Name: 인간 호중구 유래 거 식세포의 소설 모집단의 개발 및 식별 체외 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 배우세요 인간 호중구에서 거대 식세포를 배양하고 식별하는 방법을 통해 면역 반응을 연구하세요. 이 기술은 세포 활성화와 가소성을 조사하는 데 활용됩니다.

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저자는 공 초점 현미경 연구와 함께 그녀의 귀중한 도움 박사 에디스 수스 - 토비 감사합니다. 본 연구는 KAMEA 프로그램 (LD 및 AP)의 틀에서 이민 흡수의 교육부와 기획위원회 및 고등 교육에 대한위원회의 예산에 의해 지원되었다. 우리는 또한 감사 연구 레이디 데이비스 재단 포스트 박사 연구 활동에서 연구원 (OR)의 지원을 인정합니다.

이 프로토콜은 헬싱키 선언에 따라 로컬 인권위원회의 승인을, 모든 참가자는 동의서에 서명했다. 1. 호중구의 분리 및 문화에 Gφ 개발 참고 : 모든 단계가 바이오 안전 층류 후드에서 무균 조직 학년 lipopolysaccaride (LPS) - 무료 솔루션을 사용하여 수행해야합니다. 로스웰 공원 기념 연구소 (RPMI) -1640 매체에 항생제, 사이토 카인이나 성장 인자를 추가하지 마십시오. <ol><li> 멸균 두피 정맥 세트를 사용하여 젊은 건강한 성인에서 적어도 40 ml의에게 정맥 혈액을 얻습니다. 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 K 3 염을 함유 vacutainer 튜브 (K 3 EDTA)에 혈액을 그리고 부드럽게 섞는다. 실온에서 혈액을 유지. </li><li> 1.119과 1.077 g / ㎖에서 polysucrose을 사용하여 두 단계 불연속 밀도 기울기에 의한 호중구를 분리합니다. 사용하기 전에 실온에 솔루션을 제공. 참고 : 원심 분리 동안, 적혈구세포 (적혈구)가 빠르게 polysucrose 및 퇴적물에 의해 집계됩니다. 호중구가 polysucrose -1,077 / 1119 인터페이스 (그림 2 참조)에서 바로 적혈구 위에서 발견되는 반면, 단핵 세포 (단핵구 / 림프구)가 상부 플라즈마 사이에 발견 / -1,077 인터페이스를 polysucrose. 이 방법은 동일인으로부터 단핵구 및 호중구의 동시 분리를 허용한다. </li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54826/54826fig2.jpg"> 그림 2 : 인간 전혈에서 호중구 격리입니다. 1.077 g에 Polysucrose은 / ㎖ 신중 불연속 구배를 형성 polysucrose - 1.119 g / ㎖의 상부에 적층된다. 희석 된 전혈이어서 polysucrose-1.077의 상부에 적층된다. 튜브없이 즉시 제동을 실온에서 30 분 동안 700 × g으로 원심 분리를 실시한다. 세 가지 밴드가 주목된다. (A) 단핵 세포, (B) 다형 핵 세포 (PMN),상기 튜브의 하단 및 (C), 적혈구 (RBC). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54826/54826fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol style="margin-left: 40px;"><li> 50 ㎖의 멸균 폴리 프로필렌 원뿔 원심 분리기 튜브의 바닥에 12 ml의 polysucrose-1119을 추가합니다. </li><li> 조심스럽게 polysucrose -1119에 polysucrose-1077의 12 ml의 레이어. </li><li> 2 % 열 비활성화 우태 혈청 (HI-FCS)을 함유하는 이온없는 인산염 완충 식염수 24 mL의 혈액을 최종 부피 (PBS)로 12 ml의 전혈 - 10 희석. 조심스럽게 튜브의 상부 구배로 희석 된 전혈에 24 ml의 층을 포함한다. </li><li> 브레이크없이 - (24 ° C를 20) 실온에서 30 분 동안 700 XG에 원심 분리기. 참고 : 낮은 온도에서 원심 분리 세포 응집와 가난한 복구 될 수 있습니다. </li><li> 조심스럽게 원심 분리기에서 튜브를 제거 without은 그라데이션을 방해. 두 불투명 층이 관찰되어야한다 (A : 단핵 세포와 B : PMN,도 2에 도시). </li><li> 튜브는 "단핵을"표시에 대기음이 층에서 층 A. 전송 (또는 폐기) 위 0.5 cm 세포에 유체를 위로 버리고. </li><li> 대기음은 "PMN"이라는 관이 계층에서 세포를 전송 계층 B. 위의 0.5 cm에 남아있는 유체를 위로 버리고. </li><li> 풀 각이 그라데이션 튜브에서 PMN 및 PBS 30 ML의 최종 볼륨에 2 % HI-FCS를 포함 씻어. 200 XG에서 12 분 동안 원심 분리기 뜨는을 제거하고 폐기합니다. </li><li> 부드럽게 1 ㎖의 멸균 피펫 팁으로하고 인출하여 펠렛을 재현 탁 동안 적혈구 (RBC)를 오염 제거하려면, 저장성 0.2 % 냉담한 멸균 염화나트륨의 3 ㎖를 추가합니다. 30 초 동안 얼음에 보관하십시오. </li><li> 30 초 후, 튜브에 멸균 1.6 %의 냉담한 염화나트륨의 3 ㎖를 추가하여 등장을 복원 할 수 있습니다. </li><li> 등장 성 식염수의 6 ml의에, 6m를 추가미리 예열 (37 °에 C)의 리터 RPMI-1640 배지는 12 분 동안 250 XG에 2 % HI-FCS와 원심 분리기로 보충. 상층 액을 버린다. PMN 펠릿은 RBC 오염 청소해야합니다. 참고 : RBC에 의해 오염 된 경우, PMN 펠렛은 붉은 나타납니다. </li><li> 일부 오염 RBC가 남아있는 경우, 반복 9, 10 번 단계를 반복합니다. </li><li> 10 % HI-FCS로 보충 4 ml의 RPMI-1640 세포 펠렛을 재현 탁하고 트리 판 블루 배제함으로써 농도 및 생존력을 결정하는 세포를 카운트. </li><li> 1.25 농도 조정 - 1.5 × 10 6 PMN / ㎖ (실험 필요에 따라), 1.0 mL의 / 웰에서 24 웰 플레이트를 접시. 참고 : 월 Grunewald는-김사 염색하고 광학 현미경에 의해 평가로 과립구 인구에서 호중구의 순도는 항상 95 %를 초과했다. </li><li> 시딩 한 후, 세포에 배치 37 ° C에서 가습 5 % CO 2 배양기. </li><li> 부드럽게의 절반을 흡입하여 3 일마다 중간 교체배지 및 10 % HI-FCS로 보충 된 신선한 RPMI-1640 배지의 동일한 양을 첨가. HI-FCS에 사용 LPS 무료 솔루션 및 화합물과 낮은 LPS 수준 (0.05 NG / ㎖ 이하). 참고 : 문화 개발하는 Gφ가 단단히 또한 개발 세포를 씻어 수있는 배양 접시와 활발한 세척에 연결하지 않기 때문에 부드러운 매체 변화가 필수적이다. 혈액 기증자에 따라 PMN 배양 후 4 일 - Gφ의 모양은 3에서 눈에 띈다. Gφ 크기가 매우 큰 경우, 문화 칠일 - 여기에 설명 된 분석과 분석의 대부분은 6 사이에 수행됩니다. RPMI-1640 배지에서 10 ng의 / ㎖ LPS 배양 Gφ 발달에 영향을 미치지 않았다 - 하나의 첨가는 주목해야한다. (14) </li></ol> 2. 공 초점 레이저 주사 현미경 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 갓 격리 된 호중구에서 cytospins (16)을 준비하고, 칠일 개발 Gφ의 문화(섹션 1에서 제조). 참고 : 부드럽게, 다양한 분석을위한 접시에 Gφ의 농도를 증가 매체의 절반을 제거하려면. Gφ 가벼운 현미경 매체를 검사하여 제거 매체에서 검출되지 않았는지 확인합니다. 그런 다음, 집중적으로 가볍게 부착 Gφ을 제거하기 위해 나머지 매체를 피펫. 200 × g으로 10 분간 원심 분리하여 배지를, 100에 펠렛을 재현 탁 - 120 μL 매체. <ol><li> 각 슬라이드에 대한 세포를 포함하는 매체의 120 μL - 100을 사용합니다. 각각의 치료에서 중복 또는 세중의 슬라이드를 준비합니다. 84 X g에서 7 분 동안 스핀. </li></ol></li><li> 스펀 세포 건조 화학 후드 하에서 10 분 동안 실온에서 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정한다. PBS로 세척 배 (~ 세척 당 몇 초 동안 100 μL). 세포 염색의 경우, 10 분 동안 실온에서 0.5 % 트리톤 X-100의 PBS로 세포를 Permeabilize 하시려면하고 PBS로 5 배 씻는다. 참고 : 모든 단계에서 적절한 버퍼 / 솔루션 volu를 사용나 슬라이드의 셀의 주변부를 커버한다. 셀 경계를 결정하는 소수성 장벽 펜을 사용합니다. 주의 : 파라 포름 알데히드는 독성이있다. 피부와 눈에 접촉을 피할 것. 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. </li><li> RPMI-1640 배지에서 10 % 정상 염소 혈청으로 차단 셀 4 ºC에서 40 분 동안 실온에서 밤새 배양한다. PBS로 세척. </li><li> (100) 희석 (~ 100 μL) : 단일 항체 (AB) 또는 1에서 마우스와 토끼 일차 항체 (ABS)의 조합으로 품어. 4 ° C에서 - (20 시간 18) 밤새 품어. 참고 : 여기에, 마우스 모노클로 날 애비 포함 : 안티 CD14, 항 CD63, 안티 CD66b, 안티 CD1c, 안티 CD15, 및 안티 시토크롬 B-245 경쇄 (p22- phox 식별). 토끼 폴리 클로 날 복근 포함 : 안티 CD68, 항 CD36, 안티 LC3B, 안티 - 마이 엘 로퍼 옥시 다제, 항 호중구 엘라 스타 제 (NE), 및 안티 Nox2 /가 gp91- phox의 복근을. 아이소 타입 컨트롤은 정제 된 마우스의 IgG1 및 IgG2, 토끼 IgG에 포함되어 있습니다. 위해 준비 할제조자의 지시에 따른 복근 E는 셀의 주변을 덮도록 적절한 양 (약 100 μL)을 사용한다. </li><li> 세포를 씻고 1/400 이차 항체 CY2-CF (488A) 공역 계 염소 항 - 토끼 IgG를 (녹색)과 함께 품어 / 또는 Cy5에 (CF 647) 공역 계 염소 항 - 마우스 IgG (40) 실온에서 (적색) 분. 참고 : 제조업체의 지침에 따라 복근을 희석하고 준비합니다. </li><li> 세척 후, 즉시 커버 슬립을 배치, 핵 염색 4 ', 6-diamidino-2-페닐 인돌 (DAPI)를 포함, 매체를 장착 한 방울과 함께 슬라이드를 탑재합니다. </li><li> 형광 현미경 및 계획 아포 40X 침지 오일 대물를 이용한 공 초점 레이저 스캐닝 시스템에 의해 슬라이드를 분석한다. 슬라이드의 준비 후 30 분 시간 2 내에서 분석을 수행하거나 밤새 4 ° C에서 보관하십시오. <ol><li> 셀 영역 및 이미징 소프트웨어 (예를 들어 이미지 J)를 사용하여 형광 강도를 계산한다. 공동 현지화, ...로서하십시오은 Manders 중복 계수 (MOC) (17)를 사용하여 소프트웨어에 의해 ntify. 주 : MOC 만 세포는&gt; 0.6이 상당한 공동 지역화 셀들로 고려 될 수있다. </li></ol></li></ol> 내피 세포의 맞은 편에 PMN 3. 윤회 : 거 식세포에서 IL-8의 효과 (Gφ) 형성 참고 : 사용 24 잘 투과 세포 배양은 세포 윤회 분석을 위해 삽입합니다. <ol style="margin-left: 40px;"><li> 코트 50 ㎍ / ml의 농도에서 150 μL의 피브로넥틴과 인서트의 상부 챔버, 및 실온에서 30 분 동안 유지한다. </li><li> 다락방에 추가 5 × 10 4 EA.hy926 내피 세포 / 웰, 공식화 둘 베코의 변형 이글의 중간 (전체 성장 매체)의 150 μL에 재현 탁. 참고 : 내피 단일 층이 합류 사용하기 전에 있는지 확인하십시오. </li><li> 하부 챔버에, 전체 성장 매체의 700 μL를 추가합니다. </li><li> 투과성 배치세포 배양은 5 % CO 2에서 37 ° C에서 클러스터 트레이와 문화 2 일 동안 EA.hy926 내피 세포에 삽입합니다. 주 : (1 절에 설명 된대로) 병행, 두 번째 날에 신선한 PMN을 준비합니다. </li><li> 이일 후, 인서트의 하부 및 상부 챔버에 매체를 교체한다. <ol><li> 하부 챔버에 50 나노 미터 / ㎖의 최종 농도로 10 % FCS-IH 및 인터루킨 (IL) -6으로 보충 된 RPMI-1640 배지를 추가한다. 낮은 챔버를 제어하는 ​​IL-8을 추가하지 마십시오. </li><li> 각각의 상부 챔버에, 10 % IH-FCS로 보충 된 RPMI-1640 배지 100 ㎕에 10 6 신선한 PMN을 추가합니다. </li></ol></li><li> 90 분 동안 5 % CO 2에서 37 ° C에서 클러스터 트레이 인큐베이션. </li><li> 90 분 인큐베이션 한 후, 별도의 상부 셀과 하부 챔버를 분리하고 각 모집단을 계산. 전체 세포의 비율로 각 챔버에서 발현하는 세포는 덧붙였다. 참고 : 조심스럽게 상단 chamb에서 세포를 제거어 내피 세포를 제거 방지하고 멸균 튜브에 전송하기 위해 부드럽게 피펫 팅에 의해. 피펫 및 제 멸균 튜브에 500 μL 및 전송과 하부 챔버를 세정하여 하부 챔버에서 세포를 제거합니다. </li><li> transmigrating (하부 챔버) 및 비 이주 (상부 챔버) PMN 분수와 문화 성장 인자없이 7 일간 각각의 여러 우물에서 수영장 10 6 세포 단계에 지정된대로 14-16 (1 절). </li><li> 슬라이드 (16)에 세포를 스핀과 2 절에 설명 된대로 공 초점 현미경에 의해 각각의 배양 조건에서 개발 된 세포를 분석 할 수 있습니다. </li></ol>

