세포 - 세포 연락이없는 두 세포 유형의 삽입 공동 배양 시스템 개발

이 절차의 전반적인 목표는 투과성 막이 있는 인서트를 사용하여 두 가지 세포 유형의 세포 공배양 시스템을 구축함으로써 분비된 수용성 인자의 확산을 가능하게 하는 것입니다. 이는 두 번째 세포 유형이 포함된 멀티웰 조직 배양 플레이트에 첫 번째 세포 유형이 담긴 인서트를 정밀하게 배치하는 일련의 단계들을 통해 수행됩니다. 우선 인서트에 1번 세포 유형을 파종하고, 멀티웰 조직 배양 플레이트에 2번 세포 유형을 파종하는 것으로 시작합니다.

두 번째 단계는 인서트를 두 번째 세포 유형이 포함된 플레이트의 웰로 옮기는 것입니다. 결과적으로 이를 통해 두 가지 세포 유형과 각각의 상층액을 수확할 수 있습니다. 따라서 분비된 수용성 인자가 대상 세포 유형에 미치는 영향을 평가하는 것이 가능합니다.

다세포 생물에서 분비된 수용성 인자들은 파라크라인 신호 전달(paracrine signalling)의 결과로 서로 다른 세포 유형으로부터 반응을 이끌어냅니다. 따라서 인서트 공동 배양 시스템의 가치는 세포 간 접촉이 없는 상태에서 분비된 수용성 인자에 의해 매개되는 세포 파라미터의 변화를 평가할 수 있는 독창적인 방법을 제공한다는 점에 있습니다. 인서트 공동 배양 시스템은 다른 공동 배양 기술에 비해 다음과 같은 여러 장점을 제공합니다: 첫째, 방향성 신호 전달이 가능하며, 둘째, 세포 극성을 유지할 수 있고, 셋째, 특정 세포군에서의 세포 변화를 개별적으로 검출할 수 있습니다.

리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide)로 활성화된 N9 미세아교세포에서 분비된 사이토카인이 뉴런성 PC12 세포에 미치는 독성 효과를 측정하기 위한 특정 프로토콜을 상세히 설명함으로써, 인서트 공동 배양 방법론에 대한 구체적인 이해를 제공하고자 합니다. 우선, 24-웰 조직 배양 플레이트와 0.4 micron 공극의 폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene) 인서트를 포장에서 꺼냅니다. 그런 다음, 멸균 핀셋을 사용하여 인서트의 맨 윗부분 가장자리를 잡고 조직 배양 플레이트의 빈 웰에 인서트를 배치합니다.

다음으로, 막이 완전히 덮일 때까지 인서트를 일반 N9 배지로 채웁니다. 세포의 부착 능력을 향상시키기 위해 인서트를 최소 1시간 또는 하룻밤 동안 배양합니다. 인서트 준비가 완료되면, 일반 N9 배지를 사용하여 80~90% 합류도(confluence)의 N9 미세아교세포를 분리하여 인서트 파종에 사용할 세포 현탁액을 얻습니다.

그다음, 마이크로피펫 팁으로 멤브레인에 구멍이 나지 않도록 주의하며 인서트에서 일반 배지를 제거합니다. 이어서, 각 인서트에 50 µL의 세포 현탁액을 사용하여 cm²당 60,000 cells의 밀도로 세포를 접종하거나, 인서트 제조업체의 프로토콜에 따라 접종합니다. 세포 현탁액을 분주하는 동안 튜브를 가끔씩 뒤집어 현탁액이 균질하게 유지되도록 합니다.

모든 인서트에 세포 파종이 완료되면, 세포를 균일하게 분산시키기 위해 플레이트를 앞뒤로, 그런 다음 좌우로 부드럽게 흔들어 줍니다. 원형으로 흔들면 세포가 인서트 중앙에 뭉칠 수 있으므로 주의하십시오. 그 후, 인서트가 포함된 플레이트를 24시간 동안 배양한 다음 N9 미세아교세포 활성화를 진행합니다.

먼저 10 mg의 lipopolysaccharide를 정량하여 나중에 사용할 수 있도록 1.5 mL Eppendorf Tube에 보관합니다. lipopolysaccharide는 강력한 염증 유발 내독소이므로 특별한 안전 예방 조치가 필요하며, 보안경, 장갑 및 분진 마스크 착용을 강력히 권장합니다. 그 후, 따뜻한 N9 처리 배지를 사용하여 lipopolysaccharide를 연속 희석하여 4, 2, 1 µg/mL 농도의 작업 용액 세트를 제조합니다.

마지막으로, 세포가 손상되지 않도록 주의하며 인서트에서 배양액의 절반을 제거합니다. 그다음, 최종 희석 농도가 2, 1 또는 0.5 µg/mL이 되도록 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide) 작업 용액 25 µL를 인서트에 조심스럽게 첨가합니다. 공동 배양 실험을 진행하기 전, 플레이트를 24시간 동안 더 배양합니다.

이 단계에서는 이전 섹션에서 설명한 대로, 제곱센티미터당 30,000 cells의 밀도로 분주하여 분화시킨 PC12 세포 간뉴런과 lipopolysaccharide로 24시간 동안 활성화시킨 N9 미세아교세포가 필요합니다. 먼저 인서트에서 모든 배지를 조심스럽게 제거한 후, 50 µL의 신선하고 따뜻한 N9 처리 배지로 교체하십시오. 이는 lipopolysaccharide의 흔적을 모두 제거하여 활성화된 N9 미세아교세포만 남기기 위해 필요합니다.

