Name: 스캔 전송 전자 현미경을 사용하여 액체에 나노 크기의 개체의 동적 프로세스를 공부 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: 학습하세요 스캔 전송 전자 현미경을 사용하여 액체 속 금 나노입자의 동적 거동을 관찰하는 방법을. 이 기술은 생물학적 샘플의 나노급 형태학 정보를 제공하여 재료 과학 및 생물학 연구에 활용됩니다.

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INM을 통한 E. Arzt의 지원에 감사드립니다. 이 연구는 2014년 라이프니츠 콩쿠르의 일부 지원을 받았습니다.

<ol><li>Ring, E. A., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+system+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Microfluidic system for transmission electron microscopy.</a> Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).</li>
<li>Ross, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+and+challenges+in+liquid+cell+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Opportunities and challenges in liquid cell electron microscopy.</a> Science. 350, 9881-9889 (2015).</li>
<li>de Jonge, N., Ross, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+specimens+in+liquid%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of specimens in liquid.</a> Nat. Nanotechnol. 6, 695-704 (2011).</li>
<li>Zheng, H., Smith, R. K., Jun, Y. W., Kisielowski, C., Dahmen, U., Alivisatos, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+single+colloidal+platinum+nanocrystal+growth+trajectories%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Observation of single colloidal platinum nanocrystal growth trajectories.</a> Science. 324, 1309-1312 (2009).</li>
<li>Evans, J. E., Jungjohann, K. L., Browning, N. D., Arslan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+growth+of+nanoparticles+from+solution+with+in+situ+liquid+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Controlled growth of nanoparticles from solution with in situ liquid transmission electron microscopy.</a> Nano Lett. 11, 2809-2813 (2011).</li>
<li>Alloyeau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+kinetic+and+thermodynamic+effects+on+the+growth+of+gold+nanoplates+by+liquid+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Unravelling kinetic and thermodynamic effects on the growth of gold nanoplates by liquid transmission electron microscopy.</a> Nano Lett. 15, 2574-2581 (2015).</li>
<li>Smeets, P. J., Cho, K. R., Kempen, R. G., Sommerdijk, N. A., De Yoreo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+carbonate+nucleation+driven+by+ion+binding+in+a+biomimetic+matrix+revealed+by+in+situ+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Calcium carbonate nucleation driven by ion binding in a biomimetic matrix revealed by in situ electron microscopy.</a> Nat. Mater. 14, 394-399 (2015).</li>
<li>Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+Scanning+Transmission+Electron+Microscopy%3A+Imaging+Protein+Complexes+in+their+Native+Environment+in+Whole+Eukaryotic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Liquid Scanning Transmission Electron Microscopy: Imaging Protein Complexes in their Native Environment in Whole Eukaryotic Cells.</a> Microsc. Microanal. 20, 346-365 (2014).</li>
<li>de Jonge, N., Peckys, D. B., Kremers, G. J., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+whole+cells+in+liquid+with+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of whole cells in liquid with nanometer resolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2159-2164 (2009).</li>
