호중구 Phagosome 이미징 및 세포질은 비례의 pH 표시기를 사용하여

이 논문은 phagosomal의 pH 및 영역뿐만 아니라 비율 적 지표 seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, 또는 S-1을 사용하여 인간 및 마우스 호중구의 세포 내 pH를 측정하는 간단한 방법을 설명한다. 이 라이브 셀 공 초점 형광 현미경 및 이미지 분석을 사용하여 얻을 수있다.

이 컨포칼 현미경 기술의 전반적인 목표는 호중구 식세포 액포 및 세포질의 pH와 면적을 이미지화하는 것입니다. 이 방법을 사용하면 phagocytic 액포 및 세포질의 pH와 phagocytic 액포의 부피의 동적 변화를 모니터링하고 정량화할 수 있습니다. 이러한 측정은 NADPH 옥시다제의 활성에 따라 변화하며, 그 기능과 식세포 액포의 막을 가로지르는 이온 플럭스의 대리 마커로 사용할 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 phagosome과 cytoplasm을 모두 pH 범위가 넓은 염료로 동시에 이미지화할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시작하려면 50 마이크로 그램의 고급 DMSO에 50 마이크로 그램을 희석하여 카르복시 -S-1 숙시니 미딜 에스테르의 부분 표본을 준비하십시오. 잘 섞기 위하여 소용돌이.

다음으로, 15 밀리리터 튜브에 0.1 몰 중탄산 나트륨에 1 곱하기 10 또는 HK 칸디다의 1 밀리리터를 준비합니다. 2, 000 RPM에 소용돌이에 섞는 동안 HK Candida에 carboxy-S-1의 100 마이크로리터를 한 번에 1개의 하락 추가하십시오. 그 후 튜브를 알루미늄 호일로 감싸고 실온의 롤러에 1시간 동안 놓습니다.

한 시간 후 HKC-S-1을 2, 250g에서 원심분리로 3회 10분씩 세척합니다. 처음 두 번의 세척을 위해 펠릿을 15ml의 0.1 몰 중탄산 나트륨에 다시 현탁시킵니다. 세 번째 세척 후 1ml의 BSS 버퍼에 다시 현탁합니다.

HKC-S-1 현탁액을 100마이크로리터 분취액 튜브로 옮기고 영하 20도에서 보관합니다. 인간 호중구에 대한 HKC-S-1을 옵소니화하려면 100마이크로리터의 해동된 HKC-S-1에 100마이크로리터의 인간 IGG 혈청을 첨가합니다. 섭씨 37도의 히트 쉐이커와 1, 1000RPM의 히트 셰이커에서 60-90분 동안 혼합한 다음 롤러에서 섭씨 4도에서 2시간 동안 혼합합니다.

그 후, 17, 000 번 g에서 원심분리에 의해 BSS 버퍼에서 샘플을 3 번 세척하십시오. 그런 다음 100마이크로리터의 BSS 버퍼에 샘플을 다시 현탁시킵니다. 인간적인 말초 혈액 호중구를 위해, 건강한 기증자에게서 venipuncecture에 의하여 혈액의 15 밀리리터를 가지고 가고 1, 밀리리터 당 000 IU에 헤파린 나트륨 해결책의 90 마이크로리터를 포함하는 20 밀리리터 주사기로 옮깁니다.

피펫 팁을 사용하여 1.5ml의 10% 덱스트란 용액을 주사기에 주입합니다. 부드럽게 세 번 뒤집은 다음 30-60분 동안 벤치에 똑바로 세워 두십시오. 30분에서 60분 후, 혈액은 대략 반으로 나뉘며, 빨대 색깔의 위쪽 담황색 털 층과 적혈구가 포함된 아래쪽 층이 있어야 합니다.

바늘을 통해 상단 층을 조심스럽게 밀어 내거나 피펫 팁으로 제거한 다음 15 밀리리터 튜브로 옮기고 빨간색 층을 제거하지 마십시오. 5 밀리리터 피펫을 사용하여 3-4 밀리리터의 밀도 구배 매체를 버피 코트 층 아래의 튜브 바닥에 추가하여 두 개의 뚜렷한 층을 얻습니다. 그 후, 샘플을 900 회 g에서 10 분 동안 원심 분리한다.

상등액을 붓고 빨간 펠릿은 남겨 둡니다. 그런 다음 펠릿을 방해하기 위해 부드럽게 소용돌이칩니다. 다음으로, 펠릿에 7ml의 증류수 오토클레이브를 넣고 20초 동안 뒤집어 펠릿을 다시 현탁시킵니다.

그런 다음 2x 식염수 7ml를 넣고 몇 번 뒤집어 혼합하고 남은 적혈구를 용해한 다음 샘플을 300배 g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 붓고 펠릿을 BSS 완충액에 약 4배, 10배, 밀리리터당 6배로 다시 현탁합니다. 이 절차에서는 실온에서 40-60분 동안 각 웰에 200마이크로리터의 폴리-L-라이신이 있는 8웰 현미경 플레이트를 전처리한 다음 폴리-L-라이신을 제거하고 200마이크로리터의 증류수로 웰을 두 번 세척합니다.