인서트는 조직 배양 플레이트의 웰 내부에서 고정되지 않은 상태이므로, 팁으로 벽면을 너무 세게 누르면 움직일 수 있다는 점에 유의하십시오. 세포가 공기에 장시간 노출되어 건조해지는 것을 방지하기 위해, 이 단계는 인서트를 하나씩 처리해야 합니다. 그 후, 신경세포 PC12 세포 배지를 완전히 제거하고 0.6 milliliters의 신선하고 따뜻한 PC12 처리 배지로 교체하십시오.

세포가 건조해지지 않도록 한 번에 하나씩 수행하십시오. 핀셋을 사용하여 인서트의 가장 윗부분 가장자리를 잡고, 뉴런형 PC12 세포가 들어 있는 웰에 조심스럽게 넣으십시오. 모든 인서트를 옮긴 후, 인서트 막 아래에 기포가 있는지 확인하십시오.

공기 방울은 인서트 막을 통한 모든 물질 교환을 방해하며 실험 전체를 망칠 수 있습니다. 핀셋을 사용하여 인서트를 웰에서 아주 조심스럽게 들어 올린 후 다시 세포 배양 배지에 넣으면 대부분의 공기 방울을 제거할 수 있습니다. 하지만 공기 방울이 계속 남아 있는 경우에는 인서트를 기울여 세포 배양 배지에 살짝 담가 제거해 보십시오.

부착 세포가 박리될 수 있으므로 인서트를 두드리거나 젓지 마십시오. 그 후, 인서트와 웰 양쪽의 배지 부피를 확인하며, 두 구획의 액체 높이가 거의 동일해야 합니다. 모든 기포가 제거되고 배지 부피가 적절하면 플레이트를 배양하십시오.

이후 N9 미세아교세포와 신경세포인 PC12 세포 사이의 파라크라인 신호 전달 효과를 측정하기 위해 세포, 배양액 또는 두 가지 모두를 수확할 수 있습니다. 염증성 사이토카인을 정량화하기 위해 하단 구획의 세포 배양액을 대상으로 효소 결합 면역 흡착 분석을 수행하였습니다. 결과에 따르면, 활성화 기간 24시간 후, 2 µg/mL의 리포폴리사카라이드로 처리한 N9 미세아교세포는 처리하지 않은 미세아교세포에 비해 interleukin-6, tumor necrosis factor-alpha, interferon gamma와 같은 염증성 사이토카인을 유의미하게 더 많이 분비하였습니다.

또한, 1 µg/mL의 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide)를 처리한 N9 미세아교세포는 24시간 후 인터페론 감마(interferon gamma)를 뚜렷하게 더 많이 분비한 반면, 세포 배양액 내 인터루킨-6(interluken-6) 및 종양괴사인자-알파(tumor necrosis factor-alpha) 수치의 유의미한 증가는 48시간이 소요되었습니다. 이와 대조적으로, 0.5 µg/mL 조건에서는 활성화 기간 후 24시간과 48시간 모두 N9 미세아교세포의 사이토카인 발현이 증가하지 않았습니다. 더욱이, 2 µg/mL 처리군의 24시간 데이터는 미세아교세포 집단이 증가하는 미세아교세포증(microgliosis)이 발생했음을 시사합니다.

하지만 세포 수는 48시간이 지난 후에야 유의미하게 증가했습니다. 마지막으로, 사이토카인 분비 증가 및 미세아교세포증으로 이어지는 미세아교세포 활성화의 결과물을 평가하기 위해, 공동 배양된 뉴런 PC12 세포의 세포독성을 측정하였습니다. 손상된 세포에서 방출되는 세포 외 젖산탈수소효소(Lactate Dehydrogenase)의 수치를 측정한 결과, N9 세포에 처리한 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide)의 농도가 증가함에 따라 뉴런 PC12 세포의 세포 사멸이 더 많이 일어나는 것으로 나타났습니다.

따라서, 이러한 결과는 분비된 수용성 인자가 공동 배양 인서트의 막을 통과할 수 있으며, 세포 간 접촉이 없는 상태에서도 신경세포 PC12 세포에 세포 독성 손상을 일으킬 수 있음을 보여줍니다. 여기서는 인서트 공동 배양의 한 가지 시나리오만 제시하였으나, 이는 매우 유연한 기법입니다. 본 프로토콜에서는 한 가지 세포 유형을 수용성 인자의 분비를 감소시키는 분자로 전처리한 후, 인서트를 웰로 옮겨 두 번째 세포 유형의 행동에 영향을 미치도록 하였습니다.

하지만, 두 세포 유형을 공동 배양 시스템에서 함께 배양하여 이후의 처리 과정에 대해 하나 또는 두 세포 집단 모두에서 나타나는 취약성 증가 또는 저항성을 검출하는 것이 가능합니다. 이 기술은 예를 들어, 아무런 처리 없이 함께 배양된 두 세포 집단을 이용해 기초적인 파라크라인 상호 신호 전달을 평가하는 방식으로 간단히 활용될 수 있습니다. 본 연구에서 입증된 신경 염증 분야뿐만 아니라, 공동 배양 시스템은 종양 재생, 신경염, 세포 사멸 신호 전달 또는 파라크라인 신호 전달 요소가 포함된 기타 광범위한 질문들에 답하는 데 사용될 수 있습니다.

이 영상을 시청하신 후, 여러분은 인서트 공동 배양 시스템이 분비된 수용성 인자에 의해 매개되는 변화를 평가하는 간단한 방법을 어떻게 제공하는지에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 또한, 세포 간 접촉이 없는 상태에서 다세포 파라크린 신호 전달을 연구하는 데 있어 이 인서트 공동 배양 시스템이 가진 높은 잠재력을 확인하셨기를 바랍니다.