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거 식세포 (Gφ)는 이러한 CD66b / CD15 / CD63 / MPO / NE와 같은 근본적이고 구체적인 호중구 마커를 발현하는 호중구 유래 세포의 새로 정의 된 모집단 있습니다. 호중구 식세포 유래의이 유형은 이전 문헌에 기재되지 않았다. 짧은 수명이며, 세포 자멸사를 받아야 호중구와는 달리, Gφ는 넥신 - V-음과 확장 수명을 표시합니다. 그러나, 호중구처럼 Gφ은 입자를 내면화하고 그 입자와 PMA에 대한 응답으로 NADPH 산화 효소에 의존 ROS를 생산하고 있습니다. 그러나, 그들의 능력은 ROS가 Gφ의 고유 한 기능입니다 생산 결과적으로 OxLDL을 내면화하고 있습니다. (14) 다수의 인자 배양 그들의 발전에 영향을 나타내었다. 성장 배지의 외부 사이토킨 또는 성장 인자의 부족이 중요하다 (구체적으로는 GM-CSF / IL-4). 그러나, IL-8으로 호중구의 이동은 dev에 그들 사이의 차별 요인을 입증Gφ에 눈 맞아 달아과 그렇지 않은 사람들. 그들의 억제 Gφ 형성 (그림 1)을 방지하기 때문에 또한, 세포 사멸 호중구에서 발생하는 파편의 국제화, 자식 작용 단백질 (LC3B) 및 기능 NADPH 산화 효소의 발현은 모두 자신의 발전을위한 필수적 것으로 나타났다. 명백하게, 호중구에서 발생하는 이러한 거대 세포의 발달은 단핵구 / 대 식세포 리니지 것을 특징 거대 세포 형성 다르다. 호중구 Gφ 여기에 세포 잔재를 덮어에 의해, autophagocytosis를 통해 개발 기술 된 반면, 다양한 만성 염증성 질환, 20, 21과 관련된 후자의 형태로 멀티 핵 거대 세포는 대부분 모노 핵 남아 자신의 개발을 통해, 14 (드물게 그러나, 때로는 두 번째 핵)이 관찰 될 수있다. 또한, 제어 장치의 개수가 호중구 원점을 설정한다 : (1) expre특정 neutropilic 마커의 ssion과 수지상 및 단핵구 혈통 마커의 부재, 단핵구 (2) 자신의 방해 개발 / PMN 공동 문화, (3) 라이브 세포 이미징 및 시간에 의해 입증 식세포 (에서 문화 운동의 서로 다른 패턴 -lapse 현미경) 플라스틱 요리와 순수한 CD15 + / CD14에서 (5) 자신의 개발, 14 (4) 자신의 빛을 준수 - PMN 유동 세포 계측법에 의해 인수했다. 시험관 식별 된 기능 중 일부는 우리에게 생체 내에서 잠재적 기능에 대한 단서를 제공 할 수 있습니다. 선천성 면역 신호 전달 경로와 규제 상호 작용을 통해 염증 감소에 기여 자식 작용 단백질 22 - - 예를 들어, Gφ의 능력 호중구 과립 이물질 큰 액포의 존재 및 발현 LC3B 대량 소비 모두 지원 소거 능력. 이와 같이이러한 연구 결과는 또한 Gφ가 Mφ / DC 시스템이 부족하거나 압도 염증 부위에서 작동 할 수 있음을 나타냅니다, 따라서 염증의 해결에 기여한다. 이 개념은 혼합 단핵구 / 호중구 배양 Gφ 개발을 방해한다는 사실에 의해지지 될 수있다. (14) 또한, Gφ는, oxLDL 포착 수용체 (CD36, CD68)을 표현 oxLDL을 내면화하고, 응답으로 ROS를 생산, 그들이 염증을 해결하기 위해 동맥 경화 과정에 관여하는 것을 나타낼 수있다 주어진. Gφ는 IL-8으로 마이그레이션 호중구와 IL-8은 급성 염증 부위에 호중구 모집을 나타냅니다으로 내피 단일 층에서 호중구 &#39;윤회에서 개발 때문에이 연구 결과는 또한 항 염증 기능을 지원할 수있다. 반대로, 특정 염증성 질환에서 Gφ의 성능 기준에 기여하므로, 과립제 성분 및 ROS를 배출 할 수 있도록 수도일관된 염증과 조직 손상. (20) 그러나, 전체, 그들의 autophagic 능력 Gφ 가능성이 염증 반응을 감소보다는 그것을 영속에 참여하고 있음을 나타냅니다. 흥미롭게도 우리는 최근에 인간의 동맥 경화성 플라크의 Gφ의 존재를 확인했다. (준비). 그러나 질문의 ​​큰 숫자는 풀어 될 남아있다. 예를 들어, Gφ의 프로 또는 항 염증은? 시험 관내 또는 생체 내에서 자신의 형성과 기능을 결정하는 요소는 무엇인가? Gφ에 자신의 개발을 촉진 자신의 전구 세포가 특정되는 호중구 하위 집단인가? 그들은 특정 병리하고있는 관련 있는가? 종합적으로, 그 기원과 잠재적 기능에 대한 흥미로운 질문 포즈. 프로토콜 내에서 그러나 중요한 단계와 함정 염두에 보관해야합니다. Gφ의 난의 개발에서 중요한 단계들 사이토 카인, 성장 인자 또는 항생제의 중간없는에서 순수 호중구를 배양. 또 다른 중요한 단계는 Gφ가 오염 단핵 세포에서 개발하는 것을 배제하고 Gφ의 호중구 출처를 확인하는 것입니다. 마커 - 따라서, 불연속 구배에 의한 혈액 분리 한 후, 호중구 더 과립구 게이팅 및 CD15 + / CD14를 사용하여 유동 세포 계측법에 의해 정화의 추가 단계를 하였다. 현상 Gφ 추가의 정제 공정이 실시되지 않은 것과는 다르지 않았다 분리 유동 세포 계측법에 의해 정제 된 호중구로부터 획득. 따라서, 대부분의 실험으로 인해 추가적인 세포 손실로 정제 단계 유세포없이 수행 하였다. 참고로, 일부 드문 경우에 일부 호산구는 문화에 주목했다. 이들의 크기는 배양 기간 동안 변화가 없었다. 우리는 또한주의해야 그 방법의 숫자가 있지만인간의 혈액에서 호중구의 분리, 여기에 설명 된 방법은 우리가 사용하는 유일한 방법이며, 따라서 우리는 호중구 분리 가능한 다른 방법에 의해 Gφ 개발을 비교할 수 없습니다. Gφ 조사에서 가장 큰 함정은 다양한 생화학 적 분석에 적합한 순수 Gφ 인구의 충분한 숫자를 얻기 위해 무능력의 결과. 그것은 우리의 실험이 실시 된 조건에서 기본적으로 불가능하다. 첫째, Gφ의 수율이 낮다. 200 Gφ 혈액 기증자에 따라 문화 7 일 후에 개발 - 1.0 × 10 (6)에서 PMN 약 100 시드. 둘째, 접시 나머지 호중구 파편 문화 현상 Gφ을 분리 순간 기본적으로 곤란하다. 이러한 제한은 사실상 불가능 생화학 적 또는 분자 생물학적 방법에 의해 세포들을 분석 하였다. 따라서,이 프로토콜은 광을 이용하여 Gφ 식별 및 기능을 설명하기에 집중및 공 초점 현미경. 문화 Gφ에 호중구에서 이들의 형태 학적 변화는 라이브 세포 이미징 및 시간 경과 현미경으로 이어졌습니다. 14 분명히, 더 큰 혈액 볼륨을 얻을 낮은 수율을 생화학 적 또는 분자 생물학 방법을 구현하고 극복하기 위해와 접시에 호중구 &#39;파편에서 가능한 Gφ 분리에 필요할 수 있습니다. 요약하면, 우리는 최근 배양 처음 호중구 기원 장수 식세포의 서브 모집단을 Gφ의 발전을 설명 하였다. 위에서 언급 한 두 가지 제한 사항을 극복한다하더라도 따라서,이 배양 Gφ를 얻을 현재 사용할 수있는 유일한 방법이다합니다 (Gφ의 낮은 수율은 배양 얻어진 배양에서 호중구 파편 현상 Gφ를 분리 할 수 ​​없다는 요리). 그럼에도 불구하고,이 프로토콜에 제시된 자신의 준비와 식별, 된 essentia입니다더 Gφ의 잠재적 의미와 기능을 조사하기 위해, 염증 반응 및 호중구 생물학 및 소성에 관심이 과학자 리터.

