고처리량 시퀀싱을 위한 그람 음성 박테리아에 트랜스포슨 삽입 라이브러리 생성

이 방법은 감염 중 생체 내에서 중요한 필수 유전자, 항생제 내성 유전자 및 유전자를 식별하기 위해 다양한 세균 성 종에서 사용될 수 있기 때문에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 고가의 제한 효소, 어댑터 방사선 및 젤 정화의 필요성을 제거하는 게놈 DNA 및 Poly-CTL 에디션의 기계적 공유입니다. 이 기술의 의미는 감염 또는 항생 저항을 위해 중요한 것으로 확인된 유전자가 새로운 항균 치료제의 표적으로 봉사할 수 있기 때문에 문제가 있는 세균 감염의 치료로 확장됩니다.

이 방법은 복잡한 유전자형, 그람 음성 및 그람 양성 세균성 종에 걸친 표현형 관계에 대한 통찰력을 제공하고 세균 유전학에 대한 현재의 이해를 향상시킬 수 있습니다. 시작하려면 야간 문화를 50 밀리리터 원물 튜브로 옮기고 7 분 동안 5, 000 회 G에서 원심 분리를 사용하여 수령인과 기증자 문화를 모두 전달하십시오. 상부체를 폐기합니다.

10 밀리리터 세로지컬 파이펫을 사용하여 디미노피멜산으로 보충된 LB의 4.5 밀리리터에서 기증자 균주 펠릿을 다시 중단하십시오. 재중단 된 기증자 균주를 받는 사람 변형 튜브로 옮기십시오. 그리고 즉시 LB 천판에 개별 100 마이크로 리터 방울로 짝짓기 현탁액을 배포, 30 분 동안 실온에서 접시를 인큐베이션 디아미노 피멜산으로 보충.

그런 다음 플레이트를 섭씨 37도의 교배기로 조심스럽게 옮기고 문화가 1시간 동안 짝짓기를 할 수 있도록 합니다. 인큐베이션 후 각 접시에 LB1.5 밀리리터를 추가하고 박테리아를 50 밀리리터 원추형 튜브로 수확합니다. 7분 동안 5, 000회 G에서 원심분리를 사용하여 메이트된 세포를 펠렛합니다.

이어서, 상체를 버리고 LB의 10 밀리리터에서 세포를 다시 중단하고, 세포를 다시 제거하고, LB로 세척을 반복한다. 완료되면 10 밀리리터 세로지컬 파이펫을 사용하여 LB의 10 밀리리터에서 펠릿을 다시 일시 중단하여 25%의 글리세롤을 보충합니다. 원고 의 지시에 따라 접시에 세포를 퍼뜨리습니다. 그런 다음 밤새 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다.

남은 박테리아의 1 밀리리터 알리쿼트를 만들고 섭씨 영하 80도에 보관하십시오. 얼음에 얼어 붙은 짝짓기의 알리쿼트를 붓습니다. 그런 다음 멸균 유리 구슬을 사용하여 희석의 150 마이크로 리터를 각 30 에 150 밀리미터 루리아 - 베르타니 한천 접시에 확산시켜 카나마이신으로 보충하십시오.

초과 짝짓기가 포함된 중고 튜브를 폐기하고 14시간 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 인큐베이션 카운트 후 트랜스포슨 라이브러리의 총 돌연변이를 추정하기 위해 각 플레이트의 콜로니 형성 유닛을 계산한다. 플레이트 의 전체 그룹에 대한 식민지 수 추정을 결정하기 위해 적어도 세 개의 플레이트의 20 %를 계산합니다.

추정 된 식민지 수율을 계산 한 후, 각 접시에 LB의 3 ~ 5 밀리리터를 추가하고 멸균 스크래핑 도구를 사용하여 박테리아를 긁어. 모든 플레이트에서 세균 현탁액을 50밀리리터 원물 튜브로 당기고, 7분 동안 5, 000회 G에서 원심분리하여 현탁액을 펠렛합니다. 상체를 버리고 30 %의 글리세롤로 보충 된 LB의 5 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오.

