Name: LC-MS / MS 분석을 이용하여 핵 공동 인자와 상호 작용 단백질의 높은 처리량 식별 단백질 제조 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: 배우세요 LC-MS/MS 분석을 이용하여 핵 공동 인자와 상호 작용하는 단백질을 식별하는 고처리량 방법을. HEK 293 세포에서 면역침전 후 질량 분석으로 전사 조절 메커니즘을 규명할 수 있습니다.

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이 연구는 Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders(HT), Takeda Science Foundation(HT) 및 Japan Society for the Funds-in-Aid for Young Scientists(B)의 지원을 받았습니다.

1. 형질 <ol><li> 100 mm 배양 판 (2 × 106 세포 / 접시)에 HEK293 세포 종자. 배양 10 % 소 태아 혈청, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신, 100 유닛 / ㎖의 페니실린으로 보충 된 둘 베코 변형 이글 배지에서 세포. 5 % CO 2 및 37 ℃로 가습 된 배양기에서 세포를 인큐베이션. </li><li> 다음 날, FLAG-태그 ARIP4 플라스미드의 10 μg의 제조업체의 방향 (11)에 따라 형질 전환 시약의 40 μl를 이용하여 세포를 형질. </li></ol> 2. 단백질 추출 <ol><li> 약 트랜 스펙 션 후 36 시간이 빙냉 PBS로 세포를 세척하고 스크레이퍼를 사용하여 세포를 수확. 1.5 mltube에 세포를 전송하고 4 ℃에서 2 분 동안 8,000 XG에 그것을 원심 분리기. 대기음 뜨는 배에서 세포 펠렛을 재현 탁 0.4 M KCl을 버퍼의 펠릿 볼륨 (높은 염 완충액 : 20 mM 트리스 -HCl (pH 8.0), 0.4 M KCl을5 밀리미터의 MgCl 2, 10 % 글리세롤, 0.1 % NP-40, 10 밀리미터 B-mercaptethanol, 1X 프로테아제 억제제 칵테일). 4 ℃에서 20 분 동안 혼합물을 돌립니다. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 17,700 XG에서 튜브를 원심 분리기. </li><li> (새로운 2 ㎖의 튜브에 상청 (전체 세포 추출물)을 전송하고 0 M KCl을 버퍼의 초기 부피 3 배 추가 희석 완충액 : 20 mM 트리스 -HCl (pH 8.0), 5 밀리미터의 MgCl 2, 10 % 글리세롤, 0.1 % NP-40, 10 밀리미터 β 머 캅토 에탄올, 1X 프로테아제 억제제 칵테일). </li><li> 다른 원심 분리 (4 ℃에서 10 분 동안 17,700 XG)을 수행하고, 새로운 2 ML 튜브에 뜨는 (전체 세포 추출물)를 전송합니다. </li></ol> 3. 면역 침전 <ol><li> 20 mM의 트리스 : 원심 분리 (2.4) 중, (0.1M KCl을 완충액으로 두번 저염 완충액을 세척 한 다음 PBS로 안티 FLAG 비드 50 ㎕의 0.1 M 글리신 - 염산하고 1 M 트리스 - 히드로 클로라이드를 씻어 염산 (PH 8.0), 0.1 M의 KCl, 5 mM의 MgCl2를, 10 % 글리세롤, 0.1 % NP-40, 10mM (B) 머 캅토 에탄올, 1X 프로테아제 억제제 칵테일). 이 세척 공정의 원심 분리는 39 ° C에서 1 분 동안 2,000 × g으로 수행된다. </li><li> 전체 세포 추출물 FLAG 비드의 50 μL를 혼합하고 가볍게 2-4 ℃로한다 (단계 2.4의 전체 세포 추출물의 1 %는 또한 나중에 사용하기 위해 -80 ℃에서 보관한다에서 4 시간 동안 혼합물을 회전 ) 입력으로. </li><li> 마이크로 스핀 열 (중력 드롭)에 샘플을 전송합니다. (입력 및 관류 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 양자의 단백질 수준을 확인), 1.5 ㎖의 튜브에 관류 유지 액체 질소를 사용하여 동결하고, -80 ℃에서 보관. </li><li> 국기 비즈 (중력 드롭)을 씻어 0.1 M KCl을 버퍼 (낮은 소금 버퍼)의 1 ML을 추가합니다. </li><li> 3.4 적어도 네 번 이상 (오 세척의 총) 단계를 반복합니다. </li></ol> 4. 용출 <ol><li> 1.5 ML 튜브에 열을 놓고 1 분 동안 2,000 XG에이를 원심 분리; 구슬 건조됩니다. </li><li> 하단 캡열. </li><li> 0.1 M 글리신 - 염산 (PH 2.5)의 (FLAG 구슬의 부피와 동일) 50 μl를 추가합니다. </li><li> 부드럽게 실온에서 10 분 동안 혼합물을 흔들어. </li><li> 새로운 1.5 ML 튜브에 열을 놓고 1 분 동안 2,000 XG에 그것을 원심 분리기. </li><li> 용출액을 1 M Tris-HCl (pH8.0)을 10 ㎕의 중화; 피펫 또는 와류 장치를 이용하여 잘 혼합한다. </li></ol> 5. 알킬화 및 트립신 <ol><li> 100 mM의 NH 4 HCO 3, CH 3 CN 10 μL, 혼합물에 디티 오 트레이 톨의 2 μL (112 μl의 총 부피)의 50 μl를 추가합니다. </li><li> 56 ° C에서 30 분 동안 샘플을 인큐베이션. </li><li> 실온에서 10 분 동안 샘플을 놓는다. </li><li> 요오도 아세트 아미드 시료에 333 mm의 10 μl를 첨가하고 37 ℃에서 30 분 동안 어두운 데에서 부화. </li><li> 혼합물에 트립신의 10 μL (33 NG / μL)을 추가하고 37 ° C에서 하룻밤을 품어. </li></ol><ol><li> 밤새 트립신 처리 후, LC-MS / MS 시설이나 분석 12 타사 질량 분석 실험실로 최종 제품을 수송. </li></ol>

