Name: 고처리량 시퀀싱을 위한 그람 음성 박테리아에 트랜스포슨 삽입 라이브러리 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: 학습하세요 그람 음성 박테리아에서 포화 트랜스포슨 돌연변이 라이브러리를 생성하는 방법을. Acinetobacter baumannii를 사용하여 필수 유전자와 항생제 내성 인자를 식별하고 새로운 항균 치료제 개발을 위한 표적을 발굴합니다.

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A. baumannii는 colistin,,,10,11,12, 23,,24,2330, 31과같은 "최후의 라인"치료에 대한 AMR의 급속한 인수로 인해 글로벌 공중 보건에 새로운 위협이되고30있습니다., 최근 수십 년 동안 Tn-seq는 수많은 세균 종에 걸쳐 유전자형 표현형 상호 작용을 해명하고 세균 유전학34,,35,,42,...

항생제의 발견은 의심 할 여지없이 20세기의 가장 영향력있는 건강 관련 사건 중 하나입니다. 항생제는 심각한 세균 감염을 신속하게 해결할 뿐만 아니라 현대 의학에서도 중추적인 역할을 합니다. 신생아 의과 및 화학요법의 주요 수술, 이식 및 어드밴스는 생명을 위협하는 감염에 취약한 환자를 남겨두고 이러한 치료법은 항생제1,,2없이는 불가능할 것이다. 그러나, 인간 병원체 중 항생제 내성의 급속한 발달 및 확산은 항생제3의모든 임상적으로 중요한 클래스의 효능을 현저히 감소시켰습니다. 한 번 쉽게 항생제 치료로 삭제 된 많은 세균 성 감염, 더 이상 글로벌 공중 보건에 심각한 위협을 일으키는 고전적인 치료 프로토콜에 응답하지않습니다 1. 항균 성 내성 (AMR)은 치료 기간4,,5에관계없이 세균 세포가 항생제의 치명적인 농도에서 성장하는 곳입니다. AMR을 조절하는 분자 및 생화학적 요인을 이해해야 하는 긴급한 필요성이 있으며, 이는 대체 항균 발달을 안내하는 데 도움이 될 것입니다. 특히, ESKAPE 병원체는 임상 환경에서 문제가 있으며 광범위한 AMR과 관련이 있습니다. 여기에는 Enterococcus faecium, Staphylococcus 아우레우스, K렙시엘라 폐렴, 시네토박터바우마니, P수도모나스 아에루기노사 및 Enterobacter spp가 포함됩니다. 몇몇 기계장치는 ESKAPE 병원체에 있는 AMR에 기여하는 동안, 후자의 4개의 유기체는 그람 음성입니다.
그람 음성 박테리아는 불리한 환경 조건으로부터 그들을 보호하는 정의 외부 막을 조립합니다. 외부 막은 항생제와 같은 독성 분자의 진입을 세포로 제한하는 투과성 장벽역할을 합니다. 다른 생물학적 멤브레인과 달리 외부 막은 비대칭입니다. 외부 전단지는 표면에 노출된 리포폴리사카라이드로 풍부하고, 내부 전단지는 인지질6의혼합물이다. 지질성 당항 분자는 지질 이중층7내에 내장된 보존된 지질 A moiety에 의해 외부 막에 고정된다. 에세리치아 대장균 리포폴리사카라이드의 정식 지질 은 대부분의 그램 음성 박테리아의 성장에 필요하며 그람 음성 유기체에서 가장 근본적이고 보존된 통로 중 하나인 9단계 효소 경로에 의해 합성된다6,,7,,8.
다묘신은 외막을 교란시키고 세포를 분해하기 위해 지질 A 도메인을 표적으로 하는 양이온 항균 펩티드입니다. 폴리마이신의 양전하 잔류물과 음전하 지질 A 인산염 군 사이의 정전기 상호 작용은 궁극적으로 세포사멸9,,10,,11,,12,,13로이어지는 세균세포막을 방해한다. Colistin (polymyxin E)는 아신토박터 baumannii14,,15,,16과같은 다약물 내성 그람 음성 외유성 병원균으로 인한 감염을 치료하는 데 사용되는 최후의 수단 항균제이다. 1947년에 처음 발견된 폴리마이신은 토양 박테리아인 파니바실러스 폴리멕사17,,18,,19에의해 생산된다. 다각형은 중요한 신증후군 및 신경독성20,,21의보고 때문에 그들의 임상 사용이 제한되기 전에 년 동안 그람 음성 감염을 취급하기 위하여 처방되었습니다.
A. baumannii는 최근 수십 년 동안 환자 결과의 이환율과 사망률을 극적으로 증가시킨 nosocomial Gram 음성 병원체입니다22. 한 때 저위협 병원체로 여겨졌던 것은, 이제 AMR을 취득하는 놀라운 능력과 전염병23,,24의고위험 때문에 전 세계적으로 병원 취득한 감염에 대한 중요한 위험을 제기합니다. A. baumannii는 미국에서 nosocomial 감염의 10% 이상을 차지합니다. 질병은 폐렴, 세균, 요로 감염, 피부 및 연조직 감염, 뇌막염 및 내막염(25)으로나타납니다. A. baumannii 감염에 대한 치료 옵션은 β- lactams, 불소 퀴놀론, 테트라사이클린 및 아미노 글리코 사이드23,,24를포함하여 거의 모든 항생제 클래스에 대한 저항으로 인해 감소되었습니다. 다약물 내성, 광범위하게 약물 내성 및 범약 내성 A. baumannii 격리의 보급은 colistin 치료에 부활을 주도하고있다, 이는 여전히 다약물 내성 A. baumannii에대한 효과적인 몇 가지 남아있는 치료 옵션 중 하나가 될 것으로 생각되었다. 그러나, A. baumannii 격리 중 증가 된 colistin 저항은 글로벌 공중 보건,10,11,,12,13,27,,,,30,,31에대한 위협을 더욱 증폭시켰다.30
