박테리아, 장 및 면역 세포의 독성 및 면역 조절 요법을 위한 비동기 시스템 개발을 위한 3D 플립웰 엔지니어링

우리는 장내 점막 환경을 모방하는 3D 공동 배양 시스템을 개발하여 연속 교차 반응을 연구하고 약물 스크리닝과 점막 세포 간 상호작용 이해에 활용할 수 있는 약물 반응을 평가합니다. 여러 그룹이 매우 복잡한 생명공학 기법을 사용하여 장 점막 환경을 모델링하기 위해 여러 가지 다른 배양 시스템을 개발했습니다. 하지만 대신 우리는 저렴한 재료로 훨씬 쉽게 만들 수 있는 공동 배양 시스템을 개발했습니다.

우리의 공동 배양 시스템은 단백질 생성 약물이 장내 박테리아, 상피 및 면역 세포 간의 조정된 반응을 유발하여 숙주 면역을 활성화하고 아마도 박테리아 대사산물과 함께 종 간 소통을 매개한다는 사실을 밝혀냈습니다. 호기성 및 무기성 박테리아 균주와 그 대사산물을 연구하여 면역 조절 효과를 밝혀내고, 박테리아 대사산물을 기반으로 한 새로운 면역치료 전략의 길을 열고자 합니다. 먼저 페트리 접시 뚜껑을 열고 따로 두세요.

페트리 접시 바닥 가장자리에 메스 칼날을 놓으세요. 멸균 핀셋을 사용해 인서트를 아래쪽으로 살짝 잡아 포장에서 꺼내세요. 다른 손으로는 멸균 메스 칼날을 인서트 쪽으로 가져가세요.

C자 모양으로 막을 가장자리에서 뚫고 삽입물 바닥을 부드럽게 미끄러뜨리면서 플라스틱 벽에 가까이 붙어 있습니다. PET 멤브레인을 잘라내고 두 번째 핀셋으로 제거하세요. 그 다음 메스날로 흰색 멤브레인 조각을 긁어내어 인서트의 가장자리와 테두리를 깨끗이 청소하세요.

다음으로, 2-3밀리미터 크기의 실리콘 비즈를 인서트 바닥 전체에 부드럽게 펴 놓으세요. 막에 닿지 않도록 주의하면서요. 두 번째 멸균 겸자를 집어 들고, 막이 없는 첫 번째 삽입물을 보호 팩에서 조심스럽게 들어 올립니다. 두 인서트를 바닥에서 바닥까지 맞춰서 바닥 림이 정렬되도록 하세요.

플립웰 스택을 접착하면 원래 멸균 팩이나 깊은 페트리 접시 안에 넣어 72시간 건조하세요. 지정된 페트리 접시 뚜껑을 사용해 스택 어셈블리를 덮으세요. 스택 조립체를 멸균하려면 멸균 겸자를 사용해 플립웰 스택을 지정된 깊은 페트리 접시 가장자리에 걸어야 합니다.

그 다음 생물안전 캐비닛의 유리 창을 닫고 자외선을 켭니다. 콜라겐 코팅 전에 누출 여부를 검사하려면 먼저 멸균 PBS 또는 멸균 탈이온수 500마이크로리터를 추가합니다. 다음 날, 테스트용 액체를 흡입한 후 생물안전 캐비닛 안에서 1-2시간 동안 말립니다.

막을 콜라겐으로 코팅하려면 페트리 접시 뚜껑을 열고 플립웰을 페트리 접시 가장자리에 매달아 두세요. 인서트 스택 한쪽에 콜라겐 용액 200마이크로리터를 조심스럽게 추가하세요. 콜라겐 용액을 1시간 후에 흡입한 후 멸균 PBS 200마이크로리터를 피펫팅하세요. PBS를 흡입한 후에는 페트리 접시를 뚜껑으로 덮고 막을 캐비닛 안에서 60분간 건조시킵니다.

막이 마르면 멸균 겸자나 핀셋을 사용해 플립웰을 반대편으로 뒤집어 페트리 접시 가장자리에 매달게 하세요. 박테리아 삽입물을 만들기 위해서는 멸균 겸자 두 세트와 24웰 삽입물을 생물안전 캐비닛 안에 넣으세요. 멸균 핀셋으로 인서트를 멸균 팩에서 들어 올려.

두 번째 핀셋이나 겸자로 인서트 바닥의 작은 플라스틱 발을 부러뜨립니다. 24웰 인서트를 멸균된 Flipwell 공동 배양 인서트 스택 또는 원래 12웰 인서트 안에 넣어 테스트하세요. 플립웰 씨앗을 시작하려면, 플립웰 꼭대기 쪽 양쪽에 상피세포 라인 500마이크로리터를 씨앗 뿌리세요.

조립체를 페트리 접시 뚜껑으로 덮고, 세포가 부착될 때까지 37도 섭씨에서 5% 이산화탄소와 함께 하룻밤 배양합니다. 페트리 접시 뚜껑을 열고 플립웰 스택의 꼭대기 쪽에서 DMEM 매체를 흡입하세요. 멸균 겸자로 플립웰을 갈고리 부분에서 조심스럽게 집어 180도 회전시키세요.

