Name: 방법 및 HCN1 TRIP8b 간의 단백질 - 단백질 상호 작용의 작은 분자 억제제 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: 배우세요 형광 편광 기반 고처리량 스크리닝을 통해 TRIP8b와 HCN 채널 간 상호작용을 억제하는 소분자를 식별하는 방법입니다. 이 기술은 주요 우울증 및 만성 통증 치료제 개발에 활용될 수 있습니다.

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이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 보조금 R21MH104471 및 R01MH106511(D.M.C.), 뇌 연구 재단 SG 2012-01(D.M.C.), 노스웨스턴 대학교 임상 및 중개 과학 연구소(Northwestern University Clinical and Translational Sciences Institute) 8UL1TR000150(Y.H.), 시카고 생물의학 컨소시엄(Chicago Biomedical Consortium HTS-004)(Y.H. 및 D.M.C.) 및 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 보조금 2T32MH067564(K.L.)의 지원을 받았습니다. 이 작업의 일부는 분자 혁신 및 약물 발견 센터(CMIDD)의 노스웨스턴 대학교 의약 및 합성 화학 코어(ChemCore)에서 수행되었으며, 이 센터는 시카고 커뮤니티 트러스트 및 암 센터 지원 보조금 P30 CA060553 시카고 커뮤니티 트러스트의 Searle Funds의 지원과 함께 Chicago Biomedical Consortium의 자금 지원을 받습니다. 고처리량 스크리닝 작업은 Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center의 핵심 시설이기도 한 High Throughput Analysis Laboratory에서 수행되었습니다.