다형 핵 호중구 (PMN)는 세포 독성 분자의 다양한 제조하여 병원체 침입을 우선적으로 보호로서, 혈중 백혈구의 가장 큰 집단을 구성한다. 전통적인보기는 긴 병원균과 유해 입자의 간극에 감염과 지원을 방지하기 위해 급성 염증 사이트에 도착 최초로 순환 혈액, 짧은 살았 전문 식세포,의를하고있다. 하나는 비 활성화 된 상태에서, 호중구 세포 사멸에 구조적으로 노력하고 있습니다. 염증 부위에 혈액에서 마이그레이션 할 때, 중성 백혈구는 염증을 해결하기 위해 정품 인증을받을. 이들은 탐식 및 호중구 엘라 스타 제 (NE)와 강력한 살균 활성을 카 텝신 같은 세포 독성 분자 등의 활성 산소 종 (ROS), 용균 효소들의 어레이를 생성함으로써, 미생물이 침입 죽인다. 트랩 병원균을 위해, 호중구는 세포 외 트랩 (그물을 해제) 항균 펩티드 및 다양한 용균 효소를 함유하는 핵 염색질 스레드를 구성한다. 그러나, 호중구에서 이러한 세포 독성 분자의 제어되지 않은 버전은 또한 염증 반응을 영속과 주변 조직의 손상을 야기 할 수 있음. 2 따라서, 대 식세포에 의한 세포 사멸 호중구의 효과적인 틈새 (Mφ)와 수지상 세포 (DC)는 염증을 해결하기 위해 매우 중요합니다. 3, 4, 5, 6 그러나 최근 몇 년 동안, 그것은 호중구가 매우 누구의 기능까지 식균 작용과 병원균을 죽이는 넘어 다양한 세포 것을 점점 더 분명되고있다. 프라이밍 또는 활성화가 진행함으로써 6, 7, 호중구 가소성 점차 주목 받고있다. 예를 들면, 마이코 박테리아 도전 호중구 나타났다면역 조절 반응의 존재를 제안, 인터루킨 (IL) -10을 분비와 염증 반응을 제어 할 수 있습니다. 8 포스트 유사 분열 호중구 Mφ 유사 세포 또는 분해함으로써 사이토 카인과 성장 인자, 9, 10로 처리시 항원 단편 제시 선천적 적응성을 통합에 중요한 역할을 제공함으로써 DC 유사 세포로 - 분화 트랜스 나타났다 응답. 도 3은, 성장 인자에 의해 6 활성화는 염증 부위에 이물질이 간극 염증의 해상도, 3, 9 Mφ / DC 통관 시스템 11 불충분하거나 압도 특히 12 용이하여 사멸 호중구 또는 세포 파편의 말림을 촉진 잠재적 인 '자율 규제'를 제안하는 것은 재를 도움염증 반응을 해결한다. 이것은, 이후 아폽토시스 세포 독성 화합물의 세포 외 방출을 억제하고, 따라서 주변 조직에 손상을 방지 할 수 규제 자기 죽음의 한 형태이다. 6 장기간 생존 호중구 활성화의 또 다른 특징이며, 예컨대 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구 - 대 식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 인터페론과 같은 염증성 사이토 카인 (각종 숙주 유래 인자로 처리함으로써 입증되었다 IFN) -γ, 종양 괴사 인자 (TNF) -α 및 / 또는 병원체 유래의 제품, 즉, 호중구 생존 반응을 조절할 수 있도록. 도 6은 실제로 호중구 생존율은 가소성을위한 필수 조건이며 탐식을 수행하는 능력과 관련이 있었다. 도 6에서, (13) 따라서, 또한 의존적이다 표현형 및 기능의 변화와 연관 나타났다호중구 수명 연장에 관여하는 새로운 단백질의 합성을 유도하여 상향 조절 된 유전자 발현 및 감소 세포 사멸에 DED. (10) 수명이 짧고 구성 적 문화에서 세포 자멸사를 받아야하거나 수명을 연장 한 상기 사이토 카인 / 성장 인자 활성화 된 호중구, 호중구는 달리, 우리는 최근 장기간의 표준 문화에 자발적으로 개발 호중구의 새, 작은 모집단을 확인했다 외부 사이토 카인 또는 성장 인자를 첨가하지 않고 갓 고립 된 인간 혈액 호중구에서 조건. (14) 문헌에서 이전에 설명하지 않은이 호중구 유래 세포,라고 한 거 식세포 (Gφ). Gφ 문화의 수명을 연장 한 그들은 완전히 5-7일에서 개발하고, 독특한 형태 학적 특징, 표현형의 발현과 기능을 특징으로한다. 그들은 크게 autophago로 인해 확대된다액포 죽은 호중구 잔재의 cytosis 및 포함 phagolysosomes. Gφ 특정 호중구 과립 마커를 표현 - 차별화 (CD) (66B)의 클러스터는 분홍 - 보라색의 과립 마커 - CD63 및 마이 엘 로퍼 옥시 다제 (MPO) 및 CD11b를, NE, CD15, 같은 추가 호중구 마커를 NADPH 산화 효소 서브 유닛 gp91- phox 및 p22- phox, 그리고 자식 작용 마커 -LC3BII. 14, 15 기능적으로, 그들은 적극적으로 라텍스 구슬과 자이 모산 입자 최대 가지고 가고, 자이 모산 및 포르 12 미리 스테이트 (13) - 아세테이트 (PMA) 자극에 반응하여 ROS를 생성합니다. 흥미롭게도, 신선한 호중구는 달리, Gφ도 집중적으로 스 캐빈 저 수용체 CD68 및 CD36 표현, 감기는 저밀도 지단백 (oxLDL)를 산화 및 oxLDL 자극에 반응하여 ROS를 생성합니다. 또한, Gφ는 단핵구 혈통 마커 CD14, CD16 및 CD163 또는 수지상 마커 CD1c 및 CD141없는 상태입니다. 또한, PHAgocytosis와 자식 작용 가능성 기능 NADPH 산화 효소는 개발을위한 전제 조건이다. 이 식균 작용 억제제의 cytochalsin의 B, 때문에, 자식 작용 억제제 3- 메틸 아데닌 (3-MA)과 bafilomycin (BafA1)와 NADPH 산화 효소 억제제 - 디 페닐 렌 요오드 (DPI)는 - 자신의 발전을 방지. 또한, 지속적인 저산소증에 호중구 적응은 분명 단핵구 / 호중구의 공동 문화뿐만 아니라 자신의 발전을 방해 간헐적 저산소증에 노출했다 반면. 14, 15 문화에서 그들의 제안 된 개발 본 논문에서는 그림 1 국지적 인 프로토콜에 도시는 단계별에게에서 Gφ의 준비를 설명 갓 인간의 혈액 호중구, 자신의 개발, 식별 및 몇 가지 기본적인 특성을 순환입니다. 이 프로토콜은 추가 조사를하고 폭 넓은 스펙트럼을 나타 내기 위해 사용될 수의 역할이 새롭게 설명과 흥미로운 호중구 유래 위해 Gφ하는 characteriz하기자신의 중요성과 잠재적 기능을 전자. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54826/54826fig1.jpg"> 그림 1 : 7 일 호중구 문화에 거대한 세포 개발의 도식 표현. 염증 부위에서 자식 작용 메커니즘을 트리거 핵 파편, 과립 (녹색과 빨간색 점)을 포함하는 조각 및 기타 세포 내 성분 (1) 호중구가 사멸 세포의 죽음을 받아야하고, (2) 분리 막 둘러싸여 것이 좋습니다. 기능 NADPH의 oxidase.They을 유지하는 것은 다양한 호중구 CD66b + / CD63 특징으로하는 동안 (3) 거 식세포 (Gφ), 세포 사멸 기관 및 호중구 파편을 내재화하여 사이토 카인이나 성장 인자없는 장기간의 호중구 문화 발전 + / MPO + / CD15 + / CD11b를 + / NE 마커, 과립 세포 파편 및 캐빈 수용체 CD36 및 CD68을 둘러싸는 큰 phagosomes. 기가 바이트1; 다양한 입자와 산화 LDL을 내면화 할 수있는 대부분의 단핵 세포, 그리고 ROS를 생성합니다. Gφ을 채우는 공포의 멤브레인은 자식 작용과 거대한 식세포 형성 사이의 엄격한 연결을 제안, (진한 파란색으로 표시) LC3B, autophagosomal 막의 마커를 포함한다. Gφ는 GM-CSF / IL-4를 포함하는 배지에서 개발하지 않습니다. 또한, 예 NADPH 산화 효소 억제제 억제제 - 디 페닐 요오도 늄 (DPI)는 자식 작용 억제제 3- 메틸 아데닌 (3-MA) ​​및 bafilomycin (BafA1) 및 포식 작용 억제제 사이토의 B (. 사이토 B)는 그 형성을 폐지. (4) 생체 내에서 잠재적 인 Gφ 기능 항 또는 프로 염증과 동맥 경화 과정에 참여를 (이 그림은 우리의 연구 결과 14, 15을 기반으로하고 B로 첨부 편집에서 수정 포함 할 수있다erton 20). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54826/54826fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>멸균 두피 정맥 세트 (21GX3/4)&nbsp;</td><td>바이오 진단 회사</td><td># 20080312</td><td>정맥 천자를 위한 엄격한 바늘</td></tr><tr><td>VACUETTE HOLDEX 일회용 홀더 PP</td><td>Greiner Bio-One</td><td># 450263</td><td>정맥 천자 중 고정을 위해&nbsp;</td></tr><tr><td>VACUETTE Tube K3E K3EDTA (16 x 100/9 mL)</td><td>Greiner Bio-One</td><td># 455036</td><td>채혈용 멸균 튜브</td></tr><tr><td>Nunclon MultiDish (24 well x 1 ml)</td><td>Thermo Scientific</td><td># 142475</td><td></td></tr><tr><td>폴리프로필렌 원추형 원심분리기 튜브 (50 ml)</td><td>Greiner Bio-One</td><td># E14103PJ</td><td></td></tr><tr><td>Transwell-24 well (transmigration assay)</td><td>Corning</td><td># CA-3415</td><td>폴리 카보네이트 멤브레인, 직경 6.5mm, 3 &mu; m 모공)&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI-1640 매체</td><td>BioIndustries</td><td># 01-100-1A</td><td>항생제를 추가하지 마십시오&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>EA.hy926 (ATCC CRL2922)&nbsp; &nbsp;</td><td>BioIndustries</td><td># CRL-2922</td><td></td></tr><tr><td>ATCC 제형 Dulbecco' S&nbsp; 변형된 독수리' s Medium</td><td>BioIndustries</td><td># 302002</td><td>완전 성장 매체</td></tr><tr><td>Polysucrose - Histopaque1119</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># 