수평 유전자 전달의 연구에 대한 방법론 황색 포도상 구균

이 절차의 전반적인 목표는 세 가지 주요 전달 경로를 해결하여 황색포도상구균에서 DNA의 수평 전달을 연구하기 위한 자세한 방법론을 제공하는 것입니다. Conjugation, transduction 및 natural transformation(변형)을 참조하십시오. 이 방법은 인간 병원균 포도상구균에서 항생제 내성 유전자의 수평 전달에 관한 것입니다.

여기에 소개된 기술의 주요 장점은 최근에 발견된 자연 유전자 변형을 포함하여 세 가지 주요 전달 모드를 테스트할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 연구실의 박사 과정 학생인 Le Thuy가 될 것입니다. 실험을 시작하려면 트립틱 콩 육수에 공여자와 수혜자 박테리아의 하룻밤 배양액 5ml를 준비합니다. 또는 각각 리터당 32mg의 클로람페니콜이 있거나 없는 TSB 배지.

섭씨 37도에서 흔들림. 다음날, 하룻밤 배양의 광학 밀도를 새로운 TSB 배지가 있는 광학 밀도로 조정합니다. 0.5 밀리리터의 공여체 배양액과 0.5 밀리리터의 수혜자 배양액을 혼합합니다.

그리고 혼합물에 1ml의 인산염 완충 식염수 또는 PBS를 첨가합니다. 그런 다음 진공 펌프 시스템을 사용하여 박테리아 혼합물을 0.45마이크로미터 필터 멤브레인으로 옮깁니다. 양 혈액 한천 플레이트에 필터 멤브레인을 놓습니다.

접시를 섭씨 37도에서 하루 동안 배양합니다. 플레이트에서 필터 멤브레인을 꺼내 PBS 10ml에 매달아 놓습니다. 혼합물을 약 1분 동안 소용돌이쳐 멤브레인에 부착된 모든 박테리아를 수집합니다.

새로운 TSB로 박테리아 현탁액을 연속 10배 희석합니다. TSB 한천에 0, 10, 4 희석 된 샘플을 100 마이크로 리터로 도금합니다. 또는 TSA 플레이트에 클로람페니콜 리터당 32mg과 테트라사이클린 리터당 8mg을 보충하여 트랜스접합체를 선택합니다.

100마이크로리터의 희석된 현탁액을 TSA 플레이트에 플레이트하고 테트라사이클린만 리터당 8밀리그램으로 만듭니다. 총 수신자 수를 계산합니다. 배양 후, 콜로니 PCR에 의한 CFR 유전자의 존재 여부와 감수성 프로파일에 대한 이중 저항성 콜로니를 분석합니다.

표준 미세희석법(microdilution method) 또는 디스크 확산법(disc diffusion)에 따라 적절한 항생제의 최소 억제 농도(MIC)를 측정하여 항생도를 측정합니다. transconjugants의 감수성 프로파일은 수용자와 동일해야 합니다. 클로람페니콜 및 CFR 유전자의 영향을 받는 기타 화합물은 제외됩니다.

공여자 균주에 의해 발달된 테트라사이클린 내성을 배제합니다. 칼슘 3.6 밀리몰이 보충된 영양 육수 5ml에 N315-45를 하룻밤 배양합니다. 50 밀리리터 유리 바이알에 10 밀리리터의 최종 부피에서 하룻밤 배양을 1에서 1, 000으로 희석하여 하위 배양을 준비합니다.

섭씨 37도에서 1시간 동안 180회씩 흔들면서 박테리아를 성장시킵니다. 다음으로 NB 염화칼슘 배지에 일련의 희석된 파지 MR83a를 준비합니다. 20마이크로리터의 희석된 파지를 박테리아 배양액에 추가합니다.

박테리아 세포 성장에 대한 양성 대조군 역할을 하기 위해 파지 감염이 없는 대조군 배양을 준비합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 분당 100회씩 부드럽게 흔들면서 배양물을 성장시킵니다. 다음 날, 첨가된 파지의 희석률이 가장 높은 하나 또는 두 개의 투명화된 배양 바이알을 선택합니다.

배양물을 15ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 튜브에 250마이크로리터의 클로로포름을 추가하고 뒤집어서 배양물을 완전히 혼합합니다. 섭씨 4도에서 20분 동안 5, 000배 G에서 배양을 원심분리하십시오.

상층액을 새 튜브에 옮기고 사용할 때까지 섭씨 4도에서 보관하십시오. 영양 육수 한천 배지를 준비하고 섭씨 55도의 수조에서 따뜻하게 유지하십시오. 고압 멸균된 0.5몰 염화칼슘 용액을 배지에 최종 농도 3.6밀리몰까지 추가합니다.