TRIP8b (241-602) 단백질의 정제 (1) <ol><li> 관할 E.으로 박테리아 단백질 발현 벡터 pGS21 3 (241-602) TRIP8b를 포함하는 플라스미드를 변형 대장균 제조업체의 지침에 따라 단백질 발현합니다. 플레이트 루리아 국물 (LB)의 문화 300 μL는 클로람페니콜과 암피실린의 5 ㎍ / ㎖로 -agar. 16 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어. </li><li> 다음 날, 하나의 식민지가 클로람페니콜과 암피실린의 50 μg의 / ㎖와 50 ㎖ LB를 접종 선택합니다. (진탕) 16 시간 동안 37 ° C에서 문화를 품어. </li><li> 암피실린 50 ㎍ / ml의 LB의 1 L에 50 ml의 문화를 추가합니다. 진탕 37 ° C에서 품어. </li><li> 배양은 0.8 내지 1.2의 OD 판독 (600)에 도달하면, 18 ° C로 인큐베이터의 온도를 변경하여 최종 농도 1mM IPTG (이소 프로필 - 베타 - 디 - 티오 갈 락토 시드)를 추가한다. 단백질 발현 16 시간 동안 진행하도록 허용. </li><li> E.는 스핀 다운 4 ° C에서 15 분 동안 6,000 XG에 대장균 박테리아 펠렛합니다. 원심 분리기에서 튜브를 제거한 후, 절차의 남은 얼음 위에서 박테리아를 유지한다. 페닐 메탄 설 포닐 플루오 라이드 0.25 밀리미터 (PMSF)을 완충액 A 36 ㎖ 중의 세균을 재현 탁. </li><li> 높은 전력에서 30 초 &#39;오프&#39;에 &#39;30 초 사이에 교대로 5 ~ 10 분 동안 평평한 볼트를 사용하여 얼음에 재현 탁 박테리아를 초음파 처리. </li><li> 4 ℃에서 15 분 동안 12,000 XG에 원심 분리기. 상등액은 아직 명확하지 않은 경우 추가로 15 분 동안 원심 분리기. </li><li> 2 ml의 니켈 NTA 구슬의 컬럼에 뜨는을 적용합니다. 부드러운 락 4 ° C에서 60 분 동안 품어. </li><li> 언 바운드 물질이 칼럼을 통해 흘러 버퍼 A. 500 ㎖로 세척 할 수 있도록 허용 </li><li> 버퍼 B. 250 ㎖로 열을 씻으십시오 </li><li> 버퍼 (A)의 125 ml를 5 mM의 이미 다졸 보충과 열을 씻으십시오. </li><li> 아프로 단백질을 용출20 ml의 용출 버퍼와 열을 해요. </li><li> 주사기를 사용 - 투석 카세트 (10 kDa의 분자량 컷오프)에 용출 된 단백질을 추가합니다. 39 ° C의 저온 인산염 완충액 (PBS) 4 L 60 분간 단백질을 투석. </li><li> 차가운 PBS의 새로운 4 L 통에 투석 카세트를 이동합니다. 4 오 ℃에서 16 시간 동안 단백질을 투석 </li><li> 다음날 아침, 제조자의 지시에 따라하는 쿠마시 단백질 검정 키트를 사용하여 단백질 농도를 확인한다. 40 μM 미만의 농도가 관찰되는 경우, 제조자의 지시를 단백질 농축기를 사용하여 다음의 단백질을 농축시킨다. 저장 -80 ° C에서 나누어지는 및 동결. </li></ol> 2. 소규모 형광 편광 분석은 두 단백질 조각의 상호 작용의 특성을 <ol><li> 40 μM TRIP8b (241-602) 200 μl를 해동하고 1.5 ML 튜브에 추가합니다. 11 추가 1.5 ml의 튜브에 PBS 100 μl를 추가합니다. </li><li> 시리즈의 다음 튜브 원래 튜브로부터 TRIP8b (241-602) 100 ㎕를 전달 상하 피펫 팅하고, 처리를 반복하여 연속 희석을 수행한다. 이것은 0.01-40 μM에 이르기까지 TRIP8b (241-602)의 2 배 희석의 12 포인트 시리즈를 생성합니다. </li><li> 0.1 μM HCN1 FITC (10 μM의 분취 량의 6.5 μL) 및 PBS에서 2 mM의 디티 오 트레이 톨 (DTT)의 650 μl의 마스터 믹스를 준비합니다. 참고 : 마스터 믹스가 2 배입니다. </li><li> 12 새로운 1.5 ml의 튜브를 설정합니다. 각 튜브에 HCN1 FITC를 포함하는 마스터 믹스 50 μl를 추가하고 12 연속 희석에서 각각 50 μl를 추가합니다. 참고 :이 12 튜브를 생성, 각 원래 시리얼 희석에서 0.05 μM HCN1 FITC 함유 TRIP8b (241-602)의 농도의 절반입니다. </li><li> 세중에 잘 당, 세이 판에 30 μl를 희석 시리즈를 추가합니다. 낮은 바인딩 검은 색 384 웰 플레이트를 사용합니다. </li><li> 판 F 스핀또는 실온에서 900 XG에 2 분. </li><li> , 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 플레이트를 참조하십시오. 다음 측정 파라미터를 사용하여 형광 편광을 측정 : 485 nm의 여기, 530 nm의 방출 505 nm의 다이크로 익 미러, 100 msec의 통합 시간. </li><li> TRIP8b 대수 규모 (241-602) 농도 대 편광 (MP) 값을 플롯. 표지 HCN1 펩타이드에 대한 TRIP8b (241-602)의 친 화성 (K d 개)를 결정하기 위해 힐 식으로 데이터를 장착한다. 주 : 희석액을 제조하기위한, 멀티 - 웰 플레이트는 튜브 대신에 사용될 수있다. </li></ol> 3. 긍정적 인 제어를 사용하여 단백질 - 단백질 상호 작용을 검사 <ol><li> 1.5 ML 튜브에 레이블이없는 HCN1 펩타이드 (200 μM) 200 μl를 추가합니다. 11 추가 1.5 ml의 튜브에 PBS 100 μl를 추가합니다. 제 1 튜브에 200 μL의 펩티드를 함유하는 튜브에서 100 μl를 전송하여 일련의 희석을 수행100 ㎕의 PBS의. 레이블이없는 HCN1 펩타이드의 2 배 희석 12 튜브를 생성하는 과정을 반복합니다. </li><li> 0.2 μM HCN1 FITC 4 μM TRIP8b (241-602)의 650 μl의 마스터 믹스를 준비합니다. 참고 :이 배 솔루션입니다. </li><li> 12 새로운 1.5 ml의 튜브에 마스터 믹스 50 μl를 추가합니다. </li><li> 1.5 ML 튜브에 각각의 용액을 희석 50 μl를 추가합니다. </li><li> 물론 당 30 μl를 추가 중으로 검은 색 384 웰 마이크로 타이 터 플레이트를 넣습니다. </li><li> 실온에서 900 XG에 2 분 동안 접시를 원심 분리기. </li><li> FP 할 수있는 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 판을 읽어보십시오. 단계 2.7에 기재된 것과 동일한 설정을 사용한다. </li><li> K d를 1 = IC (50) / (1 + [L] / K d를 2), K d를 1 레이블이없는의 친 화성을 나타냅니다 쳉 - 프 루소 프 방정식을 사용하여 TRIP8b의 레이블이없는 펩타이드 (241-602)의 친 화성을 계산 TRIP8b (241-602), IC (50)에 대한 펩타이드는 이전 단계에서 결정된다상기 표지 리간드를 대체하는 비 표지 된 리간드의 능력, [L] 단계 3.2 표지 리간드의 농도는를 나타내고, K의 D 2 표지 리간드 TRIPb (241-602)의 친 화성이다. </li></ol> 4. 평가 분석 성능 (계산 Z 팩터) <ol><li> 2 μM TRIP8b (241-602), 50 nM의 HCN1 FITC 및 FP 버퍼에 1 mM의 DTT와 FP 버퍼의 12 ml의 솔루션을 제공하여 마스터 믹스를 준비합니다. 