1119-1</td><td>조직 배양 등급</td></tr><tr><td>Polysucrose - Histopaque1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># 1077-1</td><td>조직 배양 등급&nbsp;</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS) - 이온 프리</td><td>BioIndustries</td><td># 02-023-1A</td><td>세포 생물학 및 분자 생물학 등급</td></tr><tr><td>열 불활성화 태아 송아지 혈청(HI-FCS)</td><td>BioIndustries</td><td># 04-121-1B</td><td>세포 생물학 등급 또는 조직 배양 등급, 낮은 LPS</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td># S3014</td><td>분자 생물학 등급, 세포 배양</td></tr><tr><td>파라포름알데히드에 적합, 16%</td><td>전자 현미경 과학</td><td># 15710</td><td>세포 생물학 등급 또는 조직 배양 등급 (단지 16% PFA)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># 9002-93-1</td><td>분자 생물학 등급&nbsp;</td></tr><tr><td>일반 염소 혈청</td><td>BioIndustries</td><td># 04-009-1</td><td>세포 생물학 및 분자 생물학 등급</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>BioIndustries</td><td># 031021B</td><td>조직 배양 등급&nbsp;</td></tr><tr><td>메이-Gr&uuml; nwald</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># MG500</td><td>세포 생물학 등급-(절차 번호 GS-10)</td></tr><tr><td>Giemsa 염색 키트</td><td>Sigma</td><td># 48900</td><td>세포 생물학 등급-(절차 번호 GS-10)</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>BioIndustries</td><td># 03090105</td><td></td></tr><tr><td>Human Interleukin-8 (CXCL8)</td><td>PeproTech</td><td># 200-08-5</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD14 (클론 5A3B11B5)</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td># sc-58951</td><td>Mouse IgG2b; monocytes</td></tr><tr><td>Anti-CD63 (clone MX-49.129.5)</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td># sc-5275</td><td>Mouse IgG1; 호중구</td></tr><tr><td>Anti-CD66b (clone 80H3)</td><td>AbD Serotec</td><td># MCA216</td><td>Mouse IgG1; 호중구에 의해 발현</td></tr>&<tr>nbsp;<td>Anti-CD1c (BDCA-1) (clone AD5-8E7)</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td># 130-090-695</td><td>Mouse IgG2a로 발현; 덴드리틱 세포</td></tr><tr><td>Anti-CD15 (clone MY-1)</td><td>Abcam</td><td># ab754</td><td>Mouse IgM; 호중구에 의해 발현됨</td></tr><tr><td>Anti-Cytochrome b-245 Light Chain (p22-phox) (clone 44.1)</td><td>BioLegend</td><td># 650001</td><td>Mouse IgG2a; 호중구 NADPH 산화효소 복합체</td></tr><tr><td>Anti-CD68</td><td>Protein Tech</td><td># 16192-1-AP</td><td>Rabbit IgG; oxLDL 청소제 수용체를 인식하기 위해&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-LC3B</td><td>Sigma</td><td># L7543</td><td>토끼 IgG&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Myeloperoxidase</td><td>Abcam</td><td># ab45977</td><td>Rabbit IgG</td></tr><tr><td>항호중구 엘라스타제</td><td>Calbiochem</td><td># 481001</td><td>Rabbit IgG&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-NOX2 (gp91-phox)</td><td>Abcam</td><td># ab131083</td><td>Rabbit IgG</td></tr><tr><td>Anti-CD36 (SR-B3)</td><td>Novus Biologicals</td><td># NB400-144</td><td>Rabbit IgG</td></tr><tr><td>Purified Mouse IgG1, &kappa; Isotype Control (clone MG1-45)</td><td>BioLegend</td><td># 401401</td><td>isotype control로 사용되는 항체</td></tr><tr><td>Purified Mouse IgG2a, &kappa; Isotype Control (clone MOPC-173)</td><td>BioLegend</td><td># 400263</td><td>isotype control로 사용되는 항체</td></tr><tr><td>Normal rabbit IgG</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td># sc-2027</td><td>isotype control로 사용되는 항체</td></tr><tr><td>CF488A Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Biotium&nbsp;</td><td># 20012</td><td>녹색 형광 염료 CF488A</td></tr><tr><td>CF647 염소 Anti-Rabbit IgG (H+L)Biotium을 사용한 Anti-Rabbit IgG</td><td>&nbsp;</td><td># 20043</td><td>적색 형광 염료를 사용한 Anti-Rabbit IgG CF647</td></tr><tr><td>CF488A 염소 Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Biotium&nbsp;</td><td># 20010</td><td>녹색 형광 염료를 사용한 안티 마우스 IgG CF488A</td></tr><tr><td>CF647 염소 안티 마우스 IgG (H + L)</td> <td>Biotium&nbsp;</td><td># 20040</td><td>적색 형광 염료 CF647 형광 장착 매체를 사용한 안티 마우스 IgG</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Vectashield H-1000; 벡터랩(주)</td><td># E19-18</td><td>핵 염색</td></tr><tr><td>컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 (LSM 700)&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>Ser.# 3523000380</td><td>Plan Apo 40X 이머젼 오일 목표&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Zeiss CLSM 소프트웨어 (ZEN 2010)</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td><td>버전 6.0</td><td>공동 국소화 분석</td></tr><tr><td>ImageJ 소프트웨어</td><td>Wayne Rasband, NIH, USA</td><td>버전 1.49k</td><td>세포 및 형광 강도 측정</td></tr><tr><td>광학 현미경 (Axiovert 25)</td><td>Carl Zeiss</td><td>Ser.# 201060153</td><td>배양 내 세포 검사</td></tr><tr><td>원심 분리기 (Megafuge 1.0 R)</td><td>Heraeus Instruments</td><td># D-37520</td><td>혈액에서 세포 분리; cytospins 준비</td></tr><tr><td>도립 형광 현미경 (Zeiss Axio Observer Z.1)</td><td>Carl Zeiss</td><td>Ser.# 3834001470</td><td>거대 식세포 발달 시연</td></tr><tr><td>온도 제어 배양 시스템 (Cube & Box)</td><td>Life Imaging Services</td><td></td><td>현미경용 온도 제어 시스템</td></tr><tr><td>높음&nbsp; 해상도 디지털 CCD 카메라 (AxioCam HRm)</td><td>Carl Zeiss</td><td>Ser.# 117090279</td><td>검사된 세포 물체에서 고대비&nbsp; 이미지 데이터를 캡처하기 위한</td></tr><tr><td>경우 소수성 장벽 펜(Elite PAP Pen)</td><td>Diagnostic Biosystems</td><td># K039</td><td>면역형광 염색을 위한 세포 둘레를 정의하기 위한</td></tr></tbody></table> 용도

