유동 세포 계측법을 사용하여 재조합 이온 채널의 상대 셀 표면 및 전체 식의 결정

이 방법의 전반적인 목표는 형광 간격 분석을 사용하여 막 단백질의 세포 표면 발현을 정량화하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 유세포 분석 분석이 단일 실험에서 많은 양의 살아있는 세포에 대해 정량화 가능한 종말점을 제공한다는 것입니다. 이 기술의 의미는 심장실 부정맥의 진단 및 치료로 확장되는데, 이러한 병리학은 종종 심장 이온 채널의 이동에 결함을 일으키는 유전적 돌연변이와 관련이 있기 때문입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 단백질 기능을 손상시키지 않고 접합 항체가 있는 상태에서 강력한 형광 신호를 생성하지 않는 항원결정기에 적합한 외부 삽입 부위를 식별하는 데 어려움을 겪습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 연구 조교인 Benoite Bourdin입니다. 우선, 이중 태그 DNA는 세포 내 C 말단에서 mCherry와 함께 구성됩니다.

또한 형광 항체를 사용하여 측정하여 막 단백질의 세포 표면 발현을 추정할 수 있는 여분의 세포 직면 hemmagglutinin epitope를 발현합니다. 다음으로, TSA201 세포가 90% confluence에 도달할 때까지 표준 기술을 사용하여 TSA201 세포 플레이트를 배양합니다. 각 샘플에 대해 두 개의 튜브에서 transfection 시약을 준비합니다.

DNA 4마이크로그램과 환원혈청 배지 250마이크로리터가 들어 있는 1.5ml 튜브 1개와 리포솜 매개 형질주입 시약 10마이크로리터와 혈청 감소 배양 배지 250마이크로리터가 들어 있는 두 번째 튜브를 준비합니다. 두 개의 튜브를 부드럽게 섞어 실온에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 튜브 1과 튜브 2의 내용물을 부드럽게 결합하고 실온에서 20분 동안 리포좀 DNA 복합체를 배양합니다.

배양된 세포에 복합체를 추가하고 배양 접시를 부드럽게 흔듭니다. 접시를 섭씨 37도, 5% 이산화탄소 분위기 아래에 24시간 동안 다시 놓습니다. 형질주입 시약을 첨가한 후 24시간이 지나면 배양 접시에서 배지를 제거하고 400마이크로리터의 예열된 트립신-EDTA로 세포를 조심스럽게 세척합니다.

그런 다음 400마이크로리터의 트립신-EDTA를 넣고 접시에서 세포가 분리될 수 있도록 접시를 5분 동안 배양합니다. 일단 분리되면 페니실린 또는 스트렙토마이신이 없는 저온 배양 배지 1ml를 세포에 첨가하여 효소 분해를 중지합니다. 플레이트에 배지를 4-5회 부드럽게 피펫팅하여 표면의 모든 세포를 씻어냅니다.

그런 다음 멸균 1.5ml 튜브에 세포를 모아 즉시 얼음 위에 놓습니다. 다음 단계에서는 얼음처럼 차가운 용액을 사용하고 세포를 4도로 유지하여 표면 항원결정기의 내재화를 방지합니다. 또한 형광 신호의 광표백을 제한하기 위해 세포가 빛에 노출되는 것을 줄이십시오.

다음으로, 튜브를 원심 분리하여 세포를 펠릿화합니다. 그런 다음 조심스럽게 흡인하고 생성된 상등액을 버립니다. 펠릿을 재현탁하여 1ml의 PBS를 사용하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다.

그런 다음 튜브를 잠시 원심분리합니다. 배양 배지를 완전히 제거하기 위해 세포를 한 번 더 펠렛화하고 재현탁합니다. 다음으로, 세포 펠릿을 600마이크로리터의 PBS에 재현탁시킵니다.

세포 농도를 측정하고 밀리리터당 최소 300만 개의 세포로 조정합니다. 그런 다음 세포를 새로운 1.5ml 튜브로 나눕니다. 특정 염색과 비특이적 염색을 구별하고 추가 세포 염색 및 세포 내 염색을 구별할 수 있는 적절한 대조군을 포함해야 합니다.

동위원소 대조 항체는 배경 염색 수준을 평가하는 데 도움이 되며 1차 항체, 상서로운 동위원소 및 형광단과 일치해야 합니다. 대조군 동위원소 항체와 형광 항체를 동일한 농도로 사용하는 것이 중요합니다. 막 단백질의 세포 표면 발현을 추정하려면 먼저 형광 접합 항체를 사용하여 여분의 세포를 향하는 HA 항원결정기만 라벨링합니다.

그런 다음 FITC-conjugated monoclonal anti-HA 항체를 밀리리터당 5마이크로그램으로 튜브에 추가합니다. 세포를 잠시 소용돌이친 다음 어둠 속에서 로커 플랫폼에서 배양합니다. 어두운 곳에서 세포를 제거하고 900 마이크로 리터의 PBS를 첨가하십시오.

그런 다음 튜브를 원심 분리하여 세포를 펠릿화하고 상층액을 흡인합니다. 다음으로, 펠릿을 PBS 1ml에 재현탁시키고 세포를 잠시 와류로 세척합니다. 그런 다음 원심분리기 단계를 반복하여 세포를 다시 펠릿화합니다.

