두 가지 유형의 부착 세포주를 사용한 공동 배양 모델

우리 기관의 이름인 모체-태아 의학 연구소(Maternal-Fetal Medicine Institute)에서 알 수 있듯이 우리 연구는 주로 여성 생식 생물학에 중점을 두고 있습니다. 우리는 생식 장애의 메커니즘을 이해하고 이를 치료하기 위한 잠재적인 표적을 식별하는 것을 목표로 합니다. 이 접근 방식의 주요 장점 중 하나는 상업적으로 이용 가능한 공동 배양 시스템에 비해 시간과 비용이 크게 줄어든다는 것입니다.

수제 비계는 쉽게 구할 수 있는 재료로 제작되어 설치 비용을 크게 낮춥니다. 이 다세포 in vitro 모델은 이식 영역의 복잡한 in vivo 해부학적 구조를 더 잘 나타냅니다. 앞으로 본 연구실에서는 이 혼합 파종(mixed) 파종(seeding) 다세포 in vitro 모델에 다른 세포 유형을 도입하고, 자궁내막 손상 및 자궁내 부착과 같은 질병의 발병기전에서 착상 연구와 자궁 기능을 더 많이 조사할 것입니다.

시작하려면 모델 시공을 위한 3D 프린팅 스캐폴드를 구합니다. 세포 배양을 위해 깨끗하고 멸균된 18mm 정사각형 커버슬립을 12웰 플레이트 바닥에 놓습니다. 커버슬립을 밀리리터당 200-300마이크로그램의 농도로 200마이크로리터의 세포외 기질로 코팅합니다.

접시를 섭씨 37도에서 1시간 동안 유지합니다. 그런 다음 플레이트에서 세포외 기질을 제거합니다. 다음으로, 이전에 배양된 인간 배아 줄기 세포와 이시카와 세포를 현미경으로 검사하여 적절한 융합도를 확인합니다.

그런 다음 우물에서 사용한 배지를 제거하고 PBS 3 밀리리터로 세포를 두 번 씻습니다. 이제 섭씨 37도에서 2 분 동안 2 밀리리터의 해리 효소로 세포를 배양하여 세포를 분리하십시오. 완전한 배양 배지를 사용하여 반응을 중화합니다.

그런 다음 위아래로 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 만듭니다. 이제 100마이크로리터의 세포 현탁액을 트리판 블루와 혼합하여 희석 계수를 2로 유지합니다. 그런 다음 커버슬립을 혈구계 챔버 위로 밀어 넣습니다.

양쪽 측면 챔버를 트리판 블루와 혼합된 세포 현탁액으로 채웁니다. 20X 현미경으로 양쪽의 사각형 안에 있는 세포의 수를 세고, 그 개수를 기반으로 세포 밀도를 계산합니다. 이제 새로운 배지가 들어있는 준비된 플레이트에 인간 배아 줄기 세포를 10의 농도로 10 밀리리터당 5 개의 세포의 힘으로 파종하고 섭씨 37도에서 5 % 이산화탄소로 24 시간 동안 배양합니다.

Ishikawa 세포주의 경우, 다음 날 커버슬립 없이 세포를 웰에 파종합니다. 골격을 에틸 알코올과 이중 증류수로 2 일 동안 철저히 담그십시오. 담근 후 이중 증류수를 제거하고 금속 캔을 밀봉하십시오.

그런 다음 섭씨 121도에서 오토클레이브를 사용하여 골격을 살균합니다. 그 후 말리십시오. 약 2ml의 상보적 배지를 Ishikawa 세포가 있는 웰에 추가합니다.

인간 배아 줄기 세포가 부착된 커버슬립을 골격으로 옮기고 세포 쪽이 아래로 향하게 놓습니다. 발판을 이시카와 세포가 들어있는 웰에 끼웁니다. 두 번째 설정의 경우 Ishikawa 세포가 있는 커버슬립을 골격에 놓고 배아 줄기 세포가 들어 있는 웰에 꽂습니다.

섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 공동 배양 시스템을 배양합니다. 웰에서 배양 배지를 조심스럽게 제거하고 멸균 PBS로 세포를 부드럽게 헹굽니다. 가는 집게 또는 핀셋을 사용하여 배양 접시에서 세포가 부착된 커버슬립을 제거합니다.

선택적으로 PBS가 있는 새 접시에 커버슬립을 넣어 전사 과정에서 수분을 유지합니다. 깨끗한 현미경 슬라이드에 PBS 한 방울을 추가하고 세포가 포함된 커버슬립을 드롭에 부드럽게 옮겨 세포가 슬라이드 위에 앞면이 아래를 향하도록 합니다. 준비된 슬라이드를 도립 현미경의 무대에 놓습니다.

적절한 대물 렌즈를 선택하고 거친 초점 및 미세 초점 노브를 사용하여 초점을 조정합니다. 조명 강도 및 카메라 설정을 포함한 현미경 매개변수를 설정합니다. 현미경 소프트웨어를 사용하여 원하는 배율과 시야에서 이미지를 캡처할 수 있습니다.

두 세포 유형의 밀도는 72시간 후에도 공동 배양 조건에서 낮게 유지된 반면, 독립적으로 배양된 세포 밀도는 크게 증가했습니다. 공동 배양된 인간 배아 줄기 세포의 길이는 독립적으로 배양된 세포보다 짧았습니다.