트랜스포슨 시퀀싱(Tn-seq)과 같은 고처리량 시퀀싱 기술의 최근 발전은 시험관 내 및 생체 내 세균 적합성에 대한 이해를 증진시키는 중요한 도구를 제공했습니다. Tn-seq는 박테리아에서 유전자형 표현형 상호 작용을 연구하기 위해 활용할 수 있는 강력한 도구입니다. Tn-seq는 기존의 트랜스포손 돌연변이 발생과 대규모 병렬 시퀀싱을 결합하여 삽입 부위를 빠르게 매핑하는 세균 병원체 전반에 광범위하게 적용되며, 이는 DNA 돌연변이를 게놈 전체 척도32,,33,,34,35에대한 페노티픽 변이체에 연결하는 데 사용될 수 있다., 트랜스포슨 돌연변이 발생 방법은 이전에 설명되었지만 일반적인 단계는33과유사합니다. 첫째, 삽입 라이브러리는 트랜스포슨 돌연변이 발생을 사용하여 생성되며, 인구 내의 각 세균 세포는 게놈 DNA(gDNA) 내의 단일 트랜스포슨 삽입으로 제한됩니다. 돌연변이 발생 에 따라 개별 돌연변이가 풀로 들어오게됩니다. gDNA는 삽입 돌연변이 풀에서 추출되고 트랜스포슨 접합은 증폭되고 고처리량 시퀀싱을 받습니다. 판독은 게놈에 매핑될 수 있는 삽입 부위를 나타냅니다. 체력을 감소시키는 트랜스포슨 삽입은 인구에서 빠르게 떨어지고 유익한 삽입은 풍부합니다. Tn-seq는 유전자가 스트레스33에서세균 성 피트니스에 미치는 영향에 대한 이해를 증진시키는 데 중요한 역할을해 왔습니다.
pJNW684에 인코딩된 히마1 마리너 트랜스포슨 시스템은 트랜스포슨 돌연변이 발생을 목적으로 특별히 제작및 최적화되었다. 그것은 A. baumannii에서 트랜스포슨 삽입 돌연변이의 선택에 사용되는 카나마이신 저항 유전자를 측면에 선원- 가족 트랜스 포슨을 포함한다. 또한 트랜스포사제 인코딩유전자(36)의발현을 구동하는 A. baumannii 특정 프로모터를 인코딩한다. 마리너기반 트랜스포슨은 또한 삽입37의판독 다운스트림을 방지하는 카나마이신 저항 유전자의 하류에 두 개의 번역 종기를 포함한다. pJNW684는 또한38을복제하기 위해 기증자 균주에 의해 기여된 λpir 유전자를 필요로 하는 복제의 RP4/oriT/oriR6K-조건부 기원을 전달한다. λpir 유전자가 없는 경우, 전치 기계를 운반하는 pJNW684 벡터는 A. baumannii 수신자 균주10,,36,,38에서복제할 수 없다. 따라서, 세균성 컨쥬게이션 도중, 트랜스포지온만이 트랜스포지아제 유전자를 운반하는 플라스미드의 배경 삽입 없이 수신자 게놈에 삽입된다. 이것은 플라스미드와 함께 트랜스포지아제 활동의 손실이 수신자 게놈에 삽입되면 트랜스포슨이 다른 위치로 이동하는 것을 방지하는 단일, 안정적인 전치 이벤트에서 결과하기 때문에 중요합니다.
pJNW648은 또 다른 그램 음성 유기체인 대장균에서의활성을 테스트하였다. 대장균 균주 W3110에서 포화 Tn-seq 라이브러리의 성공적인 조립은 시스템이 엔테로박테리아를 포함한 광범위한 병원균에서 돌연변이 발생을 수행할 수 있음을 나타냈다. 또한 트랜스포세아제 발현을 구동하는 A. baumannii 특정 프로모터는 종별 프로모터와 신속하게 교환할 수 있습니다. 마지막으로, 카나마이신 저항 유전자는 연구 중인 유기체의 AMR 표현형에 따라 다른 저항 카세트로 교환될 수 있다.
A. baumannii에서 colistin 저항에 기여하는 한 가지 요인은 박테리아가 비 치명적인 수준에서 선택적 압력에 노출되는 불충분한 복용량의 관리입니다39. 여러 보고서는 억제 항균 농도가,전체 세균,집단11,12,30,31의감수성을 감소시키기 위해 세포 생리학을 변화시키는 조절된 반응을 유도할 수 있음을 보여주었다., Tn-seq를 사용하여, 우리는 A. baumannii 균주 ATCC 17978에 있는 colistin 저항을 조절하는 요인을 발견10 및 colistin의 억제 농도에 노출 한 후.10 이 예제에서는 선원기반 트랜스포슨제품군(40,,41)을사용하여 포화 트랜스포손 돌연변이 라이브러리의 구성 및 농축을 간소화하는 Tn-seq 방법을 자세히 설명합니다. 여러 Tn-seq 프로토콜은 20,000 - 100,000 돌연변이35,,42,,43,,44,,45,,46을생성하는 반면, 본원에 설명된 프로토콜은 400,000+ 돌연변이의 트랜스포슨 라이브러리를 신속하게 생성할 수 있으며, 이는 대략10개의베이스 10쌍의 아포 스트랜톤 삽입과 동일합니다. A. baumannii 또한, 라이브러리 크기를 크게 추가없이 확장할 수 있습니다. 이 방법은 또한 최종 라이브러리 다양성을 줄일 수있는 제한 엔토넥션, 어댑터 결찰 및 젤 정화에 대한 요구 사항을 제거합니다.