인간 호중구 유래 거 식세포의 소설 모집단의 개발 및 식별 체외

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

호중구 (PMN)는 가장 병원균 미생물 침입에 대해 자신의 식세포 기능 알려져있다. 그들은 백혈구 사이와 구조적으로 세포 사멸하기 위해 최선을 다하고 있습니다 그들의 비 활성화 된 상태에서 짧은 반감기를 가지고있다. 염증을 해결하는 염증 부위로 보충하면, 이들은 강력한 항균 죽이는 세포 독성 분자의 배열을 생성한다. 이러한 강력한 세포 독성 분자가 제어되지 않는 방식으로 발표 될 때 그러나, 그들은 주변 조직에 손상을 줄 수 있습니다. 그러나 최근 몇 년 동안, 호중구 다양성은 점점 소성 및 면역 기능을 보여줌으로써, 입증된다. 최근 예컨대 과립구 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)와 같은 사이토 카인 / 성장 인자를 첨가하지 않고 표준 배양 조건에서 자연적 발전 새로운 호중구 유래 모집단 / 인터루킨 (IL)을 -4 확인했다. 호중구 나머지 자신의 탐식 능력은 크게 자신의 증가에 기여대단히 크기; 따라서 그들이라고 한 거 식세포 (Gφ). 호중구는 달리, Gφ은 오랫동안 문화에 살고있다. 그들은 차별화 (CD) 호중구 마커 CD66b / CD63 / CD15 / CD11b를 / 마이 엘 로퍼 옥시 다제 (MPO) / 호중구 엘라 스타 제 (NE)의 클러스터를 표현하고, / CD16 / CD163 및 수지상 CD1c / CD141 마커 단핵구 혈통 마커 CD14없는입니다 . 또한 라텍스와 자이 모산을-차지, 그리고 옵 소닌 - 자이 모산와 PMA로 자극에 산화 버스트에 의해 반응한다. Gφ 또한 캐빈은 CD68 / CD36 수용체 표현하고, 호중구는 달리, 산화 - 저밀도 지단백 (oxLDL)를 내면화. 또한, 신선한 호중구 또는 단핵구 배양 달리, 이들은 증가 된 활성 산소 종 (ROS)에 의해 생산 oxLDL 흡수에 반응한다. 또한 이러한 식세포는 자식 작용의 활성화를 나타내는 미세 소관 - 관련 단백질 1 빛 체인 3B (LC3B) 코팅 액포가 포함되어 있습니다. 특정 억제제를 사용하는 것은 그 식세포와 자식 작용 모두 prerequisi 것을 분명종속 ROS 산화 효소들이 개발 가능성이 NADPH에 대한 TES. 우리는 여기에서 배양 긴 수명, 호중구 유래 식세포 세포들이 식별 및 현재 알려진 특성의 새로운 모집단의 제조 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 획득 더욱 그 의미와 기능을 조사하기 위해 Gφ의 특성에 필수적이다.