참고 :이 40 μM TRIP8b (241-602)의 60 μL, 10 μM HCN1 FITC 60 μL 및 FP 버퍼의 1,080 μl를 필요로 할 것이다. </li><li> 검은 384- 웰 마이크로 타이 터 플레이트의 각 웰에 마스터 믹스의 30 μL를 추가한다. </li><li> 긍정적 인 제어 역할을 192 웰에 1 mM의 레이블이없는 HCN1 펩타이드의 1 μl를 추가합니다. </li><li> 음성 대조군 역할을 192 우물에 FP 버퍼 1 μl를 추가합니다. </li><li> 실온에서 900 XG에 2 분 동안 접시를 원심 분리기. </li><li> 마일을 사용하여 판을 읽고croplate 리더. </li><li> 다음 식을 사용하여 분석 용 Z 계수를 계산한다 : Z = 1 - * (σ POS -σ NEG) / (μ NEG -μ POS) σ의 POS 및 σ의 NEG는 양성 및 음성 대조군 웰의 표준 편차는 어디 및 μ POS 및 NEG μ는 양성 및 음성 대조군 웰의 평균 신호를 나타낸다. </li></ol> 5. 높은 처리량 화면 <ol><li> TRIP8b (241-602) 및 HCN1 FITC의 분취 량을 해동 얼음에 보관하십시오. </li><li> FP 버퍼에 TRIP8b (2 μM) 및 HCN1 FITC (50 ㎚) 10 ㎖를 준비합니다. </li><li> 피펫을 사용하여 384 웰 블랙 마이크로 타이 터 플레이트 바인딩 로우의 각 웰에 혼합물의 25 μl를 분배. </li><li> 라이브러리 심사를 들어, 음향 액체 핸들러를 사용하여 컬럼의 각 웰 3 (각 40 μM 최종 농도) (22)에 화합물을 추가합니다. 참고 : 인해 relativel에이 분석으로 관찰 Y 낮은 적중률은 두 개의 서로 다른 화합물은 하나의 우물에 모아졌다. 각 활성 우물에서 두 화합물은 후속 활성을 부여하는 식별하기 위해 개별적으로 시험 하였다. </li><li> 열 한 각 플레이트 (23)와 같은 음성 대조군의 각 웰에 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)의 100 NL을 추가합니다. </li><li> 열이 각 판의 24 양성 대조군의 각 웰에 레이블이없는 HCN1 펩타이드를 추가합니다. </li><li> 실온에서 2 시간 동안 플레이트를 인큐베이션. 판을 읽거나 읽기 전에 16 시간 동안 4 ° C에서 품어. </li><li> 접시 리더에 형광 편광을 측정합니다. 단계 2.7에 기재된 것과 동일한 설정을 사용한다. </li><li> 100 %의 각 플레이트의 평균 양성 및 음성 대조군을 사용하여 신호를 정규화하여 억제율을 계산한다. X N은 신호 X에 대응하는 정규화 된 억제율 (%) 인 경우, X의 POS 식 XN = 100 % * - (- X) / (X NEG X POS) (X NEG)을 사용하여 </sub&gt; 양성 대조군 웰의 평균 신호이고, X의 NEG는 음성 대조군 웰로부터의 신호이다. </li></ol> TAMRA-태그 HCN 펩타이드를 사용하여 조회수 6. 확인 <ol><li> 유효성 검사는 TAMRA 표지 HCN1 펩타이드 (HCN1 TAMRA)를 사용하여 50 % 억제와 안타. <ol><li> 2 μM TRIP8b (241-602) 및 50 nM의 HCN1 TAMRA FP의 버퍼의 12 ML의 마스터 믹스를 준비합니다. </li><li> 검은 384- 웰 마이크로 타이 터 플레이트의 각 웰에 마스터 믹스를 25 ㎕를 분주. </li><li> 각각의 우물에 각 활성 화합물의 연속 희석을 전송합니다. 각각의 농도가 200 μM, 0.2 μM의 범위에 충돌한다는 두 배 희석액은 만든다. </li><li> 음성 대조군 반응을 위해, 각 웰에 DMSO 100 NL 옮긴다. 양성 대조군의 경우 200 ㎛에서 0.1 ㎛ 범위의 최종 농도로 희석 한 레이블이없는 HCN1 펩타이드의 100 NL을 추가합니다. </li><li> 실온에서 접시를 품어2 시간 동안. 판을 읽거나 4에서 16 시간 동안 배양 읽기 전에 C를 °. </li><li> 다음의 파라미터를 측정하여 형광 편광 (MP)를 측정 : 535 nm의 여기하는 단계; 580 nm의 방출; 535 nm의 다이크로 익 미러, 20 msec의 통합 시간. </li><li> 네 파라미터 비선형 회귀 모델 (23)을 사용하여 각 화합물의 농도 의존적 FP 데이터를 끼워 맞춤으로써 IC 50 값을 계산한다. </li></ol></li></ol> 비드 기반의 근접 분석 7. 용량 - 반응 확인 <ol><li> 그의-태그 TRIP8b (241-602) (그의-TRIP8b) 및 GST-태그 HCN1 (GST- HCN1 C40) 융합 단백질의 1 분취 량을 해동 얼음에 보관하십시오. </li><li> 400 nm의 그의-TRIP8b 40 nM의 GST HCN1 C40의 농도 분석 버퍼에 GST-HCN1 C40와 그의-TRIP8b을 결합합니다. 각 화합물의 혼합물의 300 μl를 준비 테스트 할 수 있습니다. 참고 : 화합물 11 다른 농도 플러스 DM에서 세중에서 실행됩니다SO 제어 (아무 화합물). </li><li> 제어 우물의 경우, GST-HCN1C40없이 그의-TRIP8b (200 ㎚)의 30 μl를 준비하고 개별적으로 분석 버퍼에 그의-TRIP8b없이 GST-HCN1C40 (20 ㎚)의 30 μl를 준비합니다. </li><li> 16 채널 피펫을 사용하여 플레이트의 36 우물 (위의 단계 7.2에서 준비) GST-HCN1 C40 혼합물 : 각 화합물을 테스트 할 경우, 그의-TRIP8b 7 μl를 추가합니다. 단일 화합물을 테스트하기 위해, 행 AL의 12 가지 농도 및 열 1-3에있는 3 개의 복제를 정렬합니다. 열 행 N. 1-3에 열 행 M의 1-3 (7.3에서 준비) GST-HCN1 C40 솔루션의 7 μL를 (7.3에서 준비)가 그의-TRIP8b 솔루션의 7 μl를 추가 간단히 플레이트를 원심 분리 액체가 각 웰의 맨 아래에있는 확인하고 모든 거품을 제거 할 수 있습니다. </li><li> 분배 히트 각 화합물의 농도 (행 K) 0.1 μM 아래로 (A 행)에 200 μM의 범위에 충돌하도록 상기 플레이트에 시험한다. 부피 분배행 AK에 분배 화합물의 양을 일치하는 행의 LN에서 DMSO. </li><li> 2 분 동안 판을 흔들어 실온에서 2.5 시간 동안 배양. </li><li> 분석 버퍼 방지 GST 채택 구슬 1:50 희석. </li><li> 16 채널 피펫과 플레이트의 각 웰에 희석 채택 구슬의 3.5 μl를 추가하고 부드럽게 거품을 만드는 피하기 위해 피펫 팅하여 혼합한다. </li><li> 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 접시를 품어. </li><li> 분석 버퍼와 니켈 킬레이트 기증자 구슬 1:50 희석. 빛에 혼합물을 노출시키지 마십시오. </li><li> 16 채널 피펫과 플레이트의 각 웰에 희석 된 기증자 구슬의 3.5 μl를 추가하고 부드럽게 거품을 만드는 피하기 위해 피펫 팅하여 혼합한다. </li><li> 어둠 속에서 실온에서 1.5 시간 동안 접시를 품어. </li><li> 접시 리더에서 읽어보십시오. 40 밀리 여기 시간, 100 밀리 초 발광 시간, 0.1 mm 감지 높이 : 다음 측정 매개 변수를 사용하여 플레이트 리더를 사용합니다. </li><li> EAC 피팅 데이터에 의해 IC (50) 값을 계산네 파라미터 비선형 회귀 모델 (23)을 이용하여 H 화합물. </li></ol>