<li>Evans, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+macromolecular+complexes+with+in+situ+liquid+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Visualizing macromolecular complexes with in situ liquid scanning transmission electron microscopy.</a> Micron. 43, 1085-1090 (2012).</li>
<li>Dukes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+microchip+design+and+application+for+in+situ+transmission+electron+microscopy+of+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Improved microchip design and application for in situ transmission electron microscopy of macromolecules.</a> Microsc. Microanal. 20, 338-345 (2014).</li>
<li>Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicon+nitride+windows+for+electron+microscopy+of+whole+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells.</a> J. Microsc. 243, 273-283 (2011).</li>
<li>de Jonge, N., Pfaff, M., Peckys, D. B. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/278397751_Practical_Aspects_of_Transmission_Electron_Microscopy_in_Liquid">Practical aspects of transmission electron microscopy in liquid.</a> Adv. Imag. Electr. Phys. 186, 1-37 (2014).</li>
<li>Verch, A., Pfaff, M., De Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exceptionally+slow+movement+of+gold+nanoparticles+at+a+solid%3Aliquid+interface+investigated+by+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Exceptionally slow movement of gold nanoparticles at a solid:liquid interface investigated by scanning transmission electron microscopy.</a> Langmuir. 31, 6956-6964 (2015).</li>
<li>Schneider, N. M., Norton, M. M., Mendel, B. J., Grogan, J. M., Ross, F. M., Bau, H. H. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jp507400n">Electron-water interactions and implications for liquid cell electron microscopy.</a> J. Phys. Chem. C. 118, 22373-22382 (2014).</li>
<li>Hermannsdoerfer, J., de Jonge, N., Verch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+beam+induced+chemistry+of+gold+nanoparticles+in+saline+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">Electron beam induced chemistry of gold nanoparticles in saline solution.</a> Chem. Comm. 51, 16393-16396 (2015).</li>
<li>Schuh, T., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S163107051300203X">Liquid scanning transmission electron microscopy: Nanoscale imaging in micrometers-thick liquids.</a> C. R. Phys. 15, 214-223 (2014).</li>
<li>Jensen, E., Burrows, A., Molhave, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolithic+chip+system+with+a+microfluidic+channel+for+in+situ+electron+microscopy+of+liquids%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Monolithic chip system with a microfluidic channel for in situ electron microscopy of liquids.</a> Microsc. Microanal. 20, 445-451 (2014).</li>
<li>Creemer, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/5428851/">A MEMS reactor for atomic-scale microscopy of nanomaterials under industrially relevant conditions.</a> J. Microelectromech. Syst. 19, 254-264 (2010).</li>
<li>Williamson, M. J., Tromp, R. M., Vereecken, P. M., Hull, R., Ross, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+microscopy+of+nanoscale+cluster+growth+at+the+solid-liquid+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Dynamic microscopy of nanoscale cluster growth at the solid-liquid interface.</a> Nat. Mater. 2, 532-536 (2003).</li>