<table><tbody><tr><td>10 mM ddCTP, 2',3'-Dideoxycytidine-5'-Triphosphate</td><td>Affymetrix</td><td>77112</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dCTP 2'-Deoxycytidine-5'-Triphosphate</td><td>Invitrogen</td><td>10217-016</td><td></td></tr><tr><td>100bp DNA Ladder 분자량 마커</td><td>Promega</td><td>PR-G2101</td><td></td></tr><tr><td>100mm x 15mm 페트리 접시</td><td>Corning</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>150mm x 15mm 페트리 접시</td><td>코닝</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>1X B& W</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>희석 2X B& W를 절반으로 줄여 1X B&W를 얻습니다.</td></tr><tr><td>2,6-Diaminopimelic acid</td><td>Alfa Aesar</td><td>B2239103</td><td>600 &micro에서 사용됩니다. M</td></tr><tr><td>2X 흑백 W</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>물에 2M NaCl, 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA (pH 7.5)를 추가합니다. Streptavidin 비드와 함께 사용됩니다. 용액은 실온에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>50mL 원뿔형 멸균 폴리프로필렌 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-271</td><td></td></tr><tr><td>9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTP</td><td>N/</td><td>A N/A</td><td>9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml 물. -20°C에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>AccuPrimeTM Pfx DNA 중합효소</td><td>Invitrogen</td><td>12344</td><td></td></tr><tr><td>Acinetobacter baumannii ATCC 17978</td><td>ATCC</td><td>N/A</td><td>AmpS, KanS</td></tr><tr><td>Ampicillin (100 mg/L)</td><td>100 mg/L</td>AMPure XP PCR 정제 시스템에서 사용되는 <td>Fisher Scientific</td><td>BP1760</td></tr><tr><td></td><td>BECKMAN COULTER</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>BioAnalyzer</td><td>Agilent</td><td>G2939B</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer 고감도 DNA 분석</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Deoxynucleotide 용액 혼합물(dNTP)</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 마그네틱 랙</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>E.coli MFD Dap-N</td><td>/A</td><td>N/A</td><td>DAP Auxotroph, 성장하려면 600mM의 외인성 첨가 DAP가 필요합니다. 플라스미드 전달을 위한 RP4 기계가 포함되어 있습니다. JNW68용 캐리어(36).</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>A4094</td><td></td></tr><tr><td>외부 스레드 극저온 바이알</td><td>코닝</td><td>09-761-71</td><td></td></tr><tr><td>유리 구슬</td><td>코닝</td><td>72684</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>G33</td><td></td></tr><tr><td>접종 루프</td><td>피셔 사이언티픽 피셔 사이언티픽</td><td>22-363-602</td><td>스크래핑 도구</td></tr><tr><td>카나마이신</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>906 mg/L</td><td></td></tr> <tr><td>LB 한천에서</td> 사용 BP25, Miller <td>Fisher Scientific</td><td>BP1425</td><td></td></tr><tr><td>LB 육수, Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>LoTE</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>물에 3mM Tris-HCl, 0.2mM EDTA(pH 7.5)를 추가합니다. Streptavidin 비드와 함께 사용됩니다. 용액은 실온에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>용해 완충액</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>9.34 mL TE 완충액; 10% SDS 600 ml; 단백질 분해 효소 K (20 mg/mL)</td></tr> <tr><td>페놀/클로로포름/이소아밀 알코올 60 ml (25:24:1 혼합물, pH 6.7/8.0, 액)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1752I</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수, 10X 용액</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP39920</td><td>1X</td></tr><tr><td>큐비트 4</td>로 희석 <td>Thermo Fisher</td><td>Q33238</td><td></td></tr><tr><td>큐비트 어세이 튜브</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>큐비트 dsDNA HS 어세이 키트</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>냉장 기능이 있는 초음파 발생기 수조</td><td>Qsonica Sonicators</td><td>Q2000FCE</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Magnetic Beads</td><td>New England Biolabs (NEB)</td> <td>S1420S</td><td></td></tr><tr><td>TE 버퍼</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0)</td></tr> <tr><td>말단 Deoxynucleotidyl Transferase (rTdt)</td> <td>Promega</td><td>PR-M1875</td><td></td></tr></tbody></table>