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때문에 MDD 24 치료 목표로서의 잠재력 중추 신경계 4 HCN 채널 기능을 길항 약물 학적 접근법에 상당한 관심이 있었다. 그러나, 이러한 노력들은 심장 박동 심장에서 HCN 채널의 중요한 역할 및 부정맥 (25)의 위험으로 정체되어왔다. 우리는 HCN과 뇌 특정 보조 단위체 TRIP8b (8) 사이의 상호 작용을 방해하는 것은 심장 HCN 채널 (3)에 영향을주지 않고 항우울제와 같은 효과를 생성하기에 충분할 수 있음을 추론. 이 가설은 쥐가 항우울제 같은 행동 7을 전시 TRIP8b 부족한 관찰에 의해 강화되었다. 이러한 상호 작용을 표적으로하는 MDD의 치료를위한 새로운 패러다임이 될 수있다. TRIP8b의 TPR 도메인과 HCN1의 C 단자 트리 펩티드 사이의 상호 작용의 소분자 억제제를 식별하기위한 상세한 프로토콜위에서 제시했다. 그 일반적인 어플...

과분극 활성화 환상 뉴클레오티드 게이팅 (HCN) 채널은 막 흥분성을 조절하는 하나의 중요한 역할을하는 중심부 및 중추 신경계에 발현된다. HCN 채널 HCN 채널 약리 기능을 제한하는 MDD 3의 신규 한 치료에 효과적 일 수 있음을 제시하는 여러 그룹을 이끌었다 주요 우울 장애 (MDD) 2의 병인에 연루되어있다. 그러나 직접 HCN 채널을 대상 이유로 인해 심장 활동 전위 (4)에서의 중요한 역할의 생존이 아니다. Ivabradine 유일한 FDA는 HCN 채널 길항제를 승인하는 서맥 효과 (5)를 생성하는 심부전의 치료에 사용된다. 따라서, 중추 신경계에서 독점적 HCN 채널 기능을 제한 약리학 적 제제에 대한 필요성이 존재한다. 반복 함유 Tetratricopeptide Rab8b 상호 작용하는 단백질 (TRIP8b하면) 뇌 정시이다HCN 채널 6,7의 표면 발현 및 현지화를 제어 HCN 채널 FIC 보조 서브 유닛. TRIP8b의 유전자 녹아웃 심장 8 HCN의 발현에 영향을주지 않고 뇌 HCN 채널 (7)의 감소를 야기한다. 흥미롭게도, TRIP8b 녹아웃 마우스는 강제 수영 작업과 꼬리 정지 작업 (7), 항우울제 효능 9-11 두 가지 일반적으로 사용되는 선별 검사에 적은 시간 움직이지를 보냅니다. 이 결과는 직접적으로, HCN 채널 함수의 소분자 길항제 HCN 채널 타겟팅 항우울제처럼 행동을 생성하기에 충분할 수있다 TRIP8b HCN과의 상호 작용을 방해 아닌 것을 제안한다. TRIP8b은 두 가지 결합 부위에서 HCN에 결합한다. HCN의주기적인 염기 결합 도메인 (CNBD)는 TRIP8b 12, 13의 TPR 도메인에 TRIP8b있는 N 단말기의 보존 도메인과 상호 작용한다. 이에 관련된 CNBD의 잔류 있지만상호 작용 (14)에 매핑되고, 참여 TRIP8b의 영역은 80 아미노산의 단편을 13 이상으로 좁혀되지 않았다. 두 번째 상호 작용은 TRIP8b의 tetratricopeptide 반복 (TPR) 도메인과 HCN의 C 터미널 트리 펩티드 (HCN1, HCN2 및 HCN4에서 &#39;SNL&#39;,하지만 HCN3에서 &#39;ANM&#39;) 3,12 사이에 발생합니다. 이 C 꼬리 상호 작용의 최근 해결 결정 구조 (15)는도 5 (PEX5) peroxin, 퍼 옥시 솜 오기 수용체 간의 상호 작용과 실질적 구조적 유사성을 계시하고, 그 제 1 형 퍼 옥시 표적 서열 (PTS1) (16)를 포함하는, 파트너 상호 작용. 모두 작용 부위가 HCN 채널 기능이 필요하지만, TRIP8b의 TPR 도메인과 HCN1의 C 단자 트리 펩티드 사이의 상호 작용이 지배적 결합 부위로서 작용하고 HCN 표면 발현을 조절한다. 따라서, 이러한 상호 작용은이 연구에서 타겟팅 사이트로 선택되었다.기준이 TRIP8b HCN과의 상호 작용으로 이루어진다 원고의 나머지를 들어, 언급되는 이러한 상호 작용이다. 이 상호 작용은 그 함유 보존 C 단자 HCN의 C 말단 꼬리 (잔기 TRIP8b의 1A-4의 이성체 241-602)을 3 결합에 필요한 도메인 TPR 대응 TRIP8b 고도로 가용성 단편에 의해 효과적으로 요약된다. 이 상호 작용을 방해 할 수있는 작은 분자를 식별하는 높은 처리량 스크린을 개발하기 위해서는, 형광 편광 (FP)의 분석법을 사용 하였다 (17) 기반. 형광 편광은 편광 방출 된 형광 (18)의 편광도를 측정 형광 표지 된 리간드의 자극에 기초한다. 결합 파트너의 존재 하에서 형광성 리간드의 회전 운동이 제한되며, 편광 (19) 방출된다. 결합 파트너 t가없는그 리간드의 회전 운동은 탈 편광의 발광을 이끈다. 동봉 프로토콜 니켈 니트릴 로트리 아세트산의 니켈 (Ni-NTA) 비드를 사용하여 N 말단 태그 (6xHis) TRIP8b의 정제 (241-602)을위한 방법이 제시된다. 유사한 프로토콜은 프로토콜의 단계 7에서 사용한 글루타치온 S 트랜스퍼 라제 (GST) -tagged HCN1 C 말단 40 개 아미노산 (HCN1 용 C40)를 정제하기 위해 이용 하였다. 공간 고려 사항, 그 절차의 상세한 설명은 생략 하였다. 프로토콜의 7을 통해 2 단계에서, 높은 처리량 검사 작업 흐름 (그림 1 참조) 제공됩니다. 단백질 - 단백질 상호 작용은 높은 처리량 검사에 대한 악명 어려운 목표이며, 독자들은 주제 (20)에 대한 추가 리소스를 추구하는 것이 좋습니다. 2 단계 및 절차의 3 fo를 구축 정제 TRIP8b (241-602)의 체외 친 화성을 특징RA의 형광 이소 티오 시아 네이트 (FITC)의 HCN1 (HCN1 FITC)의 C 말단 테일에 대응 열한 아미노산 펩티드 -tagged. TRIP8b HCN-15 복합체의 결정 구조에 따라이 열한 아미노산 TRIP8b 세그먼트 (241-602)과 결합 생성하기에 충분하다. 2 단계에서, 상호 작용의 K D를 HCN1 FITC의 고정 농도로 (241-602) TRIP8b 적정에 의해 측정된다. 3 단계에서 2 단계에서 사용되는 HCN 펩타이드의 레이블이없는 버전은 FITC 태그가 결합 방해하는 경우 검사 모두 TRIP8b (241-602) 및 HCN1 FITC의 고정 농도로 적정한다. 이러한 실험은 높은 처리량 스크린에 사용 TRIP8b (241-602) 및 HCN1 FITC의 적절한 농도를 선택하는 필수적이다. 높은 처리량 스크린의 전제된다는 십이 생산할 예정 TRIP8b (241-602) 및 HCN1 FITC 사이의 상호 작용을 방해 할 수있는 소분자편광에 rease. 단계 4에서, 분석의 Z 계수 분석은 높은 처리량의 스크리닝 (단계 5)에 적합하도록 TRIP8b (241-602) 및 HCN1 FITC의 소정 농도 (21)를 산출한다. 6, 7 차 높은 처리량 화면에서 식별 된 안타 TRIP8b (241-602) 및 HCN1 FITC 사이가 아닌 비특이적 인 메커니즘을 통해 상호 작용을 방해하여 행동하는 것을 확인하는 검증 분석입니다 단계. 단계 6에서, carboxytetramethylrhodamine (TAMRA)의 HCN1 펩티드 (HCN1 TAMRA)를 FITC 태그를 사용하여 FP 분석법을 손상 형광 화합물 필터링 달리 동일한 형광 편광 검정에 사용되는 표지 된이. 단계 7 큰 HCN1 C 말단 단편 (HCN1 C40)를 이용한 단백질 상호 작용에 의해 서로 가까워 셉터 비드 도너 비드로부터 일 중항 산소의 &quot;터널링&quot;에 기초 비드 기반 근접 분석을 사용 (22).