<li>Thiberge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+electron+microscopy+of+cells+and+tissues+under+fully+hydrated+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Scanning electron microscopy of cells and tissues under fully hydrated conditions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 3346(2004).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+motion+of+DNA-Au+nanoconjugates+in+graphene+liquid+cell+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">3D motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy.</a> Nano Lett. 13, 4556-4561 (2013).</li>
<li>Yuk, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+EM+of+colloidal+nanocrystal+growth+using+graphene+liquid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells.</a> Science. 336, 61-64 (2012).</li>
<li>Reimer, L., Kohl, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aReimer%2C+L+%22Transmission+electron+microscopy%3A+physics+of+image+formation%22">Transmission electron microscopy: physics of image formation</a>. , Springer. (2008).</li>
<li>Abellan, P., Woehl, T. J., Parent, L. R., Browning, N. D., Evans, J. E., Arslan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+quantitative+liquid+%28scanning%29+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Factors influencing quantitative liquid (scanning) transmission electron microscopy.</a> Chem. Commun. 50, 4873-4880 (2014).</li>
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<li>Hohmann-Marriott, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+3D+cellular+imaging+by+axial+scanning+transmission+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale 3D cellular imaging by axial scanning transmission electron tomography.</a> Nat. Methods. 6, 729-731 (2009).</li>
<li>Unocic, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+electrochemical+measurements+using+in+situ+ec-S%2FTEM+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Quantitative electrochemical measurements using in situ ec-S/TEM devices.</a> Microsc. Microanal. 20, 452-461 (2014).</li>
<li>Kourkoutis, L. F., Plitzko, J. M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev-matsci-070511-155004">Electron Microscopy of Biological Materials at the Nanometer Scale.</a> Annu. Rev. Mater. Res. 42, 33-58 (2012).</li>
<li>Chao, W., Harteneck, B. D., Liddle, J. A., Anderson, E. H., Attwood, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+X-ray+microscopy+at+a+spatial+resolution+better+than+15+nm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Soft X-ray microscopy at a spatial resolution better than 15 nm.</a> Nature. 435, 1210-1213 (2005).</li>
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<li>Fleming, A. J., Kenton, B. J., Leang, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+the+gap+between+conventional+and+video-speed+scanning+probe+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Bridging the gap between conventional and video-speed scanning probe microscopes.</a> Ultramicroscopy. 110, 1205-1214 (2010).</li>
<li>Sulchek, T., Hsieh, R., Adams, J. D., Minne, S. C., Quate, C. F., Adderton, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+atomic+force+microscopy+in+liquid%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Instr%22%5BJournal%5D)">High-speed atomic force microscopy in liquid.</a> Rev. Sci. Instr. 71, 2097-2099 (2000).</li>