<ol><li>De Las Rivas, J., Fontanillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions+essentials%3A+key+concepts+to+building+and+analyzing+interactome+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.Biol%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks.</a> PLoS Comput.Biol. 6 (6), e1000807(2010).</li>
<li>Westermarck, J., Ivaska, J., Corthals, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protein+interactions+involved+in+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell.Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of protein interactions involved in cellular signaling.</a> Mol.Cell.Proteomics. 12 (7), 1752-1763 (2013).</li>
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<li>Qin, K., Dong, C., Wu, G., Lambert, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactive-state+preassembly+of+G%28q%29-coupled+receptors+and+G%28q%29+heterotrimers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Chem.Biol%22%5BJournal%5D)">Inactive-state preassembly of G(q)-coupled receptors and G(q) heterotrimers.</a> Nat.Chem.Biol. 7 (10), 740-747 (2011).</li>
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<li>Fonslow, B. R., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+electrophoresis+applied+to+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.Sep.Sci%22%5BJournal%5D)">Capillary electrophoresis applied to proteomic analysis.</a> J.Sep.Sci. 32 (8), 1175-1188 (2009).</li>
</ol>

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효율적인 형질 감염 프로토콜이 성공적인 결과를 얻는 것이 필수적이다. 따라서, 우리는 면역 FLAG 태그가 단백질 수준을 결정하는 웨스턴 블롯 분석을 사용하는 것이 좋습니다. 이 단계는 IP가 성공적으로 수행되었는지, 그들의 관심 단백질이 제대로 또한, 과발현되어 있는지 확인하려면 사용자 수 있습니다. FLAG 태그가 단백질 수준은 질량 분광 분석에 앞서 확인하여야한다. 모의 샘플 위양성 결과를 얻는 피하고 진정한 상호 작용 배경을 판별하는 음성 대조군으로 사용한다. 인간 단백질을 연구 할 때 또한, 실험은 오염을 방지하기 위해, 비교적 깨끗한 환경 (예를 들면, 클린 룸)에서 수행되어야한다. 높은 염 농도 (0.3-0.4 M)으로 단백질을 추출 버퍼 때때로 핵 단백질을 추출하기 위해 사용될 수 있지만하는 0.1 ~ 0.15 M 염 농도와 IP 버퍼가 대부분이며열 좋습니다. 이 IP 절차는 단백질 - 단백질 상호 작용을 방해하지 않고 진행 할 수 있습니다. 상...