90mm 페트리 접시 NB 염화칼슘 플레이트에 붓습니다. 섭씨 37도에서 NB 염화칼슘 5ml에 N315를 흔들어 하룻밤 배양합니다. 다음날 10 마이크로 리터의 야간 배양을 200 마이크로 리터의 NB 염화칼슘에 넣고 NB 염화칼슘 플레이트에 고르게 펴 바릅니다.

접시 표면이 액체로 덮여 있을 때 퍼지는 것을 멈춥니다. 그런 다음 접시를 5분 동안 건조시킵니다. NB 염화칼슘 배지를 사용하여 이전에 제조된 파지를 1 - 10 희석하여 연속적으로 만듭니다.

박테리아로 덮인 플레이트에 각 파지 희석액 3마이크로리터를 발견합니다. 섭씨 30도에서 밤새 접시를 배양합니다. 다음 날 아침, 플라크 수를 세고 다음 방정식을 사용하여 파지 역가를 계산합니다.

N315, COL 또는 MU50을 섭씨 37도에서 NB 염화칼슘 5ml에 분당 180회 회전으로 흔들어 하룻밤 배양합니다. 하룻밤 배양 후 NB 염화칼슘의 파지를 밀리리터당 109PFU로 희석합니다. 50ml 유리 바이알에 500마이크로리터의 하룻밤 배양액, 500마이크로리터의 신선한 NB 염화칼슘, 1밀리리터당 1밀리리터의 파지 109 PFU를 혼합합니다.

혼합물을 섭씨 37도에서 30분 동안 분당 100회전으로 부드럽게 흔들어 배양합니다. 배양 후 50마이크로리터의 20%시트르나트륨을 배양액에 첨가합니다. 섭씨 37도에서 30분 동안 부드럽게 흔듭니다.

녹은 뇌 심장 주입 또는 BHI 한천 배지를 준비하고 섭씨 55도의 수조에 보관하고 한천 배지를 클로람페니콜 리터당 32mg으로 처리합니다. 그런 다음 박테리아 파지 혼합물을 100ml 플라스크로 옮깁니다. 따뜻한 BHI 한천 50ml에 클로람페니콜 1리터당 32mg을 넣고 잘 섞는다.

혼합물을 90mm 페트리 접시에 붓습니다. 접시를 섭씨 37도에서 배양합니다. 생성된 콜로니(transductants)에 대한 내성을 위해 콜로니를 리터당 32mg의 클로람페니콜(chloramphenicol)이 보충된 새로운 BHI 한천 플레이트(BHI 한천 플레이트)로 옮겨 저항성을 위해 추가로 테스트합니다.

colony PCR에 의한 CFR 유전자의 존재를 확인합니다. 수혜자 세포를 섭씨 37도에서 5ml의 TSB에 넣고 흔들면서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 0.5ml의 하룻밤 배양을 1.5ml 튜브로 옮깁니다.

원심분리로 세포를 침전시킵니다. 그런 다음 50 밀리리터 튜브에 10 밀리리터의 CS2 배지로 세포를 현탁시킵니다. 다음으로 박테리아를 섭씨 37도에서 성장시키며 후기 지수 단계까지 8시간 동안 분당 180회전으로 흔들어 성장시킵니다.

원심분리로 세포를 수확합니다. 상등액을 버리고 10ml의 새로운 CS2 배지에 세포를 재현탁합니다. 정제된 플라스미드 또는 게놈 DNA 10마이크로그램을 세포 현탁액에 추가합니다.

분당 180회전으로 배양을 흔듭니다. 그런 다음 원심분리로 세포를 수집합니다. 10ml의 BHI 배지에 세포를 재현탁합니다.

대조 실험에서 세포 현탁액을 90ml의 용융된 BHI 한천 보충제와 리터당 32mg의 클로람페니콜, 리터당 5마이크로그램의 테트라사이클린과 혼합합니다. 혼합물을 90mm 페트리 접시에 붓고 빠르게 식힌 다음 한천이 굳어지도록 합니다. 이쑤시개를 사용하여 적절한 항생제가 들어 있는 플레이트에 집락을 복제하여 내성 특성을 확인합니다.

접합 프로토콜은 표피포도상구균(Staphylococcus epidermidis)이 CFR 공여체로 사용된 종 내 전달에 유용합니다. 그리고 황색포도상구균 N315 균주를 수용자로 사용하였다. 종간 전달에 사용되는 프로토콜은 서로 다른 접합 공여체에서 동일한 접합 벡터를 사용하여 유사한 결과를 산출합니다.

이 논문은 자연적 변형에 대해 자세히 설명한 첫 번째 논문입니다. 제공된 방법론은 연구자가 항생제 내성의 전파 및 확산뿐만 아니라 인간 병원균인 황색포도상구균의 주요 결정 요인을 연구하는 데 유용할 것입니다.