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기술 된 프로토콜은 동적 프로세스의 관찰을 포함한 액체에 AuNPs의 STEM 수 있습니다. 홀더의 조립이 쉬운-배울 기술이다. 액체 흐름 TEM 홀더 작동 그러나, 여러 측면이 고려되어야한다. 예를 들어, O 링에 실리콘 마이크로 칩 또는 큰 입자의 깨진 가장자리는 액체 셀의 누설의 원인이 될 수 있습니다. 한편, 큰 입자 (&gt; 200 nm의, 예를 들면은, 먼지 또는 Si 파편) 죄 막에가, 액체 전지의 두께를 증가시키는 결과 낮은 공간 해상도가 낮은 영상 대비 또는 선도 월에도 원인이있다 SiN으로 창은 휴식입니다. 중요한 것은, 염 또는 다른 화학 물질의 잔류 물은 바람직하지 않은 방식으로 실험의 결과에 영향을 미칠 수있다. 따라서, 샘플 준비 및 홀더 조립체의 다양한 단계는 신중하고 깨끗하고 먼지없는 환경에서 수행되는 것이 중요하다. 액체 가전의 두께LL은 달성 가능한 해상도뿐만 아니라, 수득 이미지 (17)의 콘트라스트를 결정한다. 이 두께는 두 개의 실리콘 마이크로 칩 중 하나에있는 스페이서를 통해 조정될 수있다. 샘플의 크기에 따라, 액정 셀의 다른 두께를 실현할 수있다. 전체 진핵 세포가 5 ㎛, 더 큰 스페이서를 필요로하는 동안 AuNPs 연구의 경우, 작은 스페이서 (200-500 나노 미터)를 사용하는 것이 가능하다. 액체 셀의 두께는 상기 액정 셀과 주변의 진공 사이의 압력 차이로부터 기인 된 SiN 막 윈도우의 팽윤에 의해 영향을 받는다. 이 효과는 더 큰의 SiN 막 창문이 더 두드러집니다. 따라서, 액정 셀의 두께를 최소화하기 위하여, 소형의 SiN 막 윈도우를 사용하도록 권장한다. 케이스에 두 개의 작은 창 사이의 중첩, 그들은 다른 기본 마이크로 칩을 이용하여 교차 구성으로 조립 될 수 찾기 어렵다. 대체 구성의 larg의엘리는 팽창 방지 및 샘플 로딩에 관한 기둥 (19)에 의해지지 된 모 놀리 식 마이크로 칩 18 막 창, 그러나 그 전시 단점으로 구성되어 있습니다. 현재 기술의 가장 어려운 측면 중 하나는 액체의 두께를 정확하게 제어의 부족이다. 종종 액체는 여기에 도시 된 바와 같이, 사용되는 스페이서 치수로부터 예상되는 것보다 훨씬 두껍다. 몇몇 그룹이 폐쇄 액체 챔버 (4), 20, 21, 22에 사용; 액체 두께 액체 내에서 버블을 유도함으로써 감소 될 수 있으므로이 시스템은, 공간적 해상도에 관한 몇 가지 장점이있다. 또한, 죄의 창은 얇은 액체 층에 선도 붕괴 강제 할 수 있습니다. 또한 매우 얇은 액체 결과 셋째, 다른 얇은 윈도우 인클로저의 존재 (예, 그라) 23이 프로토콜에서 설명하는 시스템과 함께 가능한 것보다. 그러나, 이러한 시스템에 액체를 흐르게 할 수 없다. 임의의 고해상도 현미경 기법에 관해서는, 실험 많은 측면이 고려되어야한다. 가장 중요한 태양은 액체 또는 샘플과 전자 빔의 상호 작용이다. 많은 고체 시료 24 달성 공간 해상도를 제한 방사선 손상,뿐만 아니라, 액체 샘플은 전자 빔 방사선 분해 생성 된 제품 (15) (25)에 의해 영향을 받는다. 이 제품은 실험에 영향을 미칠 수 있기 때문에주의 데이터 해석 및 실험 설계 26 필수적이다. 현미경 설정은 특정 연구의 목적에 따라 선택해야합니다. ADF STEM는 WHI 액체 셀의 더 큰 두께에서 높은 원자 번호 (Z)의 촬상 나노 입자 더 강력제작 TEM 낮은 Z 재료에 더 좋은 대조를 제공하고 일반적으로 빠르지 만 얇은 액체 층 (3)을 필요로한다. 대신 ADF 검출기를 사용 BF의 STEM 두꺼운 층 (27)에 둘러 Z 재료를 이미징하는 것이 유리하기 때문에, 밝은 필드 (BF) 검출기는 가끔 이미지 액체 셀을 사용한다. 액체 셀의 두께가 증가함에 따라, 더 많은 전류가 필요하다. 그러나, 이것은 또한 방사선 분해 생성물의 농도를 증가시키고, 방사선 손상을 증가시킨다. 또한 명암의 반전이 매우 두꺼운 액체 (물&gt; 10 μm의)에 대한 ADF 검출기에서 관찰되는 것을 주목해야한다. 액체 상태는 현미경 홀더를 제거하고 시료와 액체를 모두 교환하여 실험 사이에서 변경 하였다. 염 농도의 변화에 더하여, 그것은 예를 들면, 하나의 월 (다른 액체가 흐르는 액체의 다른 성질을 용이하게 변경할 수있다특정 pH를 16으로 설정하기 위해 완충 용액을 사용하여 유기 용액 또는 다른 첨가제)을 초래할 수있다. 이 홀더 여전히 마이크로 유체 시스템을 통하여 액체를 흐르게함으로써 현미경에 삽입되는 동안 액체를 변경하는 것도 가능하다. 그러나,이 경우, 이때 샘플 변화에서 액체를 가리 알려지지 않았다. 이 전극에지지 된 마이크로 칩을 사용할 수 있으므로 나노 전기 화학 실험 28를 실시 할 수 있음도 주목할 만하다. 연구의 목적은 물에 AuNPs에 한정되지 않고, 시료의 다양한 실리카, 티타늄 산화물 및 중합체를 포함하여 전술 한 프로토콜을 이용하여 연구 할 수있다. 물체의 움직임을 포착 내의 이미지 캡처 너무 빠른 경우, 점도는 50 % 글리세롤 및 50 % 물의 혼합물을 사용하여 크기 순서로 감소 될 수있다. 상기 점에서,다수의 장점은, 가능성, 또한 단점이 명백해진다. 1) 모든 실험은 시료 전체 (관찰중인 객체, 액체와의 SiN 막)으로 전자빔의 동적 상호 작용에 의해 영향을 받는다; 액상 STEM 작업 할 때 고려해야 할 가장 중요한 단점은 있습니다 2) 샘플의 처리는 지루한이며, 샘플 또는 마이크로 칩의 일부 마이크로 미터 크기의 입자를 포함하기 때문에 얇은 액체 층을 달성하는 것이 곤란하다; 3) 액체의 두께는 통상 스페이서에 의해 설정된 예정 두께는 크게 상이하다; 4) 공간 해상도 및 콘트라스트를 강하게 액체 두께 관찰 액체 하에서 물체의 밀도 변화의 차이에 의존한다. 현재, 충분한 방법이 나노 미터 공간 해상도와 액체에서 객체의 현미경 존재한다. 비정질 얼음 전자 현미경은 강력한 기술이다 (29)그러나 관련 실험 절차는 모든 실험은 얼음에서 샘플의 제조를 허용하고, 시간 - 분해 실험은 불가능 섬세하다. X 선 현미경 (30) (31)는 원칙적으로 사용될 수 있지만, 한정된 공간 해상도를 갖는 실험실에서 널리 사용할 수있다. 액체의 원자력 현미경 확립되지만 표면 기법 32, 33, 34, 35 있음. 광학 현미경은 충분한 공간 해상도가 발생하지 않습니다. 현재에, 액체 내에서의 전자 현미경은 나노 액체 내의 객체 및 프로세스를 직접 현미경 가장 강력한 기술을 보인다. 액상 TEM 및 STEM은 아직 일상적인 분석 기법은 아니지만 여전히 개발하고있다. 고려해야하는 파라미터의 수는 상당한이며 ofte이고n은 어려운 실험 결과를 재현합니다. 또한, 정량적 인 데이터는 조사중인 효과 전자빔의 결과로 발생하는 프로세스와 얽혀 있기 때문에 얻기 어렵다. 여기에 설명 된 프로토콜함으로써 실험의 모든 관련 기본 측면에 대한 회계, 실험 프로토콜을 표준화하는 것을 목표로하고있다. 우리는이 프로토콜이 신흥 분야에서 실험적인 작품의 더 나은 재현성으로 이어질 수 있기를 바랍니다.