<table><tbody><tr><td>Ni-NTA 아가로스&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>투석 카세트&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>66456</td><td></td></tr><tr><td>이소프로필 b-D-1-thiogalactopyranoside&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5502 - 1 gr</td><td></td></tr><tr><td>384-웰 블랙 플레이트&nbsp;</td><td>코닝</td><td>3820</td><td></td></tr><tr><td>프록시플레이트&nbsp;</td><td>퍼킨-엘머&nbsp;</td><td></td><td></td>6008289</tr><tr><td>Anti-GST Acceptor 비즈&nbsp;</td><td>퍼킨-엘머&nbsp;</td><td>6760603C</td><td></td></tr><tr><td>NiChelate</td><td>Perkin-Elmer&nbsp;</td><td>AS101D</td><td></td></tr><tr><td>pGS21-a</td><td>Genscript</td><td>SD0121</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10837091001</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>23200</td><td></td></tr><tr><td>단백질 집중 장치</td><td>ThermoFisher</td><td>88527</td><td></td></tr><tr><td>Perkin Elmer Enspire 멀티모드 플레이트 리더</td><td>Perkin-Elmer&nbsp;</td><td>#2300-001M</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) 컴피턴트 셀</td><td>애질런트</td><td>200131</td><td></td></tr></tbody></table>

