유학을위한 방법론 B. 서브 틸리 바이오 필름

박테리아 생물막은 인체 건강에 중요하며 환경 모욕 및 항균제로부터 박테리아 거주자를 보호합니다. 이 절차의 목표는 생물막 형성에 대한 소분자 억제제의 효과를 평가하기 위한 모델 시스템을 개발하는 것이었습니다. 이러한 방법은 생물막 형성을 특이적으로 표적으로 하는 소분자 억제제를 선택하기 위해 생물막 분야에 필수적인 도구 세트를 확립하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이러한 방법론의 주요 장점은 일관되고 강력한 실험 프레임워크에서 시작하여 생물막 특이적 억제제의 작용 메커니즘에 대한 정량적 및 정성적 통찰력을 제공한다는 것입니다. 이러한 방법은 Bacillus subtilis 생물막에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 또는 식물 병원균 Xanthomonas citri와 같은 다른 생물막 형성 박테리아에도 적용할 수 있습니다. 주사 전자 현미경은 세포 외 기질을 관찰할 수 있고 단일 세포 분해능을 제공하기 때문에 생물막 형성에 대한 작은 분자의 영향을 분석하는 데 필수적일 수 있습니다.

시작하려면 먼저 적절한 단일 콜로니를 선택하고 3ml의 LB 육수로 옮깁니다. 이 스타터 배양액을 섭씨 37도에서 4시간 동안 진탕 인큐베이터에 넣습니다. 배양 후 1.5ml의 스타터 배양을 취하고 4분 동안 원심분리합니다.

상등액을 조심스럽게 제거한 다음 펠릿을 1.5ml의 MSgg 배지에 다시 현탁시킵니다. 펠리클을 성장시키려면 각 웰에 3ml의 MSgg를 추가하여 12웰 세포 배양 플레이트를 준비합니다. 이러한 웰 중 일부에 농도 범위의 소분자 억제제와 함께 MSgg를 첨가하여 가장자리 효과를 피하기 위해 접시 주위에 다른 농도의 위치를 분배합니다.

다시 현탁된 스타터 배양의 600나노미터에서 광학 밀도를 측정합니다. 문화권은 0.6에서 1 사이여야 합니다. 이는 시스템의 견고성에 매우 중요합니다.

배양 플레이트의 각 웰에 3마이크로리터의 다시 현탁된 스타터 배양을 접종합니다. 그런 다음 정적 조건에서 섭씨 23도에서 3일 동안 플레이트를 배양합니다. 그 후, 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 펠리클을 관찰하십시오.

생물막을 성장시키려면 템플릿을 사용하고 8.5cm 건조된 1.5%Agar MSgg 플레이트에 세척되지 않은 1.5마이크로리터의 스타터 배양액 4방울을 대칭으로 고정합니다. 플레이트를 이동하기 전에 방울이 매체에 흡수되도록 하십시오. 접시를 섭씨 30도에서 3일 동안 배양합니다.

균일한 조명 노출이 있는 쌍안경을 사용하여 생물막 군집이 발달하여 3차원의 주름진 구조를 형성했는지 확인합니다. 먼저 깨끗한 면도날을 사용하여 템플릿을 사용하여 생물막 군체를 두 개의 동일한 부분으로 자릅니다. 깨끗한 주걱으로 집락의 절반을 조심스럽게 들어 올려 500마이크로리터의 PBS가 들어 있는 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

콜로니의 두 번째 절반을 500마이크로리터의 50% 에탄올이 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 이는 살균제에 대한 내성을 평가하는 데 사용됩니다. 그 후, 유사하게 D-lysine 처리 콜로니의 전반부를 취하여 PBS에 배치합니다.

그런 다음 이 식민지의 후반부를 에탄올로 옮깁니다. 반쪽의 생물막을 포함하는 모든 튜브를 실온에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 18, 000 번 g에서 5 분 동안 원심분리하십시오.

피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 300마이크로리터의 PBS를 첨가한 다음 마이크로팁 초음파 처리기를 사용하여 낮은 설정에서 세포를 초음파 처리합니다. 700마이크로리터의 PBS를 추가하면 최종 부피가 1밀리리터가 됩니다.

다음으로, PBS에서 10을 음수 7로 연속 희석합니다. 희석액 중 하나를 100마이크로리터로 취하고 1.5% 한천 LB 플레이트를 접종합니다. 샘플당 두 개의 다른 희석에 대해 이 단계를 반복합니다.

유리 구슬을 사용하여 이노큘럼을 펴 바르고 섭씨 30도에서 밤새 플레이트를 배양합니다. 플레이트를 검사하고 식민지 형성 단위 또는 CFU를 계산합니다. 밀리리터당 CFU 값을 계산한 후 에탄올 처리와 PBS에서 생존자의 비율을 계산합니다.

