유동 세포 계측법을 사용하여 재조합 이온 채널의 상대 셀 표면 및 전체 식의 결정

본 방법의 전반적인 목적은 형광 기반 분석법을 사용하여 막 단백질의 세포 표면 발현량을 정량화하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 실험에서 대량의 살아있는 세포에 대해 정량 가능한 종점(end point)을 유동 세포 분석법(flow cytometry)으로 제공한다는 점입니다. 이러한 병리 현상은 흔히 심장 이온 통로의 트래픽 결함을 유발하는 유전적 변이와 관련이 있기 때문에, 이 기술의 응용 범위는 심실성 부정맥의 진단 및 치료까지 확장됩니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자들은 단백질 기능에 영향을 주지 않으면서 접합 항체 존재 하에 강한 형광 신호를 생성할 수 있는 적절한 세포 외 삽입 부위를 식별하는 데 어려움을 겪습니다. 이 절차는 본 연구실의 연구 보조원인 Benoite Bourdin이 시연할 것입니다. 우선, 세포 내 C-말단에 mCherry를 사용하여 DNA 작제물을 이중 태깅하십시오.

또한, 막 단백질의 세포 표면 발현 정도를 추정하기 위해 형광 항체로 측정 가능한 세포 외 방향의 헤마글루티닌(hemmagglutinin) 에피토프를 추가로 발현시킵니다. 다음으로, TSA201 세포가 90% 합류도(confluence)에 도달할 때까지 표준 기술을 사용하여 플레이트에서 배양합니다. 각 샘플에 대해 두 개의 튜브에 형질전환 시약을 준비합니다.

4 µg의 DNA와 250 µL의 환원 혈청 배지를 포함한 1.5 mL 튜브 하나와, 10 µL의 리포좀 매개 형질전환 시약 및 250 µL의 혈청 환원 배양 배지를 포함한 두 번째 튜브를 준비합니다. 두 튜브를 부드럽게 혼합한 후 실온에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음, 첫 번째 튜브와 두 번째 튜브의 내용물을 조심스럽게 합치고 리포좀 DNA 복합체를 실온에서 20분 동안 배양합니다.

복합체를 배양 세포에 첨가하고 배양 접시를 부드럽게 흔들어 줍니다. 접시를 37 °C, 5% CO₂ 분위기의 배양기에 넣고 24시간 동안 배양합니다. 형질전환 시약을 첨가한 24시간 후, 배양 접시에서 배지를 제거하고 미리 데워둔 Trypsin-EDTA 400 µL로 세포를 조심스럽게 세척합니다.

그 다음, 400 µL의 Trypsin-EDTA를 첨가하고 세포가 접시에서 떨어져 나올 수 있도록 5분 동안 배양합니다. 세포가 분리되면 페니실린 또는 스트렙토마이신이 포함되지 않은 차가운 배양액 1 mL를 세포에 첨가하여 효소 소화를 중단시킵니다. 파이펫으로 배양액을 플레이트 위에 4~5회 부드럽게 분사하여 표면의 모든 세포를 세척합니다.

그 다음, 멸균된 1.5 mL 튜브에 세포를 수집하고 즉시 얼음에 둡니다. 다음 단계에서는 표면 에피토프의 내부 유입을 방지하기 위해 얼음처럼 차가운 용액을 사용하고 세포를 4°C로 유지하십시오. 또한, 형광 신호의 광퇴색을 제한하기 위해 세포의 빛 노출을 줄이십시오.

다음으로, 튜브를 원심 분리하여 세포를 펠릿화합니다. 그런 다음, 생성된 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 1 mL의 PBS를 사용하여 펠릿을 재부유시켜 단일 세포 현탁액을 준비합니다.

그 다음, 튜브를 짧게 원심 분리합니다. 배양액을 완전히 제거하기 위해 세포를 한 번 더 펠렛화하고 재현탁합니다. 다음으로, 세포 펠렛을 600 µL의 PBS에 재현탁합니다.

세포 농도를 측정하고 밀리리터당 최소 300만 개의 세포가 되도록 조정합니다. 그런 다음, 세포를 새로운 1.5 milliliter 튜브에 나누어 담습니다. 특이적 염색과 비특이적 염색을 구분하기 위한 적절한 대조군과 세포 외 염색 및 세포 내 염색을 위한 대조군을 반드시 포함하십시오.

아이소토프 대조 항체는 배경 염색 수준을 평가하는 데 도움을 주며, 1차 항체와 아이소토프 및 형광체 종류가 일치해야 합니다. 대조 아이소토프 항체와 형광 항체를 동일한 농도로 사용하는 것이 중요합니다. 막 단백질의 세포 표면 발현을 추정하려면, 먼저 형광 표지 항체를 사용하여 세포 외부에 노출된 HA 에피토프만을 표지하십시오.

그다음, FITC-접합 단클론성 anti-HA 항체를 5 µg/mL 농도로 튜브에 첨가합니다. 세포를 짧게 볼텍싱한 후, 암실 내의 로커 플랫폼 위에서 배양합니다. 암실에서 세포를 꺼내고 900 µL의 PBS를 첨가합니다.

그 다음 튜브를 원심분리하여 세포를 펠렛화하고 상층액을 흡입하여 제거합니다. 이어서 펠렛을 1 mL의 PBS에 재현탁하고 짧게 볼텍싱하여 세포를 세척합니다. 그 후 원심분리 단계를 반복하여 세포를 다시 펠렛화합니다.