문화 호중구 Autophagocytosis 개발 호중구 autophagocytosis와 문화 7 일 이내 Gφ에 자신의 개발도 3 및도 4에 도시되어있다. 일 4 - 7, 크기는 15 크게 확대했고 autophagosytosis 후 90 분 일찍로 분명했다 공동 배양 형광 막 얼룩 (PKH-26, 빨간색, PKH-67, 녹색)과 호중구를. 이러한 호중구 모집단에 대한 대조군으로서 14 약간 호중구 배양은 GM-CSF / IL-4로 처리 하였다. 전술 한 바와 같이 문화 14 일 - 사이토 카인 처리 된 세포는 7 내에서 크기가 증가했다. (18, 19) 그러나이 Gφ보다 작았 이전에 나보고 세포질 돌기 세포 (그림 5) DC-등을 닮은했다 Y OEHLER 등. (19) 또한, GM-CSF / IL-4 처리 된 세포는 15 명확 아니라 형태학 잠재적 기능 차이를 보여주는 음성이었다 또는 저 CD66b 발현했다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54826/54826fig3.jpg"> 그림 3 : 문화의 개발 거 식세포 (Gφ)에 Autophagocytosis. 갓 고립 된 정제 된 호중구는 PKH-67 (녹색) 또는 제로 시간에 PKH-26 (적색) 막 형광 염료, 다음 공동 배양으로 표시하고 7 일까지 추적 관찰 하였다. 세포를 유리 슬라이드 상에 방사 된 핵은 DAPI로 염색하고, 샘플은 공 초점 현미경으로 분석 하였다. Autophagocytosis 이미 공동 문화의 90 분 후 눈에 띈다. 노란색과 오렌지에 빨간색과 녹색의 병합 개발 Gφ에 명확하게 알 수있다.파일 / ftp_upload / 54826 / 54826fig3large.jpg "대상 ="_ 빈 "&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54826/54826fig4.jpg"> 그림 4 : 문화에서 거 식세포 (Gφ)의 개발. 갓 고립 된 정제 된 호중구는 문화 7 일까지 추적 관찰 하였다. 세포 Grunewald는 월 - 김사 염색 지정된 시간 간격으로 유리 슬라이드 상에 방사하고, 명 시야 현미경으로 분석 하였다. 몇 호산구와 개인은 비교를 위해 제시된다. 호산구의 크기가 문화를 그대로 유지합니다. 배율 100X 오일. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54826/54826fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54826/54826fig5.jpg"> 그림 5 : 문화에서 호중구 처리 된 거 식세포 (G의 φ)와 GM-CSF / IL의 개발 사이의 비교. (A) 월 그룬 왈드 - 김사 염색 호중구 (Gφ)없이 배양 7 일 동안 GM-CSF와 / IL-4. 샘플을 명 시야 현미경으로 분석 하였다. 확대, X40. 하지만 GM-CSF / IL-4는 널리 세포질 돌기로 보충 매체와 문화에 개발 된 세포 Gφ보다 작습니다. (B) 갓 절연 호중구 PKH-26 (적색) 염료로 표지 배양 사이토킨 배지에서 7 일간 또는 GM-CSF / IL-4로 보충 된 배지에서 PKH-67 (녹색) 염료로 표지 및 배양 하였다 7 일. 한 비와 공 배양 2 시간 동안 : 그 후, 발전 전지는 1로 혼합 하였다. 세포는 고정 및 공 초점 MICR로 분석 하였다oscopy. 이 그림은 참조에서 수정되었습니다. 15 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54826/54826fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 더 Gφ 개발의 과정을 조사하기 위해, 자신의 형태 학적 변화는 시간 경과 현미경으로 관찰 하였다. 비디오-1 (일 4 일 3) 및 비디오-2 (일 ~ 5 일 4) 정제 호중구 문화에서 자신의 발전을 보여줍니다. 이 Gφ 비 부착 또는 제한된 운동 능력 가볍게 부착 적극적으로 호중구의 잔해와 파편을 둘러싼 섭취한다. 비디오 3에서 단핵구 유래 Mφ 및 Gφ의 이동이 혼합 단핵구 / 호중구 배양과 비교된다. Mφ 적극적으로 (왼쪽, 레이블이없는 세포)를 크롤링합니다. Gφ (오른쪽), 밝은 PKH-26 표지 세포이다. 비디오 1 : - 시간 경과 현미경에 의해 4 일 3 정화 PMN 문화에서 거 식세포의 개발을 보여줍니다. 호중구는 반전 동력 형광 현미경으로 구성되어 시간 경과 microscopy.The 시간 경과 현미경 시스템에 의해 4 일까지 3 일에서 문화의 업을 따라 무대 인큐베이터에 고해상도 B / W CCD 카메라,되었다. 시간 경과의 이미지 캡처 인수는 매 10 분을 촬영했다. 원래 참조 (14)에 게시 된 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54826/Video-1.mpg" target="_blank">이 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54826/54826mov2.jpg"> 비디오 2 : - 티 5 일에 4 정제 된 PMN 문화에서 거 식세포의 개발 시연나 경과 현미경. 호중구는-따라 최대 시간 경과 현미경에 의한 일 5 일 4에서 문화에 있었다. 타임 랩스 현미경 시스템은 스테이지 배양기 상에 반전 동력 형광 현미경으로 구성되고, 높은 해상도 B / W의 CCD 카메라이다. 시간 경과의 이미지 캡처 인수는 매 10 분을 촬영했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54826/Video-2.mp4" target="_blank">이 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54826/54826mov3.jpg"> 비디오-3 : 거 대 식세포 및 공동 문화에서 개발 식세포. 공동 문화 단핵구 / 호중구는-따라 최대 시간 경과 현미경에 의한 일 5 일 4에서했다. 단핵구 유래 대 식세포 (왼쪽); 밝은 (PKH-26 스테인드 셀) 호중구 유래 거 식세포 (오른쪽). 비디오의 시간 경과 현미경 시스템은 역 동력 형광 MICR로 구성되어있다oscope, 무대 인큐베이터에 고해상도의 b / W CCD 카메라. 시간 경과의 이미지 캡처 인수는 매 10 분을 촬영했다. 원래 참조 (14)에 게시 된 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54826/Video-3.mp4" target="_blank">이 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 거 식세포의 마커의 발현 Gφ의 호중구 기원은 다음과 호중구 마커 CD66b / CD63 / MPO / NE / CD15 (그림 6)의 긍정적 인 표현에 의해 확인되었다. Gφ는 NADPH 산화 효소의 oxLDL 포착 수용체 발현 - CD68 및 CD36을, 그리고 자식 작용 마커의 존재를 입증 (LC3BII 15 웨스턴 블로 팅에 의해 식별) LC3B 코팅 공포 집계를 포함. 그러나 그들은 단핵구 혈통 (CD14, CD16 및 CD163) 및 dendrit에 대한 음성이었다Gφ가 오염 단핵 세포에서 발생하지 않았 음을 시사 IC에서 세포 (CD1c 및 CD141) 마커. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/54826/54826fig6.jpg"> 그림 6 : 문화의 7 일 후 거 식세포 (Gφ)에서 호중구, 단핵구 및 수지상 세포에 대한 다양한 마커의 발현. 호중구 특정 과립 마커 CD66b의 azurophil 과립 마커 CD63 및 MPO, 호중구 엘라 스타 제와 CD15의 긍정적 인 표현. 수지상 CD1c 및 CD141 마커와 단핵구 혈통 마커 CD14, CD16 및 CD163에 대한 부정적인 표현. 또한, Gφ은 자식 작용 마커 LC3B 표현의 스 캐빈 저 수용체 CD68 및 CD36와 NADPH 산화 효소 서브 유닛 gp91-phox / P22-phox 소단위. 핵은 DAPI로 염색하고, 샘플은 공 초점 현미경으로 분석 하였다. 이 그림은 참고 문헌에서 수정되었습니다. (14) 15 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54826/54826fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> Gφ의 기능 - NADPH 산화 효소 활성화, ROS 생산 및 탐식 : 라텍스 구슬의 식균 작용 및 옵 소닌 자이 모산은 Gφ에 분명했다. Gφ 또한 기초 ROS (도 7a)를 생성하고, 산화 버스트 (그림 7B-D)에 의해 자이 모산 및 PMA 자극에 반응했다. 그러나, 단핵구 또는 호중구는 달리, Gφ는 oxLDL 자극에 반응 또한 ROS 생성 및 오일 레드 O (그림 7B, F)에 의해 염색 하였다. 노트의 NADPH 산화 효소 억제제와 신선한 호중구의 치료 중 - DPI뿐만 아니라 ROS 생산뿐만 아니라, 페이지를 억제ROS 신호가 Gφ 형성에 필수적임을 시사 문화 revented Gφ 형성. 14 15 <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/54826/54826fig7.jpg"> 그림 7 : 산화 버스트, 탐식,과 거 식세포에 의해 oxLDL 통풍 관 (Gφ). (A) 바살 ROS 생산 Gφ의 리소좀에서 명백하다. 산화 LDL (oxLDL)에 응답 (B) ROS 생산, PMA와 자이 모산 (자이 모산 입자를 명확하게 설명되어 있습니다). 없이 PMA (슬라이드 흠,하지만 삽입 월 그룬 왈드 - 김사 염색된다)과 호흡 버스트 활동을 보여주는 Gφ에서 (C) Nitroblue 테트라 졸륨 (NBT) 테스트. (D) NBT 검사와 월 Grunewald는-김사는 NADPH 산화 효소와 활성 산소를 억제 PMA와 PMA / DPI와 Gφ 스테인드. L의 (E) 탐식PKH-26 (적색) 염색 된 세포의 ATEX와의 IgG-옵 소닌 자이 모산. 치료 및 oxLDL에서 (F) 오일 레드 O 염색은 Gφ 치료. 이 그림은 참고 문헌에서 수정되었습니다. 14, 15 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54826/54826fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 내피 세포의 맞은 편에 PMN의 윤회 잠재적 인 호중구에게 Gφ로 발전 할 수있는 하위 집단을 확인하기 위해, 내피 세포 단층을 통해 호중구의 이동 (그림 8A)를 측정 하였다. 90 분 후, 호중구 62.3 ± 12.2 %의 하부 구획에서 IL-8을 향해 내피 세포 transmigrated. 참고로, 비 마이그레이션 호중구 분획에서 개발 된 세포 반면 호중구의 transmigrated 인구에서만 개발 CD66b / CD15 / LC3B에 대한 긍정적 인 Gφ는 호중구 마커 크기가 작고 음성 인 CD66b / CD15 (그림 8B, 8C) . <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/54826/54826fig8.jpg"> 그림 8 : 거 식세포 (Gφ) 형성에 내피 세포를 통해 IL-8 종속 PMN 윤회의 효과. (A) IL-8 향해 내피 세포 단층되는 EC ()에 걸쳐 호중구 윤회 분석을 예시하는 방식. 이 분석은 급성 염증 부위에 호중구 모집의 모델로 간주 될 수 있습니다. (3 프로토콜에 지정된) 세포 이동 분석에서 - (C B), (B) transmigrating 비 마이그레이션 (C)의 호중구 FRACTIONS는 (프로토콜 1과) 성장 인자없이 이레 동안 배양 하였다. 이어서, 세포를 유리 슬라이드 상에 스핀 및 공 초점 현미경으로 분석 하였다. 고정 세포는 CD66b (적색), LC3B (녹색) 및 CD15 (빨간색)에 대한 염색 하였다. 핵은 DAPI (파란색)으로 염색 하였다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54826/54826fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