방법 및 hcn1 trip8b 간의 단백질 - 단백질 상호 작용의 작은 분자 억제제 식별

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

과분극 활성화 주기적 뉴클레오티드 - 게이트 (HCN) 채널들이 신경 세포의 흥분성을 조절하는 기능을 뇌 전체에 보편적으로 표현된다. 해마 영역 CA1의 피라미드 뉴런이 채널의 세포 내 분포는 tetratricopeptide 반복 함유 Rab8b 상호 작용하는 단백질 (TRIP8b), 보조 서브 유닛에 의해 조절된다. HCN의 유전자 녹아웃은 HCN 채널의 기능을 제한하는 주요 우울 장애 (MDD)에 대한 치료로서 유용 할 수 있음을 시사 서브 유닛 또는 TRIP8b, 항우울제 같은 행동의 증가에 모두 리드 기공 형성. 중요한 치료 적 관심에도 불구하고, HCN 채널은 또한 그들이의 리듬을 조절 중심부에 표현된다. 심장 HCN 채널 차단과 관련된 오프 대상 문제를 회피하기 위해, 본 연구실은 최근 특히 뇌 HCN 채널 기능을 방해하기 위하여 HCN과 TRIP8b 사이의 단백질 - 단백질 상호 작용을 표적으로 제안 하였다.여기에 초점이 TRIP8b의 tetratricopeptide 반복 (TPR) 도메인 및 HCN1의 C 터미널 꼬리 사이의 상호 작용에 있지만 TRIP8b는 두 가지 상호 작용 사이트의 서브 유닛을 형성 HCN의 기공에 결합한다. 이 프로토콜 TRIP8b 정제 및 HCN과 TRIP8b 사이의 상호 작용의 소분자 억제제를 식별하는 높은 처리량 스크린을 실행하는 방법의 확장의 설명에서 설명한다. 높은 처리량의 선별 방법은 형광 편광 (FP)는 HCN1 C 말단 테일에 상응하는 산 펩티드 아미노 ㄱ 형광 표지 된 11 개의 큰 TRIP8b 단편의 결합을 모니터링하는 분석 기반 이용한다. 이 방법은 수 &#39;히트&#39;화합물은 출사 광의 편광 변화에 기초하여 식별된다. 유효성 검사 분석은 다음 화합물을 인공적 아닌 &#39;히트&#39;있는지 확인하기 위해 수행된다.

이전 출판과 저작권 문제를 방지하기 위해, TAMRA 태그가 프로브 HCN1 TAMRA는 그림 2와 3을 생성하는 데 사용되었다. 이 대체가 결과에 상당한 차이를하지 않았 음을 참고하고, 프로토콜 HCN1 FITC와 위에서 설명한 것과 동일하다. HCN1 TAMRA, TRIP8b (241-602)과의 상호 작용을 평가하기 위해 2 단계 (그림 2)에 설명 된 프로토콜을 사용하여 HCN1 TAMRA의 고정 농도로 적정 하였다. 다음, 3 단계에서 설명 된 실험을 수행하고, 레이블이없는 HCN1 펩타이드는 TRIP8b (241-602) 및 HCN1 TAMRA (그림 3)의 고정 농도로 적정 하였다. <p class="jove_content" fo:k...

HCN 채널과 보조 서브 유닛 사이의 상호 작용은 주요 우울 장애의 치료 대상으로 확인되었습니다. 여기서,이 단백질 - 단백질 상호 작용의 소분자 억제제를 식별하기위한 형광 편광 - 기반 방법이 제공된다.

