방법 및 HCN1 TRIP8b 간의 단백질 - 단백질 상호 작용의 작은 분자 억제제 식별

이 절차의 전반적인 목표는 TRIP8b와 HCN 채널 간의 상호 작용을 방해할 수 있는 작은 분자를 식별하는 것입니다. 이 방법은 우울증에 대한 새로운 치료법으로 개발될 수 있는 후보 분자를 식별합니다. 이 기술의 주요 장점은 높은 처리량 방식으로 완료할 수 있다는 것입니다.

이 기술은 주요 우울 장애에 대한 새로운 치료법 개발에 영향을 미치는데, 그 이유는 본 연구실에서 HCN에 대한 TRIP8b 결합을 방해하는 것이 치료적 이점이 있을 수 있음을 보여주었기 때문입니다. 이 방법은 우울증을 염두에 두고 개발되었지만, TRIP8b와 HCN 간의 상호 작용을 방해하는 것은 만성 통증과 같은 다른 질환에서 치료에 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜의 시각적 시연은 노스웨스턴 대학교의 고처리량 분석 실험실과 같은 개방형 시설에서 기본 및 중개 연구를 진행하기 위해 자동화된 고처리량 기기를 사용하는 이점을 보여주기 때문에 중요합니다.

TRIP8b 241-602 단백질 단편을 정제하고 양성 대조군으로 단백질 단백질 상호 작용을 검사한 후 텍스트 프로토콜에 따라 TRIP8b 및 HCN1-FITC 분취액을 해동하고 얼음에 보관합니다. FP 버퍼를 사용하여 20밀리리터의 2마이크로몰 TRIP8b 및 50나노몰 HCN1-FITC를 준비합니다. 그런 다음 혼합물 25마이크로리터를 저결합 384웰 블랙 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 분배합니다.

라이브러리 스크리닝의 경우, acoustic liquid handler를 사용하여 100나노리터의 화합물을 3-22열의 각 웰에 분사하여 최종 농도를 40마이크로몰로 만듭니다. 100나노리터의 DMSO를 1열과 23열의 각 웰에 negative control로 분배합니다. 100나노리터의 표지되지 않은 HCN1 펩타이드를 최종 농도가 10마이크로몰인 양성 대조군으로 컬럼 2 및 24의 각 웰에 분주합니다.

플레이트를 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 플레이트 리더를 사용하여 형광 편광을 측정합니다. 또는 플레이트를 읽기 전에 섭씨 4도에서 16시간 동안 보관할 수 있습니다.

다음 방정식을 사용하여 퍼센트 억제를 계산하고, 여기서 XN은 신호 X.X positive에 해당하는 정규화된 퍼센트 억제이고, X positive는 positive control wells로부터의 평균 신호이고, X negative는 negative control well로부터의 평균 신호이다. 50% 이상의 억제를 가진 Hits를 검증하기 위해 FP 완충액에서 20ml의 2마이크로몰 TRIP8b 및 50나노몰 HCN1 TAMRA의 마스터 믹스를 준비합니다. 25마이크로리터의 마스터 믹스를 검은색 384웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 분배합니다.

그런 다음 각 활성 화합물의 2배 연속 희석액을 포함하는 플레이트에서 100나노리터의 화합물을 각 웰에 추가합니다. negative control well의 경우 100나노리터의 DMSO를 추가합니다. 양성 대조군의 경우, 최종 농도가 200마이크로몰에서 0.1마이크로몰 사이인 연속 희석된 비표지 HCN1 펩타이드 100나노

플레이트를 실온에서 2시간 동안 또는 섭씨 4도에서 16시간 동안 배양합니다. 플레이트 리더를 사용하여 형광 편광을 측정합니다. 4 파라미터 비선형 회귀 모델을 사용하여 각 화합물의 농도 종속 FP 데이터를 피팅하여 IC50 값을 계산합니다.

HIS 태그가 지정된 TRIP8b 및 GST 태그가 지정된 HCN1 융합 단백질을 각각 하나의 부분 표본을 해동하고 얼음 위에 보관합니다. 테스트할 각 화합물에 대해 분석 버퍼에 200나노몰 HIS TRIP8b 1밀리리터와 GST-HCN1C40 20나노몰을 준비합니다. 16채널 피펫을 사용하여 7마이크로리터의 HIS-TRIP8b GST-HCN1C40 혼합물을 A에서 N까지의 행당 3개의 웰에 첨가하여 각 화합물을 3회씩 테스트합니다.

