 보관합니다. 지질다당류는 강력한 전염증성 내독소이며 특별한 안전 예방 조치가 필요하기 때문에 안경, 장갑 및 미립자 호흡기를 사용하는 것이 좋습니다. 그런 다음 따뜻한 N9 처리 매체를 사용하여 리포다당류의 연속 희석액 세트를 만들어 밀리리터당 4, 2 및 1마이크로그램의 작업 용액을 얻습니다.

마지막으로, 세포를 방해하지 않도록 주의하면서 삽입물에서 배양 배지의 절반을 제거합니다. 그런 다음 25마이크로리터의 지질다당류 작업 용액을 인서트에 부드럽게 첨가하여 밀리리터당 2, 1 또는 0.5마이크로그램의 최종 희석액을 생성합니다. 공동 배양 실험을 진행하기 전에 플레이트를 24시간 더 배양합니다.

이 단계에서는 평방 센티미터당 30, 000개의 세포로 도금된 PC12 세포가 분화된 중간뉴런과 이전 섹션에서 설명한 대로 24시간 동안 지질다당류로 활성화된 N9 마이크로아교세포가 필요합니다. 인서트에서 모든 매체를 부드럽게 제거하고 50마이크로리터의 신선하고 따뜻한 N9 처리 매체로 교체하는 것으로 시작합니다. 이것은 리포다당류의 모든 흔적을 제거하고 활성화된 N9 미세아교세포만 남기는 데 필요합니다.

조직 배양 플레이트의 웰에 삽입물이 느슨하여 팁이 벽에 너무 세게 눌리면 이리저리 움직일 수 있습니다. 이 단계는 공기와의 장기간 접촉으로 인해 세포가 건조해지는 것을 방지하기 위해 한 번에 하나씩 삽입하여 실행해야 합니다. 그 후 신경 세포 PC12 세포 배지를 완전히 제거하고 0.6ml의 신선하고 따뜻한 PC12 처리 배지로 교체합니다.

세포가 마르지 않도록 한 번에 한 번씩 잘 하십시오. 핀셋을 사용하여 삽입물의 가장 위쪽 가장자리를 잡고 신경 세포 PC12 세포가 들어 있는 웰에 부드럽게 넣습니다. 모든 인서트가 이송되면 인서트의 멤브레인 아래에 기포가 있는지 확인하십시오.

기포는 인서트의 멤브레인을 가로지르는 교환을 방지하고 전체 실험을 위태롭게 할 수 있습니다. 핀셋을 사용하여 웰에서 인서트를 매우 부드럽게 들어 올려 세포 배양 배지에 다시 넣어 기포를 제거하면 대부분의 기포가 제거됩니다. 그러나 기포가 지속되는 경우 삽입물을 비스듬히 세포 배양 배지에 부드럽게 다시 담그십시오.

삽입물을 두드리거나 휘젓지 마십시오., 부착 세포의 해리를 일으키는 경향이 있으므로 삽입물을 두드리거나 휘젓지 마십시오. 그 후, 인서트와 웰 모두에서 매체의 부피를 확인하고 두 구획의 액체는 대략 같은 수준이어야합니다. 모든 기포가 제거되고 매체 부피가 적절해지면 플레이트를 배양합니다.

그런 다음 세포, 배양 배지 또는 둘 다를 수확하여 N9 미세아교세포와 뉴런 PC12 세포 사이의 부분비 신호 전달의 효과를 측정할 수 있습니다. 효소 결합 면역흡착 분석은 전염증성 사이토카인을 정량화하기 위해 하부 격실의 세포 배양 배지에서 수행되었습니다. 그 결과, 활성화 기간 24시간 후, 리포다당류 1밀리리터당 2마이크로그램으로 처리된 N9 미세아교세포는 치료되지 않은 미세아교세포에 비해 인터루켄-6, 종양괴사인자-알파, 인터페론 감마와 같은 전염증성 사이토카인을 유의하게 더 많이 분비했음을 보여줍니다.

또한, 리포다당류 1밀리리터당 1마이크로그램을 투여한 N9 미세아교세포는 24시간 후 더 많은 인터페론 감마를 분비한 반면, 인터루켄-6 및 종양괴사인자-알파의 세포 매체 수치가 현저히 증가하는 데 48시간이 걸렸습니다. 대조적으로, 밀리리터당 0.5마이크로그램 조건은 활성화 기간 후 24시간 및 48시간 모두에 N9 마이크로아교세포에서 사이토카인 발현을 향상시키지 못했습니다. 더욱이, 밀리리터당 2마이크로그램 그룹의 24시간 데이터는 미세아교세포 개체군의 증가인 미세아교세포증이 있었음을 시사합니다.

그러나 48시간이 지나서야 세포 수가 크게 증가했습니다. 마지막으로, 향상된 사이토카인 분비 및 미세아교세포로 이어지는 미세아교세포 활성화의 결과를 평가하기 위해 공동 배양된 뉴런 PC12 세포에서 세포 독성을 평가했습니다. 손상된 세포에서 방출되는 세포외 젖산 탈수소효소(Extracellular Lactate Dehydrogenase)의 수치를 측정한 결과, N9 세포의 지질다당류 농도가 증가함에 따라 신경 세포 PC12 세포가 더 많은 세포 사멸을 나타내는 것으로 나타났습니다.

이와 같이, 이러한 결과는 분비된 용해성 인자(soluble factor)가 공동 배양 삽입체의 막을 통과할 수 있으며, 세포-세포 접촉이 없을 경우 뉴런 PC12 세포에 세포독성 손상을 일으킬 수 있음을 보여줍니다. 여기서는 인서트 공동 배양에 대한 한 가지 시나리오만 제시했지만 매우 유연한 기술입니다. 이 프로토콜에서, 하나의 세포 유형은 삽입물을 웰로 옮길 때 두 번째 세포 유형의 거동에 영향을 미치는 용해성 인자의 분비를 감소시키는 분자로 전처리되었습니다.

그러나 공동 배양 시스템에서 두 세포 유형을 함께 배양하여 나중에 처리할 때 하나 또는 두 세포 집단의 증가된 약점 또는 내성을 감지할 수 있습니다. 이 기술은 예를 들어 기저 부분비 상호 신호전달을 평가하기 위해 어떠한 처리도 없이 함께 배양된 두 개의 세포 집단을 간단히 사용할 수 있습니다. 여기에서 입증된 바와 같이 신경염증 분야에서 가치를 인정받는 것 외에도 Insert Co-Culture 시스템은 종양 재생, 신경배반종, 세포사멸 신호 전달 또는 부분비 신호 전달 구성 요소가 있는 기타 주제와 관련된 광범위한 질문에 답하는 데 사용할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 이제 insert co-culture 시스템이 분비 용해성 인자에 의해 매개되는 변화를 평가하는 간단한 방법을 제공할 수 있는 방법을 잘 이해하게 되었을 것입니다. 그리고 우리는 세포-세포 접촉이 없는 상태에서 다세포 파라크린 신호 전달 연구에서 이 삽입 공동 배양 시스템의 높은 잠재력을 확신할 수 있기를 바랍니다.