이 세척 단계를 총 3회 반복하여 결합되지 않은 항체를 제거합니다. 최종 세척 후 500마이크로리터의 PBS에 세포를 재현탁시키고 단일 세포 현탁액을 5ml 유세포 분석 튜브로 옮깁니다. 샘플이 실행될 때까지 세포를 섭씨 4도의 어두운 곳에 두십시오.

전체 단백질의 세포 내 발현을 추정하려면 다음으로 투과화된 세포에 레이블을 지정합니다. 이는 세포외 라벨링과 유사한 프로토콜을 사용하여 수행되지만 사포닌 기반 세포 투과화 완충액을 추가하여 수행됩니다. 세포를 펠렛화하고 상등액을 버리고 준비된 스톡에서 직접 100마이크로리터의 고정 투과화 용액에 세포를 재현탁합니다.

섭씨 4도의 어두운 곳에서 20분 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 갓 준비한 투과화 세척 완충액 100마이크로리터를 추가하고 세포를 잠시 와류로 만듭니다. 다음으로, 세포를 펠릿화하고 투과 세척 버퍼를 사용하여 두 번 더 씻습니다.

그런 다음 FITC-conjugated monoclonal anti HA 항체를 밀리리터당 5마이크로그램과 투과화 세척 완충액 100마이크로리터에 추가합니다. 간단히 말해서 세포가 소용돌이치고 섭씨 4도의 어둠 속에서 30분 동안 세포를 배양합니다. 다음으로 투과화 세척 버퍼 100마이크로리터를 추가합니다.

세포를 펠렛화하고 앞서 보여진 것과 동일한 완충액 100마이크로리터에서 세 번 세척합니다. 최종 세척 후 500마이크로리터의 PBS에 세포를 재현탁시키고 단일 세포 현탁액을 5ml 유세포 분석 튜브로 옮깁니다. 비투과형 세포와 투과형 세포를 같은 날 유세포분석기를 통해 실행합니다.

시작하려면 유세포 분석 소프트웨어를 실행하고 유세포 분석 중에 생성된 fcs 파일을 가져옵니다. 첫 번째 샘플을 클릭하고 side scatter versus forward scatter의 플롯에서 게이팅 프로세스를 시작합니다. 다음으로, 살아있는 세포 주위에 타원 아이콘을 사용하여 P1 게이트를 그려 파편, 죽은 세포 또는 응집체를 제거합니다.

그런 다음 mCherry 대 FITC 형광 강도의 튜브 매개변수 윤곽 플롯을 그립니다. P2 게이트는 FITC 및 mCherry 양성 세포 주위에 설정하고 P3 게이트는 형광 음성 세포 집단 주위에 설정합니다. 그런 다음 P2 및 P3 게이트를 선택하고 원래 작업 공간 창에서 통계 추가 아이콘을 클릭합니다.

count를 클릭한 다음 mean을 클릭합니다. 마지막으로, gates 매개변수와 통계량을 세포분석기로 프로빙한 모든 샘플에 적용합니다. 이 프로토콜은 TSA201 세포에서 CaV Alpha 2 Delta 1의 총 및 세포 표면 발현에 대한 N-glycosylation의 역할을 특성화하는 데 사용되었습니다.

세포 표면 단백질 발현에 접근하기 위해 HA는 4개 부위, 16개 부위 또는 아무 부위도 없는 N-글리코실화 부위가 파괴된 비투과성 세포에서 측정되었습니다. FITC 수치는 야생형에서 강했고 N-글리코실화 세포가 4개 위치에서 파괴된 세포에서 발견되었지만, 16개 위치에서 파괴된 세포에서는 배경 수준만 발견되었습니다. 투과화된 세포의 경우, 모든 조건에서 FITC 형광이 증가했으며, 이는 모든 transfection, HA-tagged, CaV Alpha 2 Delta 1 단백질이 항 HA FITC 항체에 의해 염색 및 검출되었음을 나타냅니다.

또한, mCherry 형광 수준은 투과화된 세포와 투과되지 않은 세포에서 유사했는데, 이는 투과화가 상대적인 mCherry 신호를 변경하지 않음을 의미합니다. 세포 투과화 후 수행된 분석은 16개 위치가 파괴된 세포에 대한 총 단백질 발현도 크게 감소한 것으로 나타났으며, 이는 투과화된 세포의 FITC 형광에서 추론한 것이든 투과되지 않은 세포와 투과화된 세포에서 측정된 구성적 mCherry 형광에서 추론된 것이든 상관없습니다. 이 절차 외에도 이온 채널의 발현과 기능을 연관시키기 위해 추가적인 생리학적 기록을 수행할 수 있습니다.

이 기술은 또한 의료 분야의 연구자들이 유전자 돌연변이, 번역 후 변형, microRNA, 작은 GTPase 및 재조합 또는 네이티브 세포에서 발현되는 막 단백질의 이동에서 샤페론의 역할을 연구할 수 있는 길을 열어줍니다. 이 동영상을 시청한 후에는 재조합 세포에서 DNA transfection을 수행하는 방법, NTAC 및 투과화된 세포를 염색하는 방법, 샘플에 대한 데이터 분석을 수행하는 방법을 잘 이해할 수 있을 것입니다. 살아있는 세포로 작업하려면 transfixion을 위해 헬라미날 유체에서 작업하고 화학 물질을 다룰 때 장갑을 착용하는 것과 같은 예방 조치가 필요하다는 것을 잊지 마십시오.