플레이트를 간단히 원심분리하여 액체가 각 웰의 바닥에 있는지 확인하고 기포를 제거합니다. 다음으로, 열 A에 있는 200 마이크로몰의 마지막 농도를 달성하고 열 L.Add에 있는 DMSO의 동일한 양을 M.Then 분배하기 위하여 판으로 레테르를 붙이지 않은 HCN1 펩티드를 10 마이크로몰의 마지막 농도에 분배하십시오 2 분 동안 격판덮개를 동요하고 실내 온도에 2.5 시간 동안 배양하십시오. 분석 버퍼를 사용하여 Anti-GST 수용체 비드 1에서 50으로 희석합니다.

16채널 피펫을 사용하여 3.5마이크로리터의 희석된 수용체 비드를 플레이트의 각 웰에 추가하고 기포가 생성되지 않도록 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 실온의 어두운 곳에서 1시간 동안 플레이트를 배양합니다. 니켈 킬레이트 도너 비드를 분석 버퍼로 1-50으로 희석하면서 혼합물을 빛에 노출시키지 않습니다.

3.5마이크로리터의 희석된 도너 비드를 플레이트의 각 웰에 넣고 기포를 피하면서 부드럽게 혼합합니다. 플레이트를 밀봉하고 실온의 어두운 곳에서 1.5시간 동안 배양합니다. 그런 다음 플레이트 리더를 사용하여 여기에 나열된 측정 매개변수가 있는 플레이트를 읽습니다.

마지막으로, 4 파라미터 비선형 회귀 모델을 사용하여 각 화합물에 대한 데이터를 피팅하여 IC50 값을 계산합니다. HCN1 TAMRA TRIP8b와의 상호작용을 평가하기 위해 HCN1 TAMRA의 고정 농도로 적정했습니다. 이 그래프는 TRIP8b의 농도가 증가함에 따라 더 많은 HCN1 TAMRA 분자가 결합하고 분극화가 증가함을 보여줍니다.

이 실험에서는 표지되지 않은 HCN1을 고정된 농도의 TRIP8b 및 HCN1 TAMRA로 적정하여 표지된 펩타이드를 치환하고 신호를 감소시켰습니다. 고처리량 스크리닝은 그래프에서 단일 점으로 표시되는 각 화합물의 억제 비율을 보여줍니다. 이 스크리닝의 결과는 양성 및 음성 대조군으로 표시되며, 두 번의 분석 실행에 걸쳐 각 화합물의 평균 억제 비율이 표시됩니다.

그런 다음 이 실험에서 50% 이상의 억제를 나타내는 화합물을 검증했습니다. X 및 Y 좌표는 두 번의 분석 실행에서 억제율에 의해 결정되었습니다. 이 실험에서 HCN1C40에는 수용체 비드를 결합하는 말단 단자 GST 태그가 포함되어 있습니다.

TRIP8b의 TPR 도메인과 HCN1의 C 말단 트리펩타이드의 상호 작용은 680 나노미터 파장의 광으로 공여체 비드를 여기시켜 일중항 산소를 생성합니다. 마지막으로, 이 그래프에서 볼 수 있듯이, 히트 화합물 NUCC-5953의 농도 증가를 TRIP8b 및 HCN1C40의 고정 농도로 적정하면 TRIP8b HCN1 상호 작용의 억제가 증가했습니다. High Throughput 스크리닝을 시작하기 전에 bead-based proximity assay에서 단백질 준비와 형광 편광을 검증합니다.

단백질의 순도가 높은지 확인하십시오. 여러 번의 동결 해동 주기를 피하기 위해 단백질을 분취하십시오. 신선한 DMSO 및 Triton을 포함한 고품질 시약을 사용하는 것이 중요합니다.

DMSO와 함께 작업하는 것은 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 개인 보호 장비를 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오. 이 절차에 따라 전기생리학 및 유세포 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 유효 화합물이 세포에서 활성을 갖는지 확인할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 형광 편광 기반 분석법으로 고처리량 스크리닝을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.