그런 다음, 극저온에 트랜스포손 도서관의 1 밀리리터 알리쿼트를 만들어 섭씨 영하 80도에 보관하십시오. TE 버퍼로 gDNA를 마이크로리터 당 250 나노그램의 농도로 희석하고 총 200 마이크로리터로 희석하고 수조 초음파 처리기에 배치합니다. 약 300개의 뉴클레오티드의 단편을 산출하기 위하여 DNA를 초음파 처리합니다.

DNA가 1%돼지 로스트 젤에 10마이크로리터의 미광택 DNA와 10마이크로리터의 세리리터를 실행하여 전염되는 것을 확인합니다. 필요한 경우 초음파 처리를 반복합니다. 투명 DNA의 세 가지 맨 끝에 폴리 씨앗 꼬리를 추가하려면 텍스트 원고에 설명 된 바와 같이 정책 반응을 설정하고 섭씨 37도에서 1 시간 동안 반응 튜브를 배양하십시오.

정책 반응을 정화하려면 각 샘플에 크기 선택 파라자성 구슬 40 마이크로리터를 추가하고 반응 튜브를 소용돌이시다. 실온에서 샘플을 5분간 배양합니다. 그런 다음, 잠시 원심 분리하여 튜브 의 바닥에있는 액체를 수집합니다.

튜브를 자기 랙으로 옮기고 실온에서 2분 동안 또는 용액이 명확해질 때까지 배양합니다. 상체를 조심스럽게 제거하고 구슬을 방해하지 않고 신선하게 준비된 80% 에탄올 200 마이크로리터를 추가합니다. 솔루션이 명확해질 때까지 샘플을 배양합니다.

그런 다음 상체를 제거하고 에탄올 세척을 반복합니다. 튜브를 간략하게 원심분리하고 마그네틱 랙에 다시 넣어 남은 액체를 제거합니다. 실온에서 2~5분간 샘플을 배양하여 건조시로 바식해 주세요.

그리고 각 튜브에 25 마이크로 리터의 물을 추가합니다. 약 5초 동안 소용돌이를 피우거나 피펫을 위아래로 피펫합니다. 그런 다음 튜브를 원심분리하여 하단에 액체를 수집합니다.

튜브를 자기 랙으로 옮기고 용액이 명확해질 때까지 약 2분 동안 앉을 수 있습니다. 그런 다음, 구슬을 방해하지 않고 새로운 튜브로 상체를 전송합니다. 이 프로토콜은 플라스미드 pJNW684를 복제하는 E-coli MFD DAP 보조를 사용하여 세균성 컨쥬레이션을 통해 A-baumannii 균주 ATCC 17978에서 고밀도 트랜스포슨 라이브러리를 생성하는 데 사용되었다.

뽑아낸 A-baumannii 트랜스포슨 돌연변이 라이브러리는 항균의 서브 억제 농도하에서 콜리신 저항에 중요한 피트니스 요소를 식별하는 데 사용되었습니다. Colistin 저항에 기여하는 유전자의 돌연변이 라이브러리를 고갈한 후에, 나머지 라이브러리 풀의 총 gDNA는 통제 및 실험 배양에서 격리되었습니다. gDNA는 기계적 전단으로 단편화되었고 시퀀싱을 준비하기 위해 DNA 조각에 정책 꼬리를 추가했습니다.

DNA 농도를 계산하고 칩 기반 모세관 전기포이를 사용하여 시료를 분석하여 성공적인 라이브러리 빌드를 확인하였다. 이 절차를 시도할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 CFU 카운트에 따라 고해상도 돌연변이 라이브러리를 생성하는 것입니다. 추가적으로, 수신자 균주는 돌연변이 발생 전에 트랜스포슨을 사용하여 항생제 내성 마커에 민감해야 한다.

이 절차에 따라, 유전자 삭제 또는 사운드 말기 방법은 시퀀싱 결과에서 얻은 개별 헤드를 노크하고 도전 조건하에서 관심의 유전자를 검증하기 위해 수행 될 수있다.