기존의 주사 ​​투과 전자 현미경 (STEM)의 분석에 적합한 표본, 높은 진공 배치에 적합한 구체적으로 건조하고 고체 시료의 범위에 의해 제한된다. 그러나, 많은 과학 기술의 질문은 나노 물질 및 액체 환경에서 프로세스를 우려. 완전히 액체에 포함 된 샘플은 현재 투과 전자 현미경 (TEM) 및 STEM 1 시편 홀더에 조립 된 미세 유체 챔버를 포함하는 개념을 사용하여 STEM으로 공부하실 수 있습니다. 그것이 성장 용해하고, 나노 입자, 2, 3, 4, 5의 응집 공정, (6)을 포함하는 다양한 연구 분야의 중요한 과정으로 새로운 통찰력을 제공하기 때문에 새롭게 개발 된 기술은 점점 더 인기를 끌고있다. 뿐만 아니라 금속, 또한 biominerals 7 및 생물학적 시스템은 8, 9, 10, 11을 연구 할 수있다. 액상 STEM 대한 샘플 로딩 및 화상 획득 건조 시료 STEM보다 다른 전용 훈련을 필요로하는 프로토콜을 포함한다. 마이크로 유체 시스템 (도 1A 참조) 실리콘 질화물 (12)의 에너지가 200 keV로의 전자 빔에 대한 투명한 (SIN) 막 윈도우를 지원하는 두 개의 실리콘 마이크로 구성된다. 치수 이러한 마이크로 칩의 처리의 상세는, (13)이 다른 12에서 찾을 수있다. 샘플은 일반적으로 나노 개체가 포함되어 있습니다. 이 논문에서 우리는 금 나노 입자 (AuNPs)를 관찰했다. AuNPs은 (a 하향 이동하는 전자 빔에 대해) 상부 윈도우에서 고정 또는 액체 비누에 떠있다신분증. STEM 나노 스케일의 공간 해상도는 AuNPs 위에 전자빔을 주사하고 상기 환형 다크 필드 (ADF) 검출기 (9)를 이용하여 송신 산란 전자를 수집함으로써 얻어진다. 두 마이크로 칩은 액체 흐름 TEM 홀더 (1) (홀더 모두 STEM 위해 동작하고 TEM하지만 TEM 홀더라고한다)의 선단부에 소 슬롯에 배치된다. 액체 실이 마이크로 칩 사이에 형성되도록, 마이크로 칩의 하나의 스페이서를 포함한다. 두 마이크로 칩의 양측에 O 링은 액체 실 (13) (도 1b 참조)의 진공 밀봉을 제공한다. 이 문서의 목적은 관심이있는 사용자가이 신흥 새로운 기술에 쉽게 액세스를 찾을 수 있도록 샘플로드 및 데이터 수집의 기본 단계를 설명하는 것입니다. 특정 회사로부터 입수 가능한 시스템이 사용되지만,이 프로토콜은 또한 다른 회사의 시스템에 유효하다. 이 기술은액체 유지 장치 (13)와 협력 할 때, 종래의 TEM과 STEM, 실용적인 측면의 개수보다 더 복잡한 고려되어야한다. 무엇보다 중요한 액체 구획이 제대로 따라서 얇은 액체 층과 진공 밀봉을 제공 조립되어 있는지 확인하는 것입니다. 따라서, 정상적으로 작동하도록 액체 유동 TEM 홀더의 제조 및 조립시에 분진의 형성을 방지하는 것이 매우 중요하다. 특히, O 링과 두 개의 실리콘 마이크로 칩은 각종 오염 물질이 없어야합니다. 마이크로 칩의 하나에 먼지도 작은 입자가 심각 유용한 공간 해상도의 달성을 방지 할 수 있습니다 조립 셀의 두께를 증가시킬 수있다. 더 오염이나 손상이 실험 후 전자 현미경에 남아되지 않도록 진공 밀봉 중요하다. 이 프로토콜은 로딩 절차와 몇 가지 필요한 시험에 대해 설명합니다. 전자 현미경의 동작이 간단하고, BU그것은 고체 시료의 현미경에 비해 몇 가지 추가 단계가 필요 t를. 액체의 두께가 증가함에 따라, 더 많은 전자가 흡수 액체에 의해 산란; 액체 두께의 측정이 필수적이다. 마지막으로, 프로토콜은 연구 될 수 있는지의 이미지를 촬영하는 방법과 동적 프로세스 설명한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54943/54943fig1.jpg"> 그림 1 : 주사 투과 전자 현미경 (STEM)에 대한 액체 흐름 셀. (A) 조립 된 액체 셀의 도식입니다. 