비 투명 공사장 공중 발판에 이미징 세포 생존 - 소설 니트 티타늄 임플란트의 예를 사용하여

이 실험의 전반적인 목표는 형광 이미징 기술을 사용하여 불투명 니트 티타늄 핵 임플란트의 미세 구조와 세포 접착을 시각화하는 것입니다. 이 방법은 불투명 골격을 사용한 조직 공학 분석을 발전시킵니다. 이 기술의 한 가지 장점은 정의된 배양 ped-air를 통해 골격의 세포 생존율과 증식을 추적할 수 있다는 것입니다.

이 방법을 시각적으로 시연하는 것은 형광 염색과 나중에 시각화하는 것이 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 공극 크기와 같은 개별 골격 특성은 타이밍에 영향을 미칠 수 있으며, 및/또는 골격의 형광은 사용 중인 형광단의 선택에 영향을 미칠 수 있습니다. 50mm 튜브에 6mm 또는 7mm 두께의 골격을 최대 5개까지 놓고 세척할 때마다 20분 동안 물로 세 번 세척합니다.

실온에서 부드럽게 저어주면서 이 작업을 수행합니다. 다음으로, 동일한 조건에서 30ml의 1% Triton X-100 용액으로 스캐폴드를 세척합니다. 그런 다음 물을 두 번 더 씻으십시오.

이제 시약 등급 99% 아세톤, 99% 이소프로판올 및 99% 에탄올에서 골격을 순차적으로 초음파 처리합니다. 각 초음파 처리 단계를 각 초음파 처리당 5분 동안 두 번 수행합니다. 그런 다음 총 15분 동안 물에서 골격을 세 번 더 초음파 처리합니다.

보푸라기가 없는 티슈에 골격을 놓고 실온에서 밤새 자연 건조하여 마무리합니다. 다음 날, 섭씨 121도, PSI 15도에서 15분 동안 스캐폴드를 오토클레이브합니다. 청소가 제대로 되었는지 확인하려면 간접 형광을 사용하십시오.

12웰 플레이트의 1웰에 갓 만든 유황-로다민 B 염색 용액 2000마이크로리터를 넣고 집게를 사용하여 해당 웰에 골격을 옮깁니다. 그런 다음 RFP LED 큐브 필터 세트가 장착된 형광 현미경을 사용하여 골격의 네거티브 이미지를 캡처하고 고배율에서 불순물을 찾습니다. 생물 안전 캐비닛 하나를 사용하여 깨끗한 골격을 24웰 플레이트의 웰로 옮깁니다.

각 웰에 섭씨 37도 배양 배지 500마이크로리터를 추가하고 골격을 15분 동안 담가둡니다. 한편, 배지 1밀리리터당 500, 000개의 Ad-GFP 감염 SEP1 세포를 준비합니다. 15 분 후, 골격에서 배지를 완전히 흡인하고 100 마이크로 리터의 세포 현탁액으로 앉 힙니다.

그런 다음 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 짧은 배양 후 500 마이크로 리터의 배양 배지를 더 추가하고 24 시간 동안 골격을 배양합니다. 다음날, 배양 배지를 변경하여 부착되지 않은 세포를 제거합니다.

그런 다음 GFP LED 큐브 필터 세트가 장착된 형광 현미경을 사용하여 세포의 부착 및 골격에 퍼지는 것을 평가합니다. 살아있는 염색의 경우 먼저 이전과 같이 골격의 SEP1 세포를 플레이트합니다. 24-48시간 후 배양 배지를 완전히 흡인하고 실온에서 5분 동안 DPBS로 골격을 세척합니다.

이제 Calcein AM, Hoechst 33342 및 Ethidium homodimer를 포함하는 배양 배지를 사용하여 세포를 염색합니다. 이 세 가지 형광단은 모두 빛에 민감하므로 세포가 앞으로 어둠 속에 있도록 유지하는 것이 중요합니다. 세포를 형광단으로 30분 동안 배양하여 골격 전체에 고르게 분포

특정 골격 특성은 이 배양 시간에 영향을 미칩니다. 배양 후 웰당 1ml를 사용하여 DPBS로 세포를 세 번 세척합니다. 실온에서 5분 동안 세탁할 때마다 실행합니다.

세척 직후, 형광 현미경을 사용하여 골격을 문서화합니다. 시간 경과에 따른 세포 생존율을 측정하려면 레사주린 변환 측정값을 사용하십시오. 먼저, 24웰 플레이트에 장착된 SEP1 세포에서 배양 배지를 완전히 흡인하고 웰당 500마이크로리터의 DPBS로 세포를 세척합니다.

그런 다음 필요한 양의 멸균 레사주린 작업 용액으로 셀을 덮고 레사주린만 있는 하나의 웰을 포함합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 약 30분 동안 세포를 배양합니다. 배양 후, 각 웰에서 컨디셔닝된 상등액 100마이크로리터를 96 마이크로웰 플레이트로 옮겨 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 형광을 측정합니다.

추가 재배를 위해 우물에서 레사주린을 제거하고 1밀리리터의 DPBS로 세 번 씻습니다. 실온에서 5분 동안 세탁할 때마다 수행합니다. 세 번째 세척 후 세포의 각 웰에 500마이크로리터의 배양 배지를 추가하고 추가 시간 경과 측정을 위해 배양을 계속합니다.

간접 형광 염색을 사용하여 세척 전 불순물을 문서화하여 세척 프로토콜을 최적화했습니다. 비계에 대한 물질 부하의 현저한 감소는 설명된 세척 프로토콜의 효율성을 보여줍니다. 관절 치환술 치료에 사용되는 연속적인 임플란트는 세포 재료 계면에서 발생하는 이벤트에 의해 결정됩니다.

지지체를 24시간 동안 부착한 후 SEP1 세포가 부착되었습니다. 그런 다음 형광단을 적용하여 골격에서 일정 기간 동안의 세포 사멸 및 증식을 검사했습니다. 살아있는 사체 염색은 죽은 세포에서 적색 형광으로 청색 핵 염색을, 생존 세포에서 녹색 형광으로 염색되는 것을 보여주었습니다.

또한, 스캐폴드의 세포 생존율은 레사주린 전환 분석법을 사용하여 정량화하였다. 2주에 걸쳐 골격이 있거나 없는 곳에서 배양된 세포에 대한 데이터를 수집했습니다. 이 절차를 시도하는 동안 사용 중인 형광단을 사용 가능한 골격과 현미경에 맞게 조정하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 면역형광 염색과 같은 다른 방법을 적용하여 단백질의 존재 또는 신호 캐스케이드의 활성화를 시각화할 수 있습니다. 이 기술의 의미는 관절 치환술 치료로 확장되는데, 이는 생체 내에서 주변 조직과의 세포면 상호 작용이 그 기능과 내구성을 정의하기 때문입니다.