방법 및 HCN1 TRIP8b 간의 단백질 - 단백질 상호 작용의 작은 분자 억제제 식별

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

본 절차의 전반적인 목표는 TRIP8b와 HCN 채널 사이의 상호작용을 방해할 수 있는 저분자 화합물을 식별하는 것입니다. 이 방법은 우울증의 새로운 치료제로 개발될 수 있는 후보 분자들을 식별합니다. 이 기술의 주요 장점은 고속 대량 스크리닝 방식으로 수행 가능하다는 점입니다.당사의 연구실에서 TRIP8b의 HCN 결합을 방해하는 것이 치료적 이점이 있을 수 있음을 보여주었기에, 이 기술은 주요 우울 장애의 새로운 치료법 개발에 시사하는 바가 큽니다. 본 방법은 우울증을 염두에 두고 개발되었으나, TRIP8b와 HCN 사이의 상호작용을 방해하는 것은 만성 통증과 같은 다른 질환에서도 치료적 이점이 있을 수 있습니다. Northwestern University의 고처리량 분석 실험실과 같은 개방형 시설에서 기초 및 중개 연구를 진전시키기 위해 자동화된 고처리량 장비를 사용하는 것의 이점을 보여준다는 점에서 이 프로토콜의 시각적 시연은 중요합니다.텍스트 프로토콜에 따라 TRIP8b 241-602 단백질 단편을 정제하고 양성 대조군을 사용하여 단백질-단백질 상호작용을 확인한 후, TRIP8b와 HCN1-FITC 분注액을 해동하여 얼음 위에 보관하십시오. FP Buffer를 사용하여 2 $\mu\text{M}$ TRIP8b와 50 $\text{nM}$ HCN1-FITC 혼합액 20 $\text{mL}$를 준비하십시오. 그런 다음, 이 혼합액 25 $\mu\text{L}$를 저결합 384-웰 블랙 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 분주하십시오.라이브러리 스크리닝을 위해, 음향 액체 핸들러를 사용하여 3번부터 22번 컬럼의 각 웰에 화합물 100 nanoliters를 분주하여 최종 농도가 40 micromoles가 되도록 합니다. 음성 대조군으로 1번과 23번 컬럼의 각 웰에 DMSO 100 nanoliters를 분주합니다. 양성 대조군으로 2번과 24번 컬럼의 각 웰에 표지되지 않은 HCN1 펩타이드 100 nanoliters를 분주하여 최종 농도가 10 micromoles가 되도록 합니다.플레이트를 상온에서 2시간 동안 배양합니다. 플레이트 리더를 사용하여 형광 편광을 측정합니다. 또는 측정 전 4 °C에서 16시간 동안 플레이트를 보관할 수 있습니다.다음 식을 사용하여 억제율(%)을 계산하십시오. 여기서 XN은 신호 X에 해당하는 정규화된 억제율(%)이며, X positive는 양성 대조군 웰의 평균 신호, X negative는 음성 대조군 웰의 평균 신호입니다. 억제율이 50% 이상인 Hit를 검증하기 위해, FP buffer 내에서 2 µM TRIP8b와 50 nM HCN1 TAMRA를 포함하는 20 mL의 마스터 믹스를 준비하십시오. 검은색 384웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 마스터 믹스 25 µL를 분주하십시오.그 후, 각 활성 화합물이 2배 연속 희석되어 포함된 플레이트에서 화합물 100 nanoliters를 각 웰에 첨가합니다. 음성 대조군 웰에는 DMSO 100 nanoliters를 첨가합니다. 양성 대조군의 경우, 최종 농도가 200 micromoles에서 0.1 micromoles 범위가 되도록 연속 희석한 무표지 HCN1 펩타이드 100 nanoliters를 첨가합니다.플레이트를 상온에서 2시간 동안 또는 4 °C에서 16시간 동안 배양합니다. 플레이트 리더를 사용하여 형광 편광을 측정합니다. 4-매개변수 비선형 회귀 모델을 사용하여 각 화합물의 농도 의존적 FP 데이터를 피팅함으로써 IC50 값을 계산합니다.HIS 태그가 붙은 TRIP8b와 GST 태그가 붙은 HCN1 융합 단백질 각각 한 알리쿼트를 해동하여 얼음 위에 둡니다. 테스트할 화합물당 200 nM의 HIS TRIP8b와 20 nM의 GST-HCN1C40을 어세이 버퍼로 준비하여 1 mL씩 만듭니다. 16채널 피펫을 사용하여 HIS-TRIP8b와 GST-HCN1C40 혼합물 7 µL를 A행부터 N행까지 각 행의 웰 3개에 첨가하여 각 화합물을 3반복으로 테스트합니다.플레이트를 짧게 원심분리하여 액체가 각 웰의 바닥에 위치하도록 하고 기포를 제거합니다. 다음으로, 테스트할 Hit 화합물을 플레이트에 분주하여 A행은 200 micromoles, L행은 0.1 micromoles의 최종 농도가 되도록 합니다. M행에는 동일한 부피의 DMSO를 첨가합니다. 그다음, 표지되지 않은 HCN1 펩타이드를 N행에 최종 농도 10 micromoles가 되도록 분주합니다. 플레이트를 2분 동안 흔들어 섞은 후 실온에서 2.5시간 동안 배양합니다. 어세이 버퍼를 사용하여 Anti-GST acceptor beads를 1:50으로 희석합니다.16채널 피펫을 사용하여 희석된 acceptor bead 3.5 µL를 플레이트의 각 웰에 넣고, 기포가 생기지 않도록 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 플레이트를 실온의 암소에서 1시간 동안 배양합니다. 혼합물이 빛에 노출되지 않도록 주의하면서 Nickel Chelate donor bead를 assay buffer로 1:50 비율로 희석합니다.희석된 공여체 비드 3.5 µL를 플레이트의 각 웰에 넣고 기포가 생기지 않도록 조심스럽게 섞습니다. 플레이트를 밀봉하고 실온의 암소에서 1.5시간 동안 배양합니다. 그 다음, 여기에 나열된 측정 파라미터를 사용하여 플레이트 리더로 플레이트를 판독합니다.마지막으로, 4개 매개변수 비선형 회귀 모델을 사용하여 각 화합물의 데이터를 피팅함으로써 IC50 값을 계산합니다. HCN1 TAMRA와의 상호작용을 평가하기 위해, 고정된 농도의 HCN1 TAMRA에 TRIP8b를 적정했습니다. 이 그래프는 TRIP8b의 농도가 증가함에 따라 더 많은 HCN1 TAMRA 분자가 결합되어 편광도가 증가함을 보여줍니다.본 실험에서는 비표지 HCN1을 일정 농도의 TRIP8b 및 HCN1 TAMRA에 적정함에 따라, 표지된 펩타이드가 치환되어 신호가 감소하였습니다. 고처리량 스크리닝을 통해 각 화합물의 저해율(%)을 그래프 상의 단일 점으로 나타내었습니다. 이 스크리닝 결과는 양성 및 음성 대조군과 함께, 두 번의 분석 과정에서 측정된 각 화합물의 평균 저해율(%)로 도식화되었습니다.50% 이상의 억제능을 보이는 화합물들을 본 실험에서 검증하였습니다. X 및 Y 좌표는 두 차례의 분석에서 나타난 억제 백분율에 의해 결정되었습니다. 본 실험에서 HCN1C40은 수용체 비드에 결합하는 C-말단 GST 태그를 포함하고 있습니다.TRIP8b의 TPR 도메인과 HCN1의 C 말단 트리펩타이드의 상호작용은 680 nm 파장의 빛으로 공여체 비드를 들뜨게 하여 일항 산소를 생성합니다. 최종적으로, 이 그래프에 나타난 바와 같이, TRIP8b와 HCN1C40의 일정 농도에 히트 화합물 NUCC-5953의 농도를 점진적으로 높여 적정했을 때 TRIP8b와 HCN1의 상호작용 억제가 증가했습니다. 고속 스크리닝을 시작하기 전에 단백질 조제 및 비드 기반 근접 분석법의 형광 편광을 검증하십시오.단백질의 순도가 높은지 확인하십시오. 여러 번의 냉동-해동 반복을 피하기 위해 단백질을 소분하십시오. 신선한 DMSO와 Triton을 포함하여 고품질의 시약을 사용하는 것이 중요합니다.DMSO를 사용할 때는 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 적절한 개인 보호 장비를 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 합니다. 이 절차 이후에는 히트 화합물이 세포 내에서 활성을 나타내는지 확인하기 위해 전기생리학 및 유세포 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 형광 편광 기반 분석법을 이용한 고속 스크리닝 수행 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

탠덤 친화 정화 단백질 바인딩 파트너의 식별을위한 강력한 접근이다. 개념 증명으로서,이 방법론은 숙주 세포의 요인 번역 개시에 관여 공동 침전물에 잘 특성화 번역 개시 인자의 eIF4E에 적용되었다. 이 방법은 쉽게 다른 세포 또는 바이러스성 단백질에 적응하고 있습니다.

