호중구 Phagosome 이미징 및 세포질은 비례의 pH 표시기를 사용하여

이 공초점 현미경 기술의 전반적인 목표는 호중구 식세포 공포와 세포질의 pH 및 면적을 이미지화하는 것입니다. 이 방법을 통해 식세포 공포와 세포질 내 pH의 동적인 변화와 식세포 공포의 부피를 모니터링하고 정량화할 수 있습니다. 이러한 측정값은 NADPH oxidase의 활성에 따라 변화하며, 해당 효소의 기능 및 식세포 공포 막을 통한 이온 흐름의 대리 마커로 사용될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 넓은 pH 범위를 갖는 염료를 사용하여 파고솜과 세포질을 동시에 이미징할 수 있다는 점입니다. 이 절차를 시작하려면, 50 µg의 carboxy-S-1 succinimidyl ester를 100 µL의 고순도 DMSO에 희석하여 분주액을 준비하십시오. 보텍스로 충분히 섞어줍니다.

다음으로, 15 mL 튜브에 0.1 M 탄산수소나트륨에 포함된 1 × 10⁸ heat killed 또는 HK Candida 1 mL를 준비합니다. 2,000 RPM으로 볼텍싱하며 섞으면서 HK Candida에 carboxy-S-1 100 µL를 한 방울씩 첨가합니다. 그 후, 튜브를 알루미늄 호일로 감싸고 실온의 롤러 위에 1시간 동안 둡니다.

1시간 후, 2,250 ×g에서 10분씩 3회 원심분리하여 HKC-S-1을 세척합니다. 처음 두 번의 세척 시에는 펠렛을 15 mL의 0.1 M 중탄산나트륨에 다시 현탁합니다. 세 번째 세척 후에는 1 mL의 BSS 완충액에 다시 현탁합니다.

HKC-S-1 현탁액을 100 µL씩 튜브에 분주하여 -20 °C에서 보관하십시오. 사람 호중구를 위해 HKC-S-1을 옵소닌화하려면, 해동된 HKC-S-1 100 µL에 사람 IgG 혈청 100 µL를 추가하십시오. 이를 37 °C, 1,000 RPM의 히팅 쉐이커에서 60~90분 동안 혼합한 후, 4 °C의 롤러에서 2시간 동안 혼합하십시오.

그 후, 17,000 ×g에서 1분씩 세 차례 원심분리하여 샘플을 BSS 완충액으로 세척합니다. 이어서 샘플을 100 µL의 BSS 완충액에 다시 현탁합니다. 인간 말초혈액 호중구의 경우, 건강한 기증자로부터 정맥 천자를 통해 혈액 15 mL를 채취하여 1,000 IU/mL 농도의 heparin sodium 용액 90 µL가 들어 있는 20 mL 주사기로 옮깁니다.

피펫 팁을 사용하여 10% dextran 용액 1.5 milliliters를 시린지에 주입합니다. 세 번 가볍게 뒤집어 섞은 후, 벤치 위에 세운 상태로 30분에서 60분 동안 그대로 둡니다. 30분에서 60분 후, 혈액은 대략 절반으로 나뉘며, 상단에는 밀짚색의 buffy coat 층이 형성되고 하단에는 erythrocytes가 포함된 층이 형성됩니다.

바늘을 통해 상층액을 조심스럽게 밀어내거나 피펫 팁으로 제거한 다음, 적혈구 층이 섞이지 않도록 주의하며 15 milliliter 튜브로 옮깁니다. 5 milliliter 피펫을 사용하여 튜브 바닥의 백혈구 층(buffy coat layer) 아래에 3~4 milliliter의 밀도 구배 매질을 첨가하여 두 개의 뚜렷한 층이 형성되도록 합니다. 이어서 샘플을 900 ×g에서 10분 동안 원심 분리합니다.

상청액을 따라내고 붉은색 펠렛만 남깁니다. 그 다음, 펠렛을 가볍게 볼텍싱하여 풀어줍니다. 이어서 펠렛에 7 mL의 멸균 증류수를 가하고 20초 동안 도립 혼합하여 펠렛을 재현탁합니다.

그 다음, 2x 식염수 7 mL를 첨가하고 몇 번 뒤집어 섞어 남은 적혈구를 용해시킨 후, 시료를 300 ×g에서 5분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 따라내고 펠렛을 BSS 버퍼에 재현탁하여 mL당 약 4 × 10⁶이 되도록 합니다. 이 과정에서, 8-웰 현미경 플레이트의 각 웰에 200 µL의 poly-L-lysine을 넣고 상온에서 40~60분 동안 전처리한 후, poly-L-lysine을 제거하고 200 µL의 증류수로 웰을 두 번 세척합니다.

다음으로, 준비된 세포 현탁액 200 µL를 각 웰에 추가하고 상온에서 30분에서 60분 동안 배양합니다. 그 후, 튜브에 고순도 DMSO 100 µL를 추가하고 볼텍싱하여 혼합함으로써 S-1-AM 에스테르의 분주액을 준비합니다. 작은 튜브에 BSS 버퍼 1.7 mL와 S-1-AM 20 µL를 추가하고 혼합물을 볼텍싱합니다.