고처리량 시퀀싱을 위한 그람 음성 박테리아에 트랜스포슨 삽입 라이브러리 생성

Generating Transposon Insertion Libraries in Gram-Negative Bacteria for High-Throughput Sequencing

트랜스포슨 시퀀싱(Tn-seq)은 광범위한 환경 조건하에서 세균 적합성에 기여하는 유전자와 경로를 식별하기 위해 트랜스포슨 돌연변이 발생과 대규모 병렬 시퀀싱을 결합한 강력한 방법입니다. Tn-seq 응용 프로그램은 광범위하고 유기체 수준에서 뿐만 아니라 인구, 지역 사회 및 시스템 수준에서 유전자형 표현형 관계의 검사를 가능하게했다. 그람 음성 박테리아는 항균 저항 표현형과 매우 관련이 있으며, 이는 항생제 치료 실패의 인시던트를 증가시켰습니다. 항균 저항은 그렇지 않으면 치명적인 항생제의 존재에 세균성 성장으로 정의됩니다. "마지막 줄" 항균 colistin 그람 음성 세균 감염을 치료 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 아신토박터 baumannii를 포함한 몇몇 그람 음성 병원체는 Tn-seq를 사용하여 특징지어진 분자 기계장치의 범위를 통해 colistin 저항을 개발할 수 있습니다. 또한, colistin 저항을 조절 하는 신호 변환 경로 그람 부정적인 박테리아 내에서 변화. 여기서 는 제한 효소, 어댑터 리칭 및 젤 정화의 필요성을 제거하여 포화 트랜스포온 삽입 라이브러리 및 앰플리션 라이브러리 건설의 생성을 간소화하는 A. baumannii에서 트랜스포슨 돌연변이 발생의 효율적인 방법을 제안합니다. 본 원에 기재된 방법은 colistin에 도전할 때 A. baumannii 피트니스에 기여하는 분자 결정요인의 심층분석을 가능하게 할 것이다. 프로토콜은 또한 그밖 그람 음성 ESKAPE 병원체에 적용됩니다, 주로 약 저항하는 병원 취득한 감염과연관됩니다.

설명된 방법은 플라스미드 pJNW684(도4B)를복제하는 대장균 MFD DAP를 이용한 세균융합을 통해- A. baumannii 균주 ATCC 17978에서 고밀도 트랜스포슨 라이브러리의 생성을 기술한다. 상세한 프로토콜은 대장균 λpir+ 기증자 균주에서 A. baumannii 받는 사람 균주로 pJNW684의 전송을 위한 이중 부모 세균 연상을 사용합니다. 이 방법은 조밀한 트랜스포슨 돌연변이 라이브러리를 생성하는 효율적이고 저렴한 방법입니다. 박테리아는 최적화된 비율로 혼합되었고 짝짓기는 루리아-베르타니 식기 플레이트에서 1h(그림1A)에발견되었다. 짝짓기 동안, 트랜스포슨은 기증자로부터 받는 사람 균주로 옮겨졌으며, 여기서 gDNA(도1B)에삽입되었다. 결합을 수...

당사는 그람 음성 박테리아에 있는 포화 트랜스포슨 돌연변이 라이브러리를 생성하고 고처리량 시퀀싱을 위한 DNA 증폭기 라이브러리의 후속 준비를 생성하는 방법을 설명합니다. 예를 들어, 우리는 ESKAPE 병원체, 아신토박터 baumannii에초점을 맞추고 있지만,이 프로토콜은 그람 음성 유기체의 넓은 범위에 순종.

Transposon sequencing (Tn-seq) is a powerful method that combines transposon mutagenesis and massive parallel sequencing to identify genes and pathways ...