단백질 - 단백질 상호 작용은 다양한 생물학적 기능에 중요한 역할을한다. 따라서, 이러한 상호 작용은 신호 전달에 연루되어왔다 세포막 단백질 수송; 세포의 신진 대사; 및 DNA 복제, DNA 손상 복구, 재조합 및 전사 1, 2, 3, 4 등 여러 핵 프로세스. 이러한 상호 작용에 관여하는 단백질을 확인하는 것은이 세포 과정에 대한 우리의 이해를 증진하는 것이 중요하다. 면역 침전 (IP)는 단백질 - 단백질 상호 작용을 분석하는데 사용되는 검증 된 기술이다. 공동 - 면역 침전 된 단백질의 동정을 용이하게하기 위하여, 질량 분석계는 종종 이용 5, 6, 7, 8,9. 항체와 단백질 복합체의 공지 부재 타겟팅함으로써, 단백질 복합체를 분리하고,이어서 질량 분광 분석을 통해 그 미지의 컴포넌트를 식별 할 수있다. ARIP4 (안드로겐 수용체 상호 작용하는 단백질 4), 전사 coregulator은 활성화 또는 상황에 의존적으로 9, 10 년 대상 발기인을 억제하기 위해 핵 수용체 단백질과 상호 작용한다. 더 이러한 핵 인자를 지배하는 전사 조절 메커니즘을 이해하기 위해 정화하고, LC-MS / MS 시스템을 사용하여 ARIP4 상호 작용 단백질을 확인하는 포괄적 인 방법을 설명한다.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine 2000 형질주입 시약</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일(EDTA 무료)(100x)</td><td>nacalai tesque</td><td>03969-21</td><td></td></tr><tr><td>ANTI-FLAG M2 친화력 젤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bio-Spin 컬럼</td><td>BIO-RAD</td><td>732-6204</td><td></td></tr></tbody></table>

lc-ms / ms 분석을 이용하여 핵 공동 인자와 상호 작용 단백질의 높은 처리량 식별 단백질 제조 방법

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

전사 공동조절인자는 핵 염색질 구조의 효율적인 전사 조절에 필수적입니다. Coregulator는 전사를 조절하는 데 다양한 역할을 합니다. 여기에는 전사 인자(transcription factor)와의 직접적인 상호 작용, 히스톤 및 기타 단백질의 공유 변형(covalent modification), 그리고 때때로 발생하는 염색질 형태 변형(chromatin conformation alteration)이 포함됩니다. 따라서 이 네트워크 내에서 상호 작용하는 단백질을 식별하기 위한 비교적 빠른 방법을 확립하는 것은 기본 조절 메커니즘에 대한 이해를 높이는 데 중요합니다. LC-MS/MS 매개 단백질 결합 파트너 식별은 단백질-단백질 상호 작용을 분석하는 데 사용되는 검증된 기술입니다. 이전에 확인된 단백질 복합체의 구성원을 항체(때로는 태그가 지정된 단백질에 대한 항체와 함께)로 면역침전시킴으로써, 질량 분석 분석을 통해 알려지지 않은 단백질 상호 작용을 식별할 수 있습니다. 여기에서는 핵 보조인자 및 결합 파트너를 포함하는 단백질 상호 작용의 LC-MS/MS 매개 고처리량 식별을 위한 단백질 준비 방법을 제시합니다. 이 방법을 사용하면 표적 핵 인자의 전사 조절 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있습니다.

우리는 강한 신호 ARIP4 약 160 KDa의뿐 모의 샘플 제어 및 몇몇 다른 미지의 단백질의 것과 (도 1)을 확인 하였다. LC-MS / MS 분석은 펩티드 복합체 ARIP4 FLAG 비드 (표 1)의 분획 내의 잠재적 인 펩티드 공동 인자를 모두 식별. P62 (Sequestosome1)는 공지 ARIP4 공동 인자 (11)는이 시스템 (11)의 유효성을 확인하는 분석 (표 1)에서 확인되었다. 우리는 또한 ARIP4와 상호 작용하는 많은 다른 이전에보고 된 단백질을 확인했다. 이러한 방식으로, Sumo2 10 DryK (13)는 LC-MS / MS 분석을 통해 검출 하였다. ARIP4 펩티드는 또한 I...

우리는 LC-MS / MS 시스템을 사용 coregulatory 상호 작용 단백질의 정제 방법을 확립 하였다.