샘플 고정을 시작하려면 먼저 원하는 수의 생물막 집락에 대해 충분한 새로운 고착 용액을 준비합니다. 각 페트리 접시에 5ml의 고정제를 조심스럽게 첨가하고 콜로니에 직접 피펫팅하지 마십시오. 군체가 한천에서 분리되어 떠오르기 시작합니다.

파라필름으로 플레이트를 조심스럽게 밀봉하고 실온에서 2시간 동안 회전식 셰이커에서 배양합니다. 플레이트를 섭씨 4도로 옮겨 밤새 보관하십시오. 진공 청소기에 연결된 파스퇴르 피펫으로 고정 액체를 부드럽게 제거합니다.

100 나노몰 카코딜레이트 나트륨 10밀리리터, 염화칼슘 5밀리리터 완충액을 첨가하여 생물막을 세척하고 5분 동안 배양합니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 한천 플레이트에서 생물막 식민지의 중심을 조심스럽게 분리합니다. 콜로니를 자연 건조하려면 셀룰로오스 여과지를 4등분한 다음 한 부분을 100% 에탄올에 담그십시오.

하나의 떠 다니는 생물막 식민지를 종이에 조심스럽게 옮깁니다. 마른 여과지가 깐 페트리 접시에 종이를 놓습니다. 그런 다음 접시를 덮고 화학 물질 후드에 넣어 밤새 말리십시오.

생물막 군체의 형태를 보존하기 위해서는 셀룰로오스 종이로 부유 생물막을 완전히 밑에 깔는 것이 중요합니다. 종이에 올려진 후에는 생물막을 재조정할 수 없습니다. 전자 현미경 스텁을 탄소 테이프로 코팅한 다음 핀셋을 사용하여 생물막 콜로니를 스텁에 조심스럽게 옮깁니다.

각 콜로니를 스텁에 연결한 후 탄소 테이프의 얇은 브리지를 추가하여 스텁을 건조기에 24시간 동안 또는 필요할 때까지 보관합니다. 이 단계에서는 생물막이 매우 약하고 쉽게 파괴되기 때문에 안정적이고 정밀한 손이 필요합니다. 문제는 균열 없이 생물막의 상당 부분을 장착하는 것입니다.

검사 당일, 군체를 금-팔라듐 스퍼터 코팅기에 넣습니다. 샘플을 60도 각도로 2분 동안 코팅합니다. 이 단계를 두 번 반복하여 샘플을 중간에 120도 회전시킵니다.

마지막으로 상단에서 3분 동안 샘플을 한 번 코팅합니다. 이제 샘플이 SEM에서 이미징할 준비가 되었습니다. 이러한 이미지는 생물막 유도 MSgg 배지에서 성장한 B.subtilis의 펠리칼 형성을 보여줍니다.

소분자 억제제인 D-lysine을 첨가하면 펠리클 발생이 감소합니다. 그리고 억제제의 농도가 증가함에 따라 펠리클 형성은 상관관계가 감소하는 것을 보여줍니다. 이 그래프는 에탄올에 대한 노출이 D-lysine 억제제로 처리되거나 처리되지 않은 생물막 집락 내 세포의 생존에 미치는 영향을 보여줍니다.

D-lysine으로 처리하고 10분 동안 50% 에탄올에 노출된 콜로니는 처리되지 않은 분획에 비해 생존율이 급격히 감소했습니다. 하향식 양안 이미지는 D-lysine이 있는 곳에서 자란 집락이 전체적으로 더 작았고 치료하지 않은 집락보다 주름이 덜 뚜렷하다는 것을 보여줍니다. 임계점 건조 생물막 군체의 주사 전자 현미경 이미지는 변경된 생물막 발달을 더욱 보여줍니다.

세포외 고분자 물질 매트릭스(EPS)는 처리되지 않은 샘플에서 거미줄처럼 보였으며 처리된 샘플은 조직이 적었습니다. 마지막으로, 개별 박테리아 세포의 해상도를 조사한 결과, 처리된 세포는 외관상 길쭉하고, EPS로 덜 덮여 있으며, 처리되지 않은 세포만큼 이웃과 밀접하게 연결되어 있지 않음을 알 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 생물막 억제제를 연구하기 위한 일관된 프레임워크를 설정하는 것이 재현 가능한 결과를 위해 필수적이라는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

일단 숙달되면, 생물막 억제를 위한 소분자 스크리닝은 적절하게 수행된다면 일주일 이내에 완료될 수 있습니다. 이 절차에 따라 단일 생물막 세포의 유전자 발현 조사와 같은 다른 방법을 수행하여 소분자 억제제의 표적에 대한 추가 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 특정 생물막 억제제가 생물막 발달 및 항생제 내성에 미치는 전반적인 효과를 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.