이 방법은 감염 중 생체 내에서 중요한 필수 유전자, 항생제 내성 유전자 및 유전자를 식별하기 위해 다양한 세균 성 종에서 사용될 수 있기 때문에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 고가의 제한 효소, 어댑터 방사선 및 젤 정화의 필요성을 제거하는 게놈 DNA 및 Poly-CTL 에디션의 기계적 공유입니다. 이 기술의 의미는 감염 또는 항생 저항을 위해 중요한 것으로 확인된 유전자가 새로운 항균 치료제의 표적으로 봉사할 수 있기 때문에 문제가 있는 세균 감염의 치료로 확장됩니다.이 방법은 복잡한 유전자형, 그람 음성 및 그람 양성 세균성 종에 걸친 표현형 관계에 대한 통찰력을 제공하고 세균 유전학에 대한 현재의 이해를 향상시킬 수 있습니다. 시작하려면 야간 문화를 50 밀리리터 원물 튜브로 옮기고 7 분 동안 5, 000 회 G에서 원심 분리를 사용하여 수령인과 기증자 문화를 모두 전달하십시오. 상부체를 폐기합니다.10 밀리리터 세로지컬 파이펫을 사용하여 디미노피멜산으로 보충된 LB의 4.5 밀리리터에서 기증자 균주 펠릿을 다시 중단하십시오. 재중단 된 기증자 균주를 받는 사람 변형 튜브로 옮기십시오. 그리고 즉시 LB 천판에 개별 100 마이크로 리터 방울로 짝짓기 현탁액을 배포, 30 분 동안 실온에서 접시를 인큐베이션 디아미노 피멜산으로 보충.그런 다음 플레이트를 섭씨 37도의 교배기로 조심스럽게 옮기고 문화가 1시간 동안 짝짓기를 할 수 있도록 합니다. 인큐베이션 후 각 접시에 LB1.5 밀리리터를 추가하고 박테리아를 50 밀리리터 원추형 튜브로 수확합니다. 7분 동안 5, 000회 G에서 원심분리를 사용하여 메이트된 세포를 펠렛합니다.이어서, 상체를 버리고 LB의 10 밀리리터에서 세포를 다시 중단하고, 세포를 다시 제거하고, LB로 세척을 반복한다. 완료되면 10 밀리리터 세로지컬 파이펫을 사용하여 LB의 10 밀리리터에서 펠릿을 다시 일시 중단하여 25%의 글리세롤을 보충합니다. 원고 의 지시에 따라 접시에 세포를 퍼뜨리습니다. 그런 다음 밤새 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다.남은 박테리아의 1 밀리리터 알리쿼트를 만들고 섭씨 영하 80도에 보관하십시오. 얼음에 얼어 붙은 짝짓기의 알리쿼트를 붓습니다. 그런 다음 멸균 유리 구슬을 사용하여 희석의 150 마이크로 리터를 각 30 에 150 밀리미터 루리아 - 베르타니 한천 접시에 확산시켜 카나마이신으로 보충하십시오.초과 짝짓기가 포함된 중고 튜브를 폐기하고 14시간 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 인큐베이션 카운트 후 트랜스포슨 라이브러리의 총 돌연변이를 추정하기 위해 각 플레이트의 콜로니 형성 유닛을 계산한다. 플레이트 의 전체 그룹에 대한 식민지 수 추정을 결정하기 위해 적어도 세 개의 플레이트의 20 %를 계산합니다.추정 된 식민지 수율을 계산 한 후, 각 접시에 LB의 3 ~ 5 밀리리터를 추가하고 멸균 스크래핑 도구를 사용하여 박테리아를 긁어. 모든 플레이트에서 세균 현탁액을 50밀리리터 원물 튜브로 당기고, 7분 동안 5, 000회 G에서 원심분리하여 현탁액을 펠렛합니다. 상체를 버리고 30 %의 글리세롤로 보충 된 LB의 5 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오.