LC-MS / MS 분석을 이용하여 핵 공동 인자와 상호 작용 단백질의 높은 처리량 식별 단백질 제조 방법

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

이 실험 과정의 전체적인 목표는 LC-MS/MS 분석을 통해 핵 보조인자(Nuclear Cofactor)와 상호작용하는 단백질을 식별하는 것입니다. 이 방법은 유전자 조절 분야의 전사 기전과 관련된 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 핵 보조인자와 상호작용하는 단백질들을 식별할 수 있다는 점입니다.또한, 이 방법은 표적 핵 인자의 전사 조절 기전을 더 잘 이해할 수 있게 해줍니다. flag-tag가 부착된 ARIP4를 발현하는 HEK 293 세포를 transfection 36시간 후에, 얼음처럼 차가운 PBS로 세포 시트를 세척하고 cell scrapper로 세포를 수집하여 회수합니다. 수집한 세포를 1.5 milliliter 튜브로 옮긴 후 4°C에서 8000g로 2분 동안 원심분리합니다.상층액을 흡입하여 제거하고, 세포 펠릿 부피의 5배에 해당하는 High Salt Buffer로 펠릿을 재부유합니다. 혼합물을 4°C에서 20분 동안 회전시킵니다. 20분간 회전시킨 후, 튜브를 4°C에서 17,700g로 10분 동안 원심분리합니다.다음으로, 상층액을 새로운 2 mL 튜브로 옮기고 상층액 부피의 3배에 해당하는 희석 완충액(Dilution buffer)을 추가합니다. 다시 한번 원심분리를 수행한 후 상층액을 새로운 2 mL 튜브로 옮깁니다. 10분 동안 원심분리를 하는 동안 50 µL의 anti-flag 비드를 PBS로 세척합니다.그 후 튜브를 4°C에서 2000g로 1분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고, 먼저 1 M glycine hydrochloride로, 그다음 1 M tris hydrochloride로 세척 단계를 반복합니다. 이어서 Low salt buffer로 2회 세척합니다.다음으로, 세척된 비드 50 µL를 전세포 추출물과 혼합합니다. 혼합물을 2~4 °C에서 4시간 동안 천천히 회전시킵니다. 그런 다음 끝이 뭉툭한 팁을 사용하여 샘플을 마이크로 스핀 컬럼으로 옮기고, 용액이 1.5 mL 튜브로 떨어지도록 합니다.유출액을 액체 질소로 급속 냉동한 후 -80°C에서 보관하십시오. 다음으로, flag 비즈를 Low salt buffer로 5회 세척합니다. 용출을 위해 컬럼을 1.5 mL 튜브에 넣고 2000g에서 1분간 원심분리하여 비즈를 건조시킵니다.컬럼의 하단을 캡으로 닫은 다음 1 M glycine hydrochloride 50 µL를 첨가합니다. 실온에서 10분 동안 혼합물을 부드럽게 흔들어 섞어줍니다. 10분 후, 컬럼을 새로운 1.5 mL 튜브에 넣고 2000g에서 1분 동안 원심분리합니다.1 M tris hydrochloride 10 µL를 사용하여 용출액을 중화하고, 피펫팅과 볼텍싱으로 잘 섞습니다. 100 mM 탄산수소암모늄 50 µL를 추가합니다. 아세토니트릴 10 µL, dithiothreitol 2 µL, 그리고 중화된 시료 50 µL를 넣습니다.56 °C에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후, 시료를 실온에서 10분 동안 방치합니다. 그런 다음 333 mM iodoacetamide 10 µL를 시료에 첨가하고 37 °C의 암소에서 30분 동안 배양합니다. 혼합물에 trypsin 10 µL를 첨가하고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, 최종 생성물을 LC-MS/MS 시설이나 외부 질량 분석 실험실로 운송하여 분석하십시오. 이 이미지는 flag 특이적 항체로 면역 침강시키고 전기 영동으로 분리한 후, HEK 293 세포에서 발현된 flag 에피토프 태그 ARIP4를 은 염색한 결과입니다. 대조군으로서, 외래 단백질을 발현하지 않는 HEK 293 세포를 사용하여 모의 정제를 수행하였습니다.본 방법을 사용하여 관심 있는 전사 인자를 통해 추정 핵 보조 인자를 식별할 수 있으며, 이를 통해 전사 조절 메커니즘에 대한 이해를 더욱 높일 수 있습니다.

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우리는 TRUE와 FALSE 단백질 단백질 상호 작용을 구별하기 이전에 도입 된 QUICK (최저과 결합하여 정량 Immunoprecipitation) 접근 방식의 변화를 제시한다. 우리 접근 방식은...

을 바탕으로 단백질 - 단백질 상호 작용의 확인에 프로토콜<sup&gt; 15</sup&gt; N 신진 대사 라벨링, Immunoprecipitation, 수량 질량 분석법 및 선호도 변조

이 비디오는 단백질-단백질 상호 작용 분석을 위한 PVDF 멤브레인의 공동 면역침전된 단백질 복합체를 보여줍니다. 복합체에서 감소된 단백질을 트립신으로 처리하여 더 작은 펩티드에서 개별 단백질을 절단한 다음 나머지 펩티드를 PVDF 막에서 추출했습니다. 그런 다음 복합체의 두 단백질에서 유래된 끌어낸 펩타이드를 건조시키고 추가 분석을 위해 저농도의 포름산에 재현탁시켰습니다.

