LC-MS / MS 분석을 이용하여 핵 공동 인자와 상호 작용 단백질의 높은 처리량 식별 단백질 제조 방법

이 절차의 전반적인 목표는 LC-MS/MS 분석을 사용하여 핵 보조인자와 상호 작용하는 단백질을 식별하는 것입니다. 이 방법은 유전자 조절 분야의 전사 메커니즘과 관련된 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 핵 보조 인자와 상호 작용하는 단백질을 식별할 수 있다는 것입니다.

또한, 이 방법을 통해 표적 핵 인자의 전사 조절 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있습니다. 형질주입 36시간 후 세포 시트를 얼음처럼 차가운 PBS로 세척하고 세포 스크레이퍼로 세포를 수집하여 신호 태그가 지정된 ARIP4를 발현하는 HEK 293 세포를 수확합니다. 세포를 1.5ml 튜브에 옮긴 다음 8000g에서 섭씨 4도에서 2분 동안 원심분리합니다.

상등액을 흡인하고 High Salt Buffer의 펠릿 부피의 5배로 세포 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 혼합물을 섭씨 4도에서 20분 동안 회전시킵니다. 20분 회전 후 17, 700g에서 튜브를 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다.

다음으로, 상등액을 새로운 2ml 튜브로 옮기고 상등액 부피의 3배에 희석 완충액을 추가합니다. 또 다른 cetrifugation을 수행한 다음 상층액을 새로운 2ml 튜브로 옮깁니다. 10분 동안 원심분리하는 동안 PBS로 50마이크로리터의 플래그 방지 비드를 세척합니다.

그런 다음 섭씨 4도에서 1분 동안 2000g에서 튜브를 원심분리하십시오. 상층액을 제거하고 먼저 1몰 글리신 염산염으로 세척 단계를 반복한 다음 1몰 트리스 염산염으로 세척 단계를 반복합니다. 그런 다음 저염 버퍼로 두 번 씻으십시오.

다음으로, 세척된 비드 50마이크로리터를 전체 세포 추출물과 혼합합니다. 혼합물을 섭씨 2-4도에서 4시간 동안 부드럽게 회전시킵니다. 그런 다음 뭉툭한 팁을 사용하여 샘플을 마이크로 스핀 컬럼으로 옮기고 용액이 1.5ml 튜브로 떨어지도록 합니다.

액체 질소로 흐름을 스냅 동결하고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 다음으로, 저염 버퍼로 플래그 비드를 5회 세척합니다. 용리하려면 컬럼을 1.5ml 튜브에 넣고 2000g에서 1분 동안 원심분리하여 비드를 건조시킵니다.

컬럼 바닥을 덮은 다음 50마이크로리터의 1몰 글리신 염산염을 추가합니다. 혼합물을 실온에서 10분 동안 부드럽게 흔듭니다. 10분 후 컬럼을 새 1.5ml 튜브에 넣고 2000g에서 1분 동안 원심분리합니다.

용출된 용액을 10마이크로리터의 1몰 트리스 하이드로클로라이드로 중화하고 피펫팅과 볼텍싱으로 잘 혼합합니다. 50 마이크로 리터의 100 밀리 몰 중탄산 암모늄을 첨가하십시오. 10 마이크로 리터의 아세토 니트릴, 2 마이크로 리터의 디티 오 트레이톨 및 50 마이크로 리터의 중화 된 샘플.

섭씨 56도에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후 샘플을 실온에서 10분 동안 그대로 둡니다. 그런 다음 샘플에 333 밀리몰 요오드 아세트 아미드 10 마이크로 리터를 추가하고 37 °C에서 30 분 동안 어둠 속에서 배양하고 10 마이크로 리터의 트립신을 혼합물에 추가하고 섭씨 37 도에서 밤새 배양합니다.

다음 날, 분석을 위해 최종 제품을 LC-MS/MS 시설 또는 타사 질량 분석 실험실로 운송합니다. 이 이미지는 flag 특이적 항체를 이용한 면역 침전 후 HEK 293 세포에서 발현된 flag epitope tagged ARIP4의 silver staining을 보여주며, 전기영동에 의한 분리를 보여줍니다. 대조군으로, 외인성 단백질을 발현하지 않는 HEK 293 세포에 대해 모의 정제를 수행했습니다.

우리의 방법을 사용하면 관심 있는 전사 인자를 통해 추정되는 핵 보조 인자를 식별하고 전사 조절 메커니즘에 대한 이해를 더욱 향상시킬 수 있습니다.