우리는 여기서 획득 및 호중구 유래 거 식세포의 새로운 특징 모집단을 식별하는 방법을 설명합니다. 이 세포는 신선한 인간의 혈액 호중구에서 문화를 개발하고, 식균 작용, 자식 작용, 상당히 큰 크기, 확장 된 수명을 특징으로한다. 이 방법은 또한 독특한 호중구 유래 모집단을 조사하기 위해 필수적이다.

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

이 방법의 전반적인 목표는 염증 및 항염증 면역 반응에서 이들의 역할을 조사하기 위해 순환하는 인간 호중구에서 유래한 체외 배양 거대 식세포를 생성하고 식별하는 것입니다. 이 방법은 장기적인 배양 조건을 유지하기 위해 인간 호중구에서 발달하는 거대 식세포의 새로운 하위 집단을 얻고 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 거대 식세포의 중요성과 기능을 추가로 조사하고 활성화 및 가소성에 대한 주요 질문에 답하는 데 사용할 수 있습니다.이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 연구 조교인 Eva Leder와 박사후 연구원인 Oksana Rogovoy입니다. 멸균 두피 정맥 세트를 사용하여 건강한 젊은 지원자로부터 최소 40ml의 정맥혈을 채취하십시오. 그런 다음 생물 안전성 층류 후드에서 혈액을 부드럽게 혼합합니다.전혈 샘플의 10-12 밀리리터 분취량을 24 밀리리터의 최종 부피로 2% 열 불활성화 FCS를 포함하는 예열된 ION-free PBS로 희석합니다. 그런 다음 혈액 샘플 분취액당 50ml 멸균 폴리프로필렌 원추형 원심분리 튜브 1개의 바닥에 12%밀리리터의 폴리수크로오스 1119를 추가한 다음 폴리슈크로스 1119 구배 용액 위에 12밀리리터의 폴리수크로오스 1077을 조심스럽게 층을 이룹니다. 희석된 혈액 24ml를 밀도 구배 용액의 개별 튜브에 조심스럽게 피펫팅하고 원심분리로 세포를 분리합니다.두 개의 결과 불투명 층이 관찰되어야 합니다. 각 튜브의 단핵 세포층에서 최대 0.5cm 위까지 유체를 버리십시오. 그런 다음 각 샘플의 단핵 세포를 하나의 새 튜브로 옮깁니다.다음으로, 다형성 핵 세포 또는 PMN 층에서 최대 0.5cm 위의 남은 유체를 버리고 각 샘플의 PMN을 다른 새 튜브로 옮깁니다. 2% 열 불활성화 FCS를 포함하는 PBS 30ml의 최종 부피로 PMN을 세척한 다음 3ml의 멸균 얼음, 차가운 저장성 0.2% 염화나트륨으로 적혈구를 용해합니다. 얼음 위에서 30초 동안 끓인 후 1.6%염화나트륨을 3ml의 멸균 얼음으로 만들어 등장성을 회복합니다.그런 다음 열 비활성화 FCS가 보충된 섭씨 37도 RPMI 1640 매체 6ml를 추가하고 원심분리로 세포를 수집합니다. 10% 열 비활성화 FCS가 보충된 4ml의 RPMI 1640에 펠릿을 재현탁합니다. 계수 후 농도를 배양 배지 밀리리터당 6번째 PMN의 1.25-1.5 곱하기 10으로 조정하고 웰당 1밀리리터의 세포를 24웰 플레이트의 개별 웰에 플레이트합니다.그런 다음 플레이트를 섭씨 37도의 가습된 5% 이산화탄소 인큐베이터에 넣고 배지의 절반을 3일마다 10% 열 비활성화 FCS가 보충된 새로운 RPMI 1640 배지로 부드럽게 교체하여 배양물을 공급합니다. 호중구는 배양 후 7일 이내에 거대 식세포로 분화합니다. 배양 7일차에 각 웰에서 배지의 절반을 조심스럽게 제거합니다.그런 다음 나머지 배지를 강력하게 피펫팅하여 가볍게 부착된 거대 식세포를 제거합니다. 각 처리 그룹의 2-4개의 웰에서 분리된 세포를 개별 15mm 원추형 튜브로 옮기고 원심분리를 통해 세포를 수집하여 튜브당 100-120마이크로리터의 배지에 펠릿을 재현탁합니다. 그런 다음 치료 그룹당 2-3개의 홀더에 현미경 슬라이드, 필터 카드 및 깔때기를 장착합니다.다음으로, 각 튜브의 전체 세포 부피를 적절한 Cytospin 깔때기에 추가합니다. 그런 다음 홀더를 Cytospin에 로드하고 슬라이드에 세포를 회전시킵니다. 스핀 슬라이드를 10 분 동안 건조시킵니다.그런 다음 물 안정 마커를 사용하여 세포 주위에 소수성 장벽을 그리고 실온의 화학 후드 아래에 4% 파라포름알데히드로 샘플을 고정합니다. 10분 후 세탁당 약 100마이크로리터의 PBS로 슬라이드를 세 번 짧게 헹굽니다. 그런 다음 PBS에 0.5%Triton X-100을 넣고 실온에서 10분 동안 세포를 투과시킨 다음 방금 설명한 대로 PBS를 5번 세척합니다.RPMI 1640 배지에 10% 일반 염소 혈청으로 적절한 기간 동안 비특이적 결합을 차단한 후 PBS 1회 세척합니다. 이제 습도를 유지하기 위해 상자에 소량의 물을 첨가한 다음 가습된 어두운 챔버에서 하룻밤 동안 섭씨 4도에서 약 100마이크로리터의 적절한 관심 항체로 세포에 라벨을 붙입니다. 다음으로, 단일 PBS 세척을 수행한 다음 적절한 형광 접합 2차 항체를 추가합니다.빛으로부터 보호된 실온에서 40분 후 샘플을 세척하여 과도한 항체를 제거하고 샘플당 장착 매체 한 방울과 커버슬립으로 슬라이드를 장착합니다. 40X 에머젼 오일 대물렌즈에서 30-120분 이내에 컨포칼 레이저 스캐닝 형광 현미경으로 슬라이드를 분석합니다. 그런 다음 적절한 소프트웨어를 사용하여 세포 면적, 형광 강도 및 공동 국소화(co-localization)를 계산합니다.배양 후 7일 이내에 거대 식세포로 호중구가 발달하는 것을 이 이미지에서 관찰할 수 있습니다. 자동 식세포작용(auto phagocytosis)은 호중구 배양 후 90분 이내에 뚜렷하게 나타나며, 4일에서 7일까지 세포 직경이 크게 확대된 형광막 염색이 나타납니다. 그러나 호중구 배양액에 GM-CSF와 IL-4가 보충되면 세포는 전체적으로 더 작은 직경과 수지상 세포와 유사한 세포질 돌기를 보여줍니다.배양 3-4일과 4-5일에 거대 식세포의 타임 랩스 현미경 검사는 주변 호중구 잔해와 파편을 활발하게 흡수하는 이동 능력이 제한된 세포가 없거나 약간 부착되어 있음을 보여줍니다. 이 혼합 단핵구 호중구 배양에서 활발하게 기어다니는 대식세포의 이동은 동일한 배양 웰에서 형광으로 표지된 거대 식세포의 거의 정지된 움직임과 비교할 수 있습니다. 거대 식세포의 호중구 기원은 호중구 마커가 없는 양성 발현과 단핵구 및 수지상 세포 마커의 발현 부족으로 확인할 수 있습니다.거대 식세포는 또한 기저 활성산소종을 생성하고 산화 버스트에 의한 자이모산 및 PMA 자극에 반응합니다. 그러나 단핵구나 호중구와는 달리, 이들은 산화된 저밀도 지단백질 자극에 산화 폭발에 의해 반응합니다. 이 기술을 숙달하면 6-7일 안에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 호중구 배양액을 공급할 때 배지의 절반을 부드럽게 교체하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 다른 염색 기술을 수행하여 이러한 흥미로운 세포의 추가 기능에 대한 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술은 호중구 생물학 분야의 연구자들이 호중구 활성화 및 가소성을 탐구하고 인간의 생리학적 및 병태생리학적 조건에서 생체 내에서 이러한 세포를 식별할 수 있는 길을 열 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 배양에서 거대 식세포를 얻고 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 사람의 혈액을 다루는 작업은 잠재적으로 감염될 수 있으며 이 절차를 수행할 때 장갑을 착용하고 모든 액체를 버리고 일회용 장비를 적절한 생물학적 위험 용기에 사용하는 것과 같은 예방 조치가 필수라는 것을 잊지 마십시오.