상호 작용 연구를 위한 공동 면역침전된 단백질을 준비하기 위한 막상 단백질 분해

단백질 상호 작용 : SILAC의 면역 실험은 새로운 단백질을 발견하기위한 강력한 수단을 나타냅니다. 있도록하여 제어 및 시험 샘플, 진정한 상호 작용 모두에서 단백질 풍부 정확한 상대적 정량화 간단 실험 오염물 구별 될 수 있고, 선호도가 낮은 상호 작용은 덜 엄격한 버퍼 조건의 사용을 통해 유지.

SILAC - 면역 정량 프로테오믹스를 사용하여 포유 동물 세포에있는 단백질 상호 작용 파트너의 식별

단백질-단백질 상호 작용은 세포의 핵과 세포질 모두에서 발생할 수 있습니다. 이러한 상호 작용을 조사하기 위해 기존의 동시 면역침전과 현대의 근접 결찰 분석법이 적용됩니다. 이 연구에서는 이 두 가지 방법을 비교하여 핵과 세포질에서 NF90-RBM3 상호 작용의 분포를 시각화합니다.

공동 면역 침전에 의한 핵 및 세포질 분수에서 단백질 - 단백질 상호 작용의 시각화 및<em&gt; 현장에서</em&gt; 근접 내고 분석

여기에서 우리는 라벨 무료 양적 질량 분석을 사용하여 단백질 상관 프로파일 다음에 친 화성이 단백질 복합체의 정화 및 파란색 기본 페이지에서 자신의 분리를위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 서로 다른 단백질 복합체에 상호 작용 체를 해결하는 데 유용합니다.

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

여기에서는 질량 분석용 시료 를 제조하기 위한 온막 소화 기법을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 단백질-단백질 상호 작용의 편리한 분석을 용이하.

온-막 소화 기술을 사용한 단백질-단백질 상호 작용의 평가

기재된 단백질 은 관심 있는 주어진 단백질및 무표지 질량 분석법의 면역친화성 농축을 사용하여 핵 세포 분획으로부터 단백질 상호작용 파트너를 식별하기 위한 프로테오믹스 워크플로우이다. 워크플로우에는 세포외 분획, 면역 침전, 필터 보조 시료 준비, 오프라인 정리, 질량 분석 법 및 다운스트림 생물 정보학 파이프라인이 포함됩니다.

대규모 핵 상호 작용 프로파일링을 위한 라벨 없는 면역 침전 질량 분광 워크플로우

여기서 설명된 것은 니코티아나 벤타미아나 잎 조직에서 NLR 면역 수용체의 TIR 도메인의 상호작용 파트너의 식별을 위한 근접 라벨링 방법이다. 또한 니코티아나 및 다른 식물 종에서 이 기술을 사용하여 관심 있는 다른 단백질 간의 상호 작용을 식별하기 위한 상세한 프로토콜이 제공된다.

단백질-단백질 상호 작용 네트워크의 질라 식별을 위한 터보ID 기반 근접 라벨링

뉴런 리소좀 근접 라벨링 단백질체학 프로토콜은 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 뉴런에서 동적 리소좀 미세 환경을 특성화하기 위해 여기에 설명되어 있습니다. 리소좀 막 단백질 및 리소좀과 (안정적으로 또는 일시적으로) 상호 작용하는 단백질은 살아있는 인간 뉴런에서 우수한 세포 내 공간 분해능으로이 방법으로 정확하게 정량화 할 수 있습니다.

뉴런 리소좀 상호작용과 근접 라벨링 단백질체학의 특성 분석

여기에서는 화학 프로브 및 질량 분석법을 사용하여 천연 세포 및 조직에서 질병 특이적 단백질-단백질 상호 작용을 포착하고 식별할 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 결과 상호 작용 데이터 세트는 전용 웹 기반 플랫폼을 통해 분석되어 질병과 관련된 동적 네트워크 기능 장애 및 경로 변경을 밝힙니다.

질병에서 기능 장애 단백질-단백질 상호 작용 매핑

직접 lncRNA-단백질 상호작용을 식별하는 자외선 기반 ChIRP 방법.

LncRNA와 직접 상호작용하는 단백질을 검증 가능한 확인을 위한 자외선 기반 ChIRP 방법 - 배양된 세포부터 마우스 고환까지"

배우세요 LC-MS/MS 분석을 이용하여 핵 공동 인자와 상호 작용하는 단백질을 식별하는 고처리량 방법을. HEK 293 세포에서 면역침전 후 질량 분석으로 전사 조절 메커니즘을 규명할 수 있습니다.

LC-MS / MS 분석을 이용하여 핵 공동 인자와 상호 작용 단백질의 높은 처리량 식별 단백질 제조 방법

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