그런 다음, 극저온에 트랜스포손 도서관의 1 밀리리터 알리쿼트를 만들어 섭씨 영하 80도에 보관하십시오. TE 버퍼로 gDNA를 마이크로리터 당 250 나노그램의 농도로 희석하고 총 200 마이크로리터로 희석하고 수조 초음파 처리기에 배치합니다. 약 300개의 뉴클레오티드의 단편을 산출하기 위하여 DNA를 초음파 처리합니다.DNA가 1%돼지 로스트 젤에 10마이크로리터의 미광택 DNA와 10마이크로리터의 세리리터를 실행하여 전염되는 것을 확인합니다. 필요한 경우 초음파 처리를 반복합니다. 투명 DNA의 세 가지 맨 끝에 폴리 씨앗 꼬리를 추가하려면 텍스트 원고에 설명 된 바와 같이 정책 반응을 설정하고 섭씨 37도에서 1 시간 동안 반응 튜브를 배양하십시오.정책 반응을 정화하려면 각 샘플에 크기 선택 파라자성 구슬 40 마이크로리터를 추가하고 반응 튜브를 소용돌이시다. 실온에서 샘플을 5분간 배양합니다. 그런 다음, 잠시 원심 분리하여 튜브 의 바닥에있는 액체를 수집합니다.튜브를 자기 랙으로 옮기고 실온에서 2분 동안 또는 용액이 명확해질 때까지 배양합니다. 상체를 조심스럽게 제거하고 구슬을 방해하지 않고 신선하게 준비된 80% 에탄올 200 마이크로리터를 추가합니다. 솔루션이 명확해질 때까지 샘플을 배양합니다.그런 다음 상체를 제거하고 에탄올 세척을 반복합니다. 튜브를 간략하게 원심분리하고 마그네틱 랙에 다시 넣어 남은 액체를 제거합니다. 실온에서 2~5분간 샘플을 배양하여 건조시로 바식해 주세요.그리고 각 튜브에 25 마이크로 리터의 물을 추가합니다. 약 5초 동안 소용돌이를 피우거나 피펫을 위아래로 피펫합니다. 그런 다음 튜브를 원심분리하여 하단에 액체를 수집합니다.튜브를 자기 랙으로 옮기고 용액이 명확해질 때까지 약 2분 동안 앉을 수 있습니다. 그런 다음, 구슬을 방해하지 않고 새로운 튜브로 상체를 전송합니다. 이 프로토콜은 플라스미드 pJNW684를 복제하는 E-coli MFD DAP 보조를 사용하여 세균성 컨쥬레이션을 통해 A-baumannii 균주 ATCC 17978에서 고밀도 트랜스포슨 라이브러리를 생성하는 데 사용되었다.뽑아낸 A-baumannii 트랜스포슨 돌연변이 라이브러리는 항균의 서브 억제 농도하에서 콜리신 저항에 중요한 피트니스 요소를 식별하는 데 사용되었습니다. Colistin 저항에 기여하는 유전자의 돌연변이 라이브러리를 고갈한 후에, 나머지 라이브러리 풀의 총 gDNA는 통제 및 실험 배양에서 격리되었습니다. gDNA는 기계적 전단으로 단편화되었고 시퀀싱을 준비하기 위해 DNA 조각에 정책 꼬리를 추가했습니다.DNA 농도를 계산하고 칩 기반 모세관 전기포이를 사용하여 시료를 분석하여 성공적인 라이브러리 빌드를 확인하였다. 이 절차를 시도할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 CFU 카운트에 따라 고해상도 돌연변이 라이브러리를 생성하는 것입니다. 추가적으로, 수신자 균주는 돌연변이 발생 전에 트랜스포슨을 사용하여 항생제 내성 마커에 민감해야 한다.이 절차에 따라, 유전자 삭제 또는 사운드 말기 방법은 시퀀싱 결과에서 얻은 개별 헤드를 노크하고 도전 조건하에서 관심의 유전자를 검증하기 위해 수행 될 수있다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: Kazi, M. I., et. al., 고처리량 시퀀싱을 위한 그람 음성 박테리아에서 트랜스포존 삽입 라이브러리 생성. J. Vis. Exp. (2020년)이 비디오는 카나마이신 내성을 기반으로 트랜스포존 삽입을 운반하는 그람 음성 수용자 박테리아의 선택, 정량화 및 보존을 보여줍니다.