development-identification-novel-subpopulation-human-neutrophil

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

호중구 세포 트랩 (그물) 병원성 박테리아, 곰팡이 및 기생충에 대항하는 중요한 타고난 면역 메커니즘입니다. 여기 우리는 인간의 피를에서 호중구 granulocytes을 분리하고 그물을 형성 그들을 활성화하는 방법을 설명합니다. 우리는 빛과 전자 현미경의 그물을 시각화하기 위해 준비 기술을 제시한다.

호중구 세포 트랩 : 그들을 생성 및 시각화하는 방법

우리는 그들이 병원균을 phagocytose 또는 호중구 세포 트랩 (그물) 생성하는 동안 감염된 폐의 호중구 granulocytes의 역학의 관​​찰에 대한 2 광자 현미경을 사용하는 방법, 표시합니다.

2 광자 현미경을 사용하여 감염된 폐의 Neutrophils에 의해 Phagocytosis와 NET - 형성의 직접 관측

이 비디오는 호중구 세포 외 트랩(NET)을 생성하고 분리하는 시험관 기술을 보여줍니다. 호중구는 말초 혈액에서 분리되고 phorbol myristate acetate (PMA)로 자극되어 NET을 생성합니다. 배양 과정에서 호중구는 세포 사멸 과정(NETosis)을 거쳐 과립 세포질 단백질과 혼합된 응축된 염색질로 구성된 NET을 방출합니다.

인간 호중구 세포 외 트랩을 생성하는 In vitro 기술

호중구는 침입하는 미생물에 대한 숙주 방어뿐만 아니라 종양 세포의 면역 감시에도 중요한 역할을 합니다. 여기에서는 항종양 특성을 가진 호중구의 분리와 관련된 기술과 in vitro 및 in vivo에서 항종양 호중구 기능을 모니터링하는 방법에 대해 설명합니다.

항 종양 특성을 가진 분리 및 호중구의 특성

호중구는 백혈구 중 가장 풍부한 유형입니다. 밀도 구배 분리 방법에 의한 인간 혈액에서 호중구의 분리 및 과립구 경로를 따른 인간 전골수구(HL60) 세포의 분화가 여기에 설명되어 있습니다. 항림프종제에 대한 림프종 세포의 민감도에 대한 역할을 테스트합니다.

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

이 논문은 phagosomal의 pH 및 영역뿐만 아니라 비율 적 지표 seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, 또는 S-1을 사용하여 인간 및 마우스 호중구의 세포 내 pH를 측정하는 간단한 방법을 설명한다. 이 라이브 셀 공 초점 형광 현미경 및 이미지 분석을 사용하여 얻을 수있다.

호중구 Phagosome 이미징 및 세포질은 비례의 pH 표시기를 사용하여

여기, 선물이 조직학 고정/permeabilized 섹션에서 호 중구의 존재를 감지 하 고 라이브 순화 된 호 중구의 활성화 상태를 평가 하는 프로토콜. 특히, MUB40 펩타이드 lactoferrin neutrophil 및 3 차과 립에 바인딩합니다. Permeabilization 또는 호 중구 활성화 통해과 립 내용의 노출 호 중구의 마킹 할 수 있습니다.

Neutrophil 중재 염증 이벤트 감지에 사용 하기 위해 MUB40 펩 티 드

이 프로토콜은 전혈, 버피 코트 또는 백혈구 막에서 호중구를 분리하여 좋은 수율, 높은 순도 및 최소한의 세포 활성화를 달성하는 방법을 자세히 설명합니다. 그라데이션 정제, 적혈구(RBC) 퇴적물 및 RBC 용액을 활용하여 고품질/순도 호중구 제제를 획득합니다.

전신 혈액과 버피 코트에서 인간의 호중구의 격리

이 프로토콜은 다양한 신호 전달 경로의 기능을 포괄하는 스크리닝 방법으로 사용되는 호중구 기능 분석 세트를 특징으로 합니다. 이 프로토콜에는 세포 생존율, 순도, 활성 산소 종 생산, 실시간 이동, 식세포작용 및 호중구 세포외 트랩에 대한 예비 제안에 대한 초기 및 간단한 평가가 포함됩니다.

호중구 기능에 대한 간략한 개요를 위한 일련의 스크리닝 기법

이 원고는 최적의 호중구 생존력과 높은 라이브러리 품질을 보장하는 것을 목표로 쥐 골수에서 호중구의 ATAC-seq 라이브러리를 준비하기 위한 프로토콜을 간략하게 설명합니다. BMC 준비, 면역자기 분류 및 라이브러리 구축에 대한 단계별 지침을 제공하여 특히 호중구 연구를 처음 접하는 사람들에게 유용한 가이드 역할을 합니다.

ATAC-Seq Library Preparation of Murine Bone Marrow-Derived Neutrophils(쥐 골수 유래 호중구의 ATAC-Seq 라이브러리 준비)

저밀도 호중구(LDN)는 여러 질병에서 크게 증가합니다. LDN은 일반적으로 세포 분류를 통해 분리됩니다. 순수하고 실행 가능한 LDN을 얻는 실용적인 방법을 제시합니다. 말초 혈액의 밀도 구배 원심분리 후 세포를 자성 마이크로비드와 함께 배양한 다음 LDN을 자기 컬럼을 통해 분리합니다.

저밀도 호중구의 효율적인 정제를 위한 신속한 자기-마이크로비드 방법

배우세요 인간 호중구에서 거대 식세포를 배양하고 식별하는 방법을 통해 면역 반응을 연구하세요. 이 기술은 세포 활성화와 가소성을 조사하는 데 활용됩니다.

인간 호중구 유래 거 식세포의 소설 모집단의 개발 및 식별 체외

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