인간 호중구 유래 거 식세포의 소설 모집단의 개발 및 식별 체외

이 방법의 전반적인 목표는 염증 및 항염증 면역 반응에서 이들의 역할을 조사하기 위해 순환하는 인간 호중구에서 유래한 체외 배양 거대 식세포를 생성하고 식별하는 것입니다. 이 방법은 장기적인 배양 조건을 유지하기 위해 인간 호중구에서 발달하는 거대 식세포의 새로운 하위 집단을 얻고 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 거대 식세포의 중요성과 기능을 추가로 조사하고 활성화 및 가소성에 대한 주요 질문에 답하는 데 사용할 수 있습니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 연구 조교인 Eva Leder와 박사후 연구원인 Oksana Rogovoy입니다. 멸균 두피 정맥 세트를 사용하여 건강한 젊은 지원자로부터 최소 40ml의 정맥혈을 채취하십시오. 그런 다음 생물 안전성 층류 후드에서 혈액을 부드럽게 혼합합니다.

전혈 샘플의 10-12 밀리리터 분취량을 24 밀리리터의 최종 부피로 2% 열 불활성화 FCS를 포함하는 예열된 ION-free PBS로 희석합니다. 그런 다음 혈액 샘플 분취액당 50ml 멸균 폴리프로필렌 원추형 원심분리 튜브 1개의 바닥에 12%밀리리터의 폴리수크로오스 1119를 추가한 다음 폴리슈크로스 1119 구배 용액 위에 12밀리리터의 폴리수크로오스 1077을 조심스럽게 층을 이룹니다. 희석된 혈액 24ml를 밀도 구배 용액의 개별 튜브에 조심스럽게 피펫팅하고 원심분리로 세포를 분리합니다.

두 개의 결과 불투명 층이 관찰되어야 합니다. 각 튜브의 단핵 세포층에서 최대 0.5cm 위까지 유체를 버리십시오. 그런 다음 각 샘플의 단핵 세포를 하나의 새 튜브로 옮깁니다.

다음으로, 다형성 핵 세포 또는 PMN 층에서 최대 0.5cm 위의 남은 유체를 버리고 각 샘플의 PMN을 다른 새 튜브로 옮깁니다. 2% 열 불활성화 FCS를 포함하는 PBS 30ml의 최종 부피로 PMN을 세척한 다음 3ml의 멸균 얼음, 차가운 저장성 0.2% 염화나트륨으로 적혈구를 용해합니다. 얼음 위에서 30초 동안 끓인 후 1.6%염화나트륨을 3ml의 멸균 얼음으로 만들어 등장성을 회복합니다.

그런 다음 열 비활성화 FCS가 보충된 섭씨 37도 RPMI 1640 매체 6ml를 추가하고 원심분리로 세포를 수집합니다. 10% 열 비활성화 FCS가 보충된 4ml의 RPMI 1640에 펠릿을 재현탁합니다. 계수 후 농도를 배양 배지 밀리리터당 6번째 PMN의 1.25-1.5 곱하기 10으로 조정하고 웰당 1밀리리터의 세포를 24웰 플레이트의 개별 웰에 플레이트합니다.

그런 다음 플레이트를 섭씨 37도의 가습된 5% 이산화탄소 인큐베이터에 넣고 배지의 절반을 3일마다 10% 열 비활성화 FCS가 보충된 새로운 RPMI 1640 배지로 부드럽게 교체하여 배양물을 공급합니다. 호중구는 배양 후 7일 이내에 거대 식세포로 분화합니다. 배양 7일차에 각 웰에서 배지의 절반을 조심스럽게 제거합니다.

그런 다음 나머지 배지를 강력하게 피펫팅하여 가볍게 부착된 거대 식세포를 제거합니다. 각 처리 그룹의 2-4개의 웰에서 분리된 세포를 개별 15mm 원추형 튜브로 옮기고 원심분리를 통해 세포를 수집하여 튜브당 100-120마이크로리터의 배지에 펠릿을 재현탁합니다. 그런 다음 치료 그룹당 2-3개의 홀더에 현미경 슬라이드, 필터 카드 및 깔때기를 장착합니다.