게놈 트랜스포존 삽입을 통한 그람 음성 박테리아의 분리

엔테로 박터 SP. YSU는 포도당 최소 염 배지에서 성장한다. 영양 요구 임의로 숙주 게놈 내로 그 자체를 삽입 transposome로 변환함으로써 생성된다. 돌연변이는 최소 배지에 복잡한 매체로부터 복제 도금에 의해 발견된다. 중단 된 유전자는 유전자 구조 및 시퀀싱에 의해 식별됩니다.

생성 엔테로 박터 SP. YSU 영양 요구는 트랜스포존 돌연변이 유발을 사용하여

이 원고는 차세대 염기서열분석을 위해 DNA 단편을 정제하기 위한 자동화된 겔 크기 선택 접근법을 설명합니다. Ranger Technology는 아가로스 겔 로딩, 전기영동 분석 및 표적 DNA 단편 회수의 전체 프로세스를 완전히 자동화하여 고처리량 및 고품질 차세대 염기서열분석 라이브러리를 가능하게 합니다.

자동 젤 사이즈 선택은 환경 물 샘플에서 준비 차세대 시퀀싱 라이브러리의 질을 향상시키기 위해

여기, 비 코딩 DNA 요소의 transposon 중재 무작위 삽입의 힘의 최적의 염색체 위치를 해결 하기 위해 사용 되었다.