탠덤 동질 정제를 사용하여 단백질 나누기 파트너의 식별

우리는 TRUE와 FALSE 단백질 단백질 상호 작용을 구별하기 이전에 도입 된 QUICK (최저과 결합하여 정량 Immunoprecipitation) 접근 방식의 변화를 제시한다. 우리 접근 방식은...

을 바탕으로 단백질 - 단백질 상호 작용의 확인에 프로토콜<sup&gt; 15</sup&gt; N 신진 대사 라벨링, Immunoprecipitation, 수량 질량 분석법 및 선호도 변조

초파리는하지만 깊이있는 생화학 적 분석의 적합성에 대한, 강력한 유전자 조작으로 유명합니다. 여기에서 우리는 파리의 뇌에서 관심의 단백질의 상호 작용 파트너를 식별 할 수있는 TAP 기반의 절차를 제시한다. 이 절차는 잠재적으로 연구의 새로운 길을 초래할 수 있습니다.

단백질 - 단백질 상호 작용을 확인<em&gt; 초파리</em탠덤 선호도 정화로&gt; 성인 머리 (TAP)

펩타이드 어레이 스크리닝은 단백질-단백질 상호 작용 부위를 식별하기 위한 고처리량 분석법입니다. 이를 통해 표적 단백질의 여러 상호 작용을 매핑할 수 있으며 단백질을 표적으로 하는 억제제의 부위를 식별하는 방법으로 사용할 수 있습니다. 여기에서는 펩타이드 어레이를 스크리닝하고 분석하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

펩타이드 배열을 사용하여 단백질 - 단백질 상호 작용 사이트를 확인

단백질은 서로 상호 작용하며 이러한 상호 작용은 단백질의 기능을 대부분 결정합니다. 단백질 상호 작용 파트너는 디하이드로폴레이트 환원효소 단백질-단편 보완 분석법(DHFR-PCA)을 기반으로 하는 효모 적합성 분석을 사용하여 생체 내에서 고처리량으로 식별할 수 있습니다.

살아있는 세포의 단백질 조각 보완 분석 (PCA)에 의해 게놈 전체 단백질 - 단백질 상호 작용 상영

단백질-단백질 상호작용을 표적으로 하기 위한 REPLACE 전략의 구현을 설명합니다. REPLACE는 최적화된 펩티드 억제제를 약물과 같은 분자로 전환하기 위한 합성 및 컴퓨터 접근 방식을 포함하는 반복 전략입니다.

를 통해 교체 단백질 - 단백질 상호 작용의 억제제의 개발 : 설계 및 개발 비 ATP 경쟁 CDK 억제제에 응용

우리는 LC-MS / MS 시스템을 사용 coregulatory 상호 작용 단백질의 정제 방법을 확립 하였다.

LC-MS / MS 분석을 이용하여 핵 공동 인자와 상호 작용 단백질의 높은 처리량 식별 단백질 제조 방법

이 프로토콜은 이노 시 톨 인산 염 또는 인산 염에 바인딩하는 단백질의 식별에 초점을 맞추고. 그것은 아가로스 또는 자기 구슬에 streptavidin을 통해 고정되는 생물이노시톨 인산염 또는 인산화물과 친화성 크로마토그래피를 사용합니다. 이노시톨 인산염 또는 인산화결합 단백질은 서양 블로팅 또는 질량 분석법에 의해 확인된다.

이노시톨 인산염 또는 인산성교단백질의 동정은 서부 블롯 또는 질량분광법에 결합된 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질

이 연구는 약물 펩티드 상호 작용을 식별하기위한 전략을 제시하는 것을 목표로했다. 이 전략은 석영 결정 마이크로 밸런스 (QCM) 바이오 센서에 기초한 약물 인식 짧은 펩타이드의 바이오 패닝을 포함하고, 단백질에 대한 약물 인식 및 약물 결합 부위의 음장 에 대해 얻은 정보를 정량적으로 평가하기위한 생물 정보학 분석이 뒤따릅니다.

약물 단백질 상호 작용의 글로벌 검증을 위한 바이오센서 기반 고처리량 바이오패닝 및 생물정보학 분석 전략

이 프로토콜은 GST 융합 TPR 모티프 공동 샤페론과 Hsp90 유래 펩타이드와 결합 된 수용자 구슬과 글루타티온 연결된 기증자 구슬을 사용하여 단백질 단백질 상호 작용을 조사하는 기술을 제시합니다. 우리는 Hsp90-FKBP51 또는 Hsp90-FKBP52 상호 작용을 중단하기 위하여 작은 분자를 스크린하기 위하여 이 기술을 사용하고 강력하고 선택적인 Hsp90-FKBP51 상호 작용 억제제를 확인했습니다.

동질적인 구드 기반 분석체를 사용하여 샤페론 - 코카페론 상호 작용의 연구

여기에 사용된 실험은 소분자와 단백질 표적 간의 상호 작용을 예측하고 검증하기 위해 세포 열 이동 분석과 결합된 분자 도킹 방법을 보여줍니다.

Protein Target Prediction and Validation of Small Molecule Compound(단백질 표적 예측 및 저분자 화합물의 검증)

배우세요 형광 편광 기반 고처리량 스크리닝을 통해 TRIP8b와 HCN 채널 간 상호작용을 억제하는 소분자를 식별하는 방법입니다. 이 기술은 주요 우울증 및 만성 통증 치료제 개발에 활용될 수 있습니다.

방법 및 HCN1 TRIP8b 간의 단백질 - 단백질 상호 작용의 작은 분자 억제제 식별

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