다음으로, 준비된 세포 현탁액 200마이크로리터를 각 웰에 첨가하고 실온에서 30-60분 동안 배양합니다. 그 후, 100 마이크로 리터의 고급 DMSO를 튜브와 와류에 첨가하여 혼합하여 S-1-AM 에스테르의 부분 표본을 준비합니다. 작은 튜브에 1.7ml의 BSS 버퍼와 20마이크로리터의 S-1-AM을 넣고 혼합물을 와류로 가열합니다.

그 후, 200마이크로리터의 BSS 완충액으로 웰을 두 번 세척하고 완충액을 S-1-AM 용액으로 교체합니다. 우물 바닥에 부착된 세포 단층을 방해하지 않도록 우물 벽 아래로 액체를 부드럽게 피펫으로 쏟아내십시오. 그런 다음 샘플을 실온에서 최소 25분 동안 배양합니다.

그런 다음 200마이크로리터의 BSS 버퍼로 웰을 두 번 세척합니다. 억제제를 테스트하려면 BSS 완충액에 적절한 약물의 마스터 믹스를 구성하고 이 약물로 웰을 두 번 세척합니다. 다음으로, 옵소니화된 HKC-S-1을 5미크론에서 약 3초 동안 초음파 처리하고 각 웰에 10마이크로리터를 첨가한 다음 플레이트를 섭씨 37도에서 15-20분 동안 배양하여 세포를 식세포작용 스냅샷으로 이미지화할 수 있도록 합니다.

컨포칼 현미경을 사용하여 세포가 555나노미터에서 여기되고 560-600나노미터 및 610나노미터 이상에서 두 개의 검출기로 방출이 감지되도록 레이저 파장을 조정합니다. 다음으로, 63X 오일 이멀젼 렌즈를 사용하여 세포를 봅니다. 연속 설정에서 타일 스캔 이미지를 사용하여 가운데 타일을 봅니다.

형광 강도와 검출기 채널의 게인을 사용하여 레이저의 초점과 강도 및 두 채널의 게인을 조정하여 이미지를 최적화합니다. 그런 다음 설정을 사용하여 이미지를 분할하여 두 채널을 모두 봅니다. 실험을 시작하기 전에 세포질 또는 액포에 빨간색 점으로 나타날 수 있는 형광 강도의 포화 상태가 없는지 확인하십시오.

그렇다면 레이저 강도를 줄여 빨간색 점의 수를 최소화하되 세포와 식체는 볼 수 있을 만큼 밝고 선명합니다. 이 절차에서는 ImageJ를 열고 분석을 위해 선택한 이미지 파일을 도구 모음에 로드합니다. 두 채널을 결합하려면 Image, Color, Make Composite를 차례로 사용합니다.

마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 결과를 저장할 파일을 선택합니다. 그런 다음 도구 모음에서 Line Tool을 클릭하고 두 번 클릭하여 너비를 2로 늘립니다. 식체의 너비를 가로질러 선을 그린 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 pH를 측정합니다.

세포질 pH는 세포질을 가로질러 선을 긋는 것과 같은 방식으로 측정할 수 있습니다. 측정을 마친 후 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 파일 저장을 선택합니다. phagosome 영역을 측정하려면 도구 모음을 따라 있는 네 번째 아이콘을 사용하여 영역 주위를 자유롭게 그립니다.

그런 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 Measure Area를 선택합니다. 다음은 pH에 해당하는 S-1 염색 식체의 대략적인 색상에 대한 정성적 시각적 열쇠입니다. 노란색은 산도가 높다는 것을 나타내고 빨간색은 알칼리도가 높다는 것을 나타냅니다.

이 이미지는 식세포작용 20분 후 Hvcn1 채널이 결핍된 마우스 결합 골수 호중구를 보여줍니다. 식체는 매우 붉고 알칼리성이며 부풀어 오릅니다. 여기서 빨간색 화살표는 세포 내 칸디다(intracellular candida)를 가리키고, 이 화살표는 세포 외 칸디다(extracellular candida)를 가리킵니다.

이 이미지는 칸디다균을 섭취한 야생형 마우스 골수 호중구를 보여줍니다. 그들은 Hvcn1 녹아웃 호중구보다 훨씬 덜 알칼리성입니다. 이 이미지는 식세포작용 후 같은 시점에 있는 인간 말초 혈액 호중구를 보여줍니다.

이들은 마우스 야생형 세포보다 약간 더 알칼리성으로 보이지만 식체는 여전히 Hvcn1 녹아웃 세포만큼 크고 붉지 않으며, 이 이미지는 5마이크로몰 디페닐렌 요오도늄의 존재 하에서 칸디다균을 식세포화한 인간 호중구를 보여줍니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 약 4-5시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 호중구가 활성화되지 않도록 호중구를 분리할 때 주의해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

액포 또는 세포질 pH 또는 액포 부피의 변화에 대한 영향이 호흡 파열의 변화로 인한 것인지 여부를 결정하기 위해 이 호흡 파열은 자유 라디칼 생성 또는 산소 소비량을 직접 측정하는 다른 방법으로 측정할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 인간 호중구를 분리한 다음 식체와 세포질을 염색하고 이미지화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 사람의 혈액 샘플로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑과 보호복을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.