소설 Transposon 중재 방식을 사용 하 여 대장균 의 DNA 요소에 대 한 최적의 염색체 위치 결정

여기에 제시 된 대장균 또는 Shigella flexneri 세균성 활용을 사용 하 여 고밀도 transposon 삽입 라이브러리를 만들기 위한 간단한 방법이입니다. 이 의정서는 transposon의 임의의 게놈 삽입 하 여 독특한 돌연변이 박테리아에 수천의 수백의 컬렉션의 창조를 허용 한다.

밀도 Transposon 삽입 라이브러리를 사용 하 여 세균성 활용 Enterobacterial 종자와 같은 대장균 또는 Shigella flexneri 의 창조

간단 하 고 효율적인 비용 효율적인 대규모 gRNA 라이브러리를 생성 하기 위한 방법 이어야 한다. 우리는 표적 DNA의 효소 소화에 따라 gRNA 라이브러리의 생산에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 메서드를 CORALINA (제어 nuclease 활동을 통해 포괄적인 gRNA 라이브러리 세대) 비용이 많이 드는 사용자 지정 oligonucleotide 종합에 대안을 선물 한다.

대규모 gRNA DNA 소스에서 라이브러리 제작에 대 한 범용 프로토콜

여기를 식별 하 여 조직에서 transposon leptospiral 돌연변이 햄스터의 도전 후 계량 높은 처리량 시퀀싱 transposon mutagenesis 결합 기술을 설명 합니다. 이 프로토콜 생존 및 동물에 보급에 대 한 화면 돌연변이를 사용할 수 있습니다 하 고 생체 외에서 연구에도 적용 될 수 있습니다.

높은 처리량 측정 적합성 Leptospira interrogans Transposon 삽입 돌연변이 중 황금 시리아 햄스터 감염의 병렬 시퀀싱

PBIBAC-GW 이진 벡터를 사용 하 여 생성 유전자 변형 식물을 그대로 단일 복사본 삽입, 쉬운 과정을 만든다. 여기, 프로토콜의 시리즈는 유전자 변형 애기 식물을 생성 하 고 intactness에 대 한 식물을 테스트 과정을 통해 독자를 안내 하 고 삽입의 수를 복사 하 여.

BIBAC-GW 이진 벡터를 사용 하 여 단일 복사본 삽입을 가진 유전자 변형 식물 생성

시퀀싱 (RH-seq)을 통한 상호 반심은 종 간의 특성 차이의 유전적 기초를 매핑하는 강력한 새로운 방법입니다. hemizygotes의 풀은 트랜스포종 돌연변이 발생에 의해 생성되고 그들의 체력은 높은 전반에 걸쳐 시퀀싱을 사용하여 경쟁적인 성장을 통해 추적됩니다. 결과 데이터의 분석은 특성의 근본적인 유전자를 찾아낸다.

게놈 전체 상호 Hemizygosity 분석을 통해 사카로 마이스 효모의 종 간의 열내성 차이의 유전 매핑

이것은 버크 홀더리아 유익한 공생에서 후보 곤충 식민지 요인을 식별하기위한 적응 된 방법입니다. 딱정벌레 숙주는 트랜스포슨 돌연변이 발생을 통해 생성된 무작위 돌연변이 라이브러리에 감염되며, 식민지 화 후 라이브러리 복잡성은 시험관내에서자란 대조군과 비교된다.

라그리아 빌로사 딱정벌레의 부르크홀더리아 글래디올리 공생에서 세균 식민지 요인을 해명하는 도구로 트랜스포슨 삽입 시퀀싱

학습하세요 그람 음성 박테리아에서 포화 트랜스포슨 돌연변이 라이브러리를 생성하는 방법을. Acinetobacter baumannii를 사용하여 필수 유전자와 항생제 내성 인자를 식별하고 새로운 항균 치료제 개발을 위한 표적을 발굴합니다.

고처리량 시퀀싱을 위한 그람 음성 박테리아에 트랜스포슨 삽입 라이브러리 생성

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