다음으로, 각 튜브의 전체 세포 부피를 적절한 Cytospin 깔때기에 추가합니다. 그런 다음 홀더를 Cytospin에 로드하고 슬라이드에 세포를 회전시킵니다. 스핀 슬라이드를 10 분 동안 건조시킵니다.

그런 다음 물 안정 마커를 사용하여 세포 주위에 소수성 장벽을 그리고 실온의 화학 후드 아래에 4% 파라포름알데히드로 샘플을 고정합니다. 10분 후 세탁당 약 100마이크로리터의 PBS로 슬라이드를 세 번 짧게 헹굽니다. 그런 다음 PBS에 0.5%Triton X-100을 넣고 실온에서 10분 동안 세포를 투과시킨 다음 방금 설명한 대로 PBS를 5번 세척합니다.

RPMI 1640 배지에 10% 일반 염소 혈청으로 적절한 기간 동안 비특이적 결합을 차단한 후 PBS 1회 세척합니다. 이제 습도를 유지하기 위해 상자에 소량의 물을 첨가한 다음 가습된 어두운 챔버에서 하룻밤 동안 섭씨 4도에서 약 100마이크로리터의 적절한 관심 항체로 세포에 라벨을 붙입니다. 다음으로, 단일 PBS 세척을 수행한 다음 적절한 형광 접합 2차 항체를 추가합니다.

빛으로부터 보호된 실온에서 40분 후 샘플을 세척하여 과도한 항체를 제거하고 샘플당 장착 매체 한 방울과 커버슬립으로 슬라이드를 장착합니다. 40X 에머젼 오일 대물렌즈에서 30-120분 이내에 컨포칼 레이저 스캐닝 형광 현미경으로 슬라이드를 분석합니다. 그런 다음 적절한 소프트웨어를 사용하여 세포 면적, 형광 강도 및 공동 국소화(co-localization)를 계산합니다.

배양 후 7일 이내에 거대 식세포로 호중구가 발달하는 것을 이 이미지에서 관찰할 수 있습니다. 자동 식세포작용(auto phagocytosis)은 호중구 배양 후 90분 이내에 뚜렷하게 나타나며, 4일에서 7일까지 세포 직경이 크게 확대된 형광막 염색이 나타납니다. 그러나 호중구 배양액에 GM-CSF와 IL-4가 보충되면 세포는 전체적으로 더 작은 직경과 수지상 세포와 유사한 세포질 돌기를 보여줍니다.

배양 3-4일과 4-5일에 거대 식세포의 타임 랩스 현미경 검사는 주변 호중구 잔해와 파편을 활발하게 흡수하는 이동 능력이 제한된 세포가 없거나 약간 부착되어 있음을 보여줍니다. 이 혼합 단핵구 호중구 배양에서 활발하게 기어다니는 대식세포의 이동은 동일한 배양 웰에서 형광으로 표지된 거대 식세포의 거의 정지된 움직임과 비교할 수 있습니다. 거대 식세포의 호중구 기원은 호중구 마커가 없는 양성 발현과 단핵구 및 수지상 세포 마커의 발현 부족으로 확인할 수 있습니다.

거대 식세포는 또한 기저 활성산소종을 생성하고 산화 버스트에 의한 자이모산 및 PMA 자극에 반응합니다. 그러나 단핵구나 호중구와는 달리, 이들은 산화된 저밀도 지단백질 자극에 산화 폭발에 의해 반응합니다. 이 기술을 숙달하면 6-7일 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 호중구 배양액을 공급할 때 배지의 절반을 부드럽게 교체하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 다른 염색 기술을 수행하여 이러한 흥미로운 세포의 추가 기능에 대한 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술은 호중구 생물학 분야의 연구자들이 호중구 활성화 및 가소성을 탐구하고 인간의 생리학적 및 병태생리학적 조건에서 생체 내에서 이러한 세포를 식별할 수 있는 길을 열 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 배양에서 거대 식세포를 얻고 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 사람의 혈액을 다루는 작업은 잠재적으로 감염될 수 있으며 이 절차를 수행할 때 장갑을 착용하고 모든 액체를 버리고 일회용 장비를 적절한 생물학적 위험 용기에 사용하는 것과 같은 예방 조치가 필수라는 것을 잊지 마십시오.