두 번째 멸균 겸자로 플립웰 스택을 다른 갈고리를 위쪽으로 향하게 잡으세요. 그 다음 조립체를 다시 페트리 접시 안으로 내리고 페트리 접시 가장자리에 갈고리를 걸어두세요. 공동 배양 삽입물 스택의 꼭대기 쪽에 THP-1 세포 현탁액 500마이크로리터를 추가합니다.

깊은 웰 페트리 접시에 배지를 추가하여 대장 상피세포에 맞는 HT-29 배지를 조정합니다. 기포를 제거하려면 멸균 겸자로 플립웰 스택을 팔에 잡아 주세요. 조심스럽게 가비지 바늘을 삽입물 안으로 넣고 그 아래에 넣고, 부드러운 팁을 아주 부드럽게 공기 방울 쪽으로 올려주세요.

조심스럽고 천천히 주사기 플런저를 위로 당기면 공기 방울이 천천히 사라지는 걸 지켜보세요. 그 다음 플립웰에서 바늘과 주사기를 조심스럽게 빼세요. 공기 방울을 가비지 바늘로 제거한 후, 세포 배양 인큐베이터에서 두 가지 세포 유형을 배양합니다.

겸자로 인서트를 멸균된 페트리 접시 안에 넣고 뚜껑을 덮으세요. 플립웰이 달린 페트리 접시를 생물안전 캐비닛으로 옮기고, 박테리아 삽입물이 있는 접시 반대편에 따로 두세요. 플립웰 꼭대기면에서 DMEM 매체 300마이크로리터를 피펫팅해 박테리아 삽입물을 넣고, 페트리 접시 뚜껑으로 덮으세요.

이제 24웰 박테리아 삽입물에 50에서 100마이크로리터의 Bacillus subtilis 배양물을 추가해 플립웰 상단에 삽입합니다. 팔을 돌려서 플립웰 공동 배양 인서트 스택의 가장자리에 걸어 놓으세요. 두 번째 멸균 겸자로 스택을 잡아주세요.

3시간 배양 후에는 멸균 겸자를 사용해 플립웰에서 박테리아 삽입물을 제거합니다. 플립웰을 분해하지 않고 50밀리리터 원뿔형 튜브 안에 넣으세요. 전자현미경 촬영을 위해 플립웰을 분해하려면 양손으로 잡고 접착된 스택의 각 부분을 비틀어 떼어내세요.

멤브레인과 함께 인서트를 돌려서 멤브레인을 위로 향하게 놓으세요. 삽입물을 잡고 메스칼날로 막을 조심스럽게 잘라낸 후, 1.7밀리리터 파라폼 알데히드 용액이 담긴 튜브 안에 넣으세요. 공초점 현미경 촬영을 위해서는 꼭대기 쪽에 멸균 PBS 300마이크로리터를 추가하세요.

PBS를 피펫팅한 후 조심스럽게 페트리 접시에서 스택을 제거하세요. 이제 플립웰을 뒤집고 플립웰 공동 배양 인서트 스택의 위쪽 RPMI 쪽에 300마이크로리터의 PBS를 추가한 후, 인산염 완충 식염수를 흡인합니다. 200마이크로리터 피펫을 사용해 큰 PBS 방울을 만듭니다.

인서트 어셈블리를 돌려서 인서트와 분리하세요. 그 다음 플립웰 스택을 THP-1 세포가 포함된 200마이크로리터 PBS 드롭 위에 조심스럽게 배치합니다. 대장 상피세포와 함께 200마이크로리터의 투과성 완충제를 상단에 넣고 10분간 방치합니다.

면역형광 염색을 위해서는 삽입물 상단에 1차 항체 300마이크로리터를 피펫으로 채취합니다. 12웰 플레이트의 웰에 1차 항체 300마이크로리터를 추가한 후, 인서트를 웰 안에 액상 위에 올려놓습니다. 항체를 잘 덮어.

염색 검사에서는 세피아프테린 처리 후 장 상피 구획에서 점액 분비가 극적으로 증가하는 것이 나타났으며, 이는 상피 표지 단백질인 CK20과 점막 단백질 MUC2의 증가로 나타났습니다. THP-1 단일배양에서는 세피아프테린 처리가 M1 대식세포 표지 CD80의 발현을 유의하게 증가시키는 반면, M2 대식세포 표지 CD163을 하향 조절하여 M1 분극을 시사합니다. 주사 전자현미경 관측에서 상피세포에서 점액 분비가 증가하는 것이 확인되었습니다.

세피아프테린 처리는 단일 배양과 공동 배양 모두에서 M1 표현형과 유사한 대식세포 형태를 유도합니다. 세피아프테린 처리 단일배양 내 박테리아 세포는 바이오필름 형성을 특징적으로 보이는 주름진 표면을 보였다.