그 후, 웰을 200 µL의 BSS 버퍼로 두 번 세척하고 버퍼를 S-1-AM 용액으로 교체합니다. 액체를 웰 벽면을 따라 부드럽게 피펫팅하여 웰 바닥에 부착된 세포 단층이 손상되지 않도록 주의하십시오. 이어서, 시료를 실온에서 최소 25분 동안 배양합니다.

그 후, 200 µL의 BSS buffer로 웰을 두 번 세척합니다. 억제제를 테스트하려면 BSS buffer에 적절한 약물을 혼합하여 마스터 믹스를 만들고, 이를 사용하여 웰을 두 번 세척합니다. 다음으로, 옵소닌화된 HKC-S-1을 5 µm에서 약 3초 동안 초음파 처리한 후 각 웰에 10 µL씩 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 37 °C에서 15~20분 동안 배양하여 세포가 식세포 작용 스냅샷 이미징 준비가 되도록 합니다.

공초점 현미경을 사용하여 세포가 555 nanometers에서 여기되고, 방출광이 560~600 nanometers 및 610 nanometers 이상의 두 가지 검출기에서 검출되도록 레이저 파장을 조절하십시오. 다음으로, 63X 오일 침수 렌즈를 사용하여 세포를 관찰하십시오. 연속 설정의 타일 스캔 이미지를 사용하여 중앙 타일을 관찰하십시오.

형광 강도와 검출기 채널의 게인을 이용하여 레이저의 초점 및 강도와 두 채널의 게인을 조절하여 이미지를 최적화하십시오. 그 후, 설정을 통해 이미지를 분할하여 두 채널을 모두 확인하십시오. 실험을 시작하기 전에 세포질이나 액포에 형광 강도 포화가 없는지 확인하십시오. 포화된 부분은 빨간색 점으로 나타납니다.

만약 그렇다면, 적색 점의 수를 최소화하면서도 세포와 파고솜이 충분히 밝고 선명하게 보일 때까지 레이저 강도를 낮추십시오. 이 절차에서 ImageJ를 열고 분석을 위해 선택한 이미지 파일을 툴바에 로드합니다. 두 채널을 병합하려면 Image, Color, 그다음 Make Composite를 사용하십시오.

마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 결과물을 저장할 파일을 선택하십시오. 다음으로 툴바에서 Line Tool을 클릭하고 더블 클릭하여 너비를 2로 늘립니다. 파고솜의 너비에 걸쳐 선을 그린 후 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 pH를 측정하십시오.

세포질을 가로지르는 선을 그어 동일한 방식으로 세포질 pH를 측정할 수 있습니다. 측정이 끝나면 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 파일 저장(Save File)을 선택하십시오. 파고솜 면적을 측정하려면 툴바의 네 번째 아이콘을 사용하여 해당 면적 주변을 자유형으로 그리십시오.

그 다음, 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 Measure Area를 선택합니다. 여기 pH에 따른 S-1 염색 파고솜의 대략적인 색상을 나타내는 정성적 시각 기준표가 있습니다. 노란색은 더 높은 산성을 나타내며, 빨간색은 더 높은 알칼리성을 나타냅니다.

이 이미지는 식세포 작용 20분 후 Hvcn1 채널이 결핍된 마우스 골수 중성구의 모습을 보여줍니다. 파고좀은 매우 붉고 알칼리성이며 부어 오른 것처럼 보입니다. 여기서 빨간색 화살표는 세포 내 Candida를 가리키며, 이 화살표는 세포 외 Candida를 가리킵니다.

이 이미지는 Candida를 섭식한 야생형 마우스 골수 중성구의 모습을 보여줍니다. 이들은 Hvcn1 녹아웃 중성구보다 알칼리성이 훨씬 낮습니다. 이 이미지는 식세포 작용 후 동일한 시점의 인간 말초혈액 중성구를 보여줍니다.

이들은 생쥐 야생형 세포보다 약간 더 알칼리성으로 보이지만, 식포의 크기가 Hvcn1 녹아웃 세포만큼 크거나 붉지는 않으며, 이 이미지는 5 µM diphenylene iodonium 존재 하에 Candida를 식세포한 인간 호중구를 보여줍니다. 숙련되면, 적절히 수행했을 때 이 기술은 약 4~5시간 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 호중구가 활성화되지 않도록 분리 과정에서 주의하는 것이 중요합니다.

액포 또는 세포질의 pH 변화나 액포 부피 변화에서 관찰되는 효과가 호흡성 burst(respiratory burst)의 변화로 인한 것인지 확인하려면, 자유 라디칼 생성 또는 산소 소비량을 직접 측정하는 다른 방법으로 이 호흡성 burst를 측정할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 인간 호중구를 분리하고 phagosome과 세포질을 염색 및 이미징하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 인간 혈액 샘플을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 실험 절차를 수행하는 동안에는 항상 장갑과 보호복을 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.