결합되지 않은 항체를 모두 제거하기 위해 이 세척 단계를 총 3회 반복합니다. 마지막 세척 후, 세포를 500 µL의 PBS에 재현탁하고 단일 세포 현탁액을 5 mL 유세포 분석 튜브로 옮깁니다. 샘플을 분석할 때까지 세포를 4 °C의 암소에 보관하십시오.

총 단백질의 세포 내 발현을 측정하기 위해, 다음으로 투과화된 세포를 염색합니다. 이는 세포 외 염색과 유사한 프로토콜을 사용하되, 사포닌 기반의 세포 투과화 버퍼를 추가하여 수행합니다. 세포를 원심 분리하여 침전시키고 상층액을 제거한 후, 준비된 스톡에서 직접 가져온 100 microliters의 고정 투과화 용액에 세포를 재현탁합니다.

세포를 4°C의 암소에서 20분 동안 배양합니다. 그 후, 갓 준비한 투과성 세척 완충액 100 µL를 첨가하고 세포를 짧게 볼텍싱합니다. 다음으로, 세포를 원심 분리하여 펠릿화하고 투과성 세척 완충액을 사용하여 두 번 더 세척합니다.

그다음, 5 µg/mL 농도의 FITC-접합 단클론성 anti-HA 항체와 100 µL의 투과성 세척 완충액을 첨가합니다. 세포를 짧게 볼텍싱한 후 4 °C의 암소에서 30분 동안 배양합니다. 이어서, 100 µL의 투과성 세척 완충액을 첨가합니다.

세포를 원심 분리하여 펠렛으로 만들고, 이전에 설명한 것과 동일한 버퍼 100 µL로 3회 세척합니다. 마지막 세척 후, 세포를 PBS 500 µL에 다시 현탁하고 단일 세포 현탁액을 5 mL 유세포 분석 튜브로 옮깁니다. 비투과화 및 투과화된 세포를 당일에 유세포 분석기로 분석합니다.

먼저, 유세포 분석 소프트웨어를 실행하고 유세포 분석 중에 생성된 fcs 파일을 가져옵니다. 첫 번째 샘플을 클릭하고 side scatter 대 forward scatter 플롯에서 게이팅 과정을 시작합니다. 다음으로, 타원 아이콘을 사용하여 살아있는 세포 주변에 P1 게이트를 그려 데브리, 죽은 세포 또는 응집체를 제거합니다.

그런 다음, mCherry 대 FITC 형광 강도의 튜브 파라미터 등고선 도표(contour plot)를 그립니다. FITC 및 mCherry 양성 세포 주변에 P2 게이트를 설정하고, 형광 음성 세포군 주변에 P3 게이트를 설정합니다. 다음으로 P2 및 P3 게이트를 선택하고 원래 작업 영역 창에서 통계 추가 아이콘을 클릭합니다.

count를 클릭한 다음 mean을 클릭하십시오. 마지막으로, 게이트 매개변수와 통계를 사이토미터로 분석한 모든 샘플에 적용하십시오. 이 프로토콜은 TSA201 세포에서 CaV Alpha 2 Delta 1의 총 발현 및 세포 표면 발현에 대한 N-당화의 역할을 규명하는 데 사용되었습니다.

세포 표면 단백질 발현을 확인하기 위해, 4곳, 16곳 또는 어느 곳도 N-당쇄화 부위가 파괴되지 않은 비투과화 세포에서 HA를 측정하였습니다. 야생형 및 4곳의 N-당쇄화 부위가 파괴된 세포에서는 FITC 수준이 강하게 나타났으나, 16곳이 파괴된 세포에서는 배경 수준의 신호만 발견되었습니다. 투과화 세포의 경우, 모든 조건에서 FITC 형광이 증가하였으며, 이는 모든 형질전환된 HA-태그 CaV Alpha 2 Delta 1 단백질이 anti HA FITC 항체에 의해 염색 및 검출되었음을 나타냅니다.

또한, 투과성 처리된 세포와 처리되지 않은 세포의 mCherry 형광 수준이 유사하게 나타났으며, 이는 투과성 처리가 상대적인 mCherry 신호를 변화시키지 않음을 의미합니다. 세포 투과성 처리 후 수행된 분석에서 16개 위치가 파괴된 세포의 총 단백질 발현 또한 유의미하게 감소한 것으로 나타났으며, 이는 투과성 처리된 세포의 FITC 형광 또는 투과성 처리 여부와 상관없이 측정된 기존의 mCherry 형광 모두에서 확인되었습니다. 이 절차 외에도 이온 통로의 발현과 기능을 상관시키기 위해 추가적인 생리학적 기록을 수행할 수 있습니다.

이 기술은 또한 의료 분야 연구자들이 재조합 세포 또는 천연 세포에서 발현되는 막 단백질의 수송 과정에서 유전자 돌연변이, 번역 후 변형, microRNA, 소형 GTPase 및 샤페론의 역할이 미치는 영향을 연구할 수 있는 길을 열어줍니다. 이 영상을 시청한 후에는 재조합 세포에서 DNA 형질전환을 수행하는 방법, NTAC 및 투과화된 세포를 염색하는 방법, 그리고 샘플에 대한 데이터 분석을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 살아있는 세포를 다룰 때는 형질전환을 위해 층류 벤치 내에서 작업하고 화학 물질을 취급할 때 장갑을 착용하는 것과 같은 예방 조치가 필요함을 잊지 마십시오.