실리콘 질화물 (SIN) 막 창 두 개의 실리콘 마이크로 칩 두 개의 O 링 사이에 위치한다. 액체는 죄 막 사이에 밀폐되고, 따라서 전자 현미경의 진공으로부터 분리된다. 샘플 위에 초점을 맞춘 전자빔 검색합니다. 대비 산란 전자에서 얻을 수있다. 금 나노 입자 (AuNPs는) 죄 막에서 액체 내에서 고정화뿐만 아니라 이동할 수액체. O 링 두 마이크로 칩 적층 체 (B) 측면도 단면. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54943/54943fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>쌍안 광학 현미경</td><td>Leica</td><td>M60 CMO</td><td></td></tr><tr><td>주사 투과 전자 현미경 구면 수차 보정기가 있는</td><td>JEOL</td><td>ARM200F</td><td></td></tr><tr><td>액체 흐름 TEM 표본 홀더</td><td>DENS 솔루션</td><td>해양</td><td></td></tr><tr><td>미세유체 주사기 펌프</td><td>Harvard Scientific</td><td>PicoPlus</td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 클리너</td><td>Gatan</td><td>Solarus950</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetone, Rotisolv&nbsp; HPLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7328.2</td><td></td></tr><tr><td>물, HPLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34877-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>에탄올, Rotisolv HPLC 등급</td><td>Carl Roth</td><td>P076.2</td><td></td></tr><tr><td>금 콜로이드 구연산염 안정화, 직경 30nm</td><td>British-Biocell</td> EM에 대한 플러스<td>. GC20</td><td></td></tr> <tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Base 실리콘 마이크로 칩은 50nm 두께의 질화 규소 멤브레인과 20 &micro 치수를 갖추고 있습니다. </td><td>해양 시스템</td><td></td>을위한 m x 0.40 mm <td>DENS 솔루션</td></tr><tr><td>50nm 두께의 질화 규소 멤브레인이있는 스페이서 실리콘 마이크로 칩, 20 &마이크로 치수; m x 0.40mm 및 200nm DENS</td><td>해양</td><td>시스템</td><td></td></tr><tr><td>미세유체 엿보기 튜브</td>용 솔루션 <td>Upchurch Scientific</td><td>1570</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 교체 팁 핀셋</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(ESD PVDF(SV) 팁이 있는 항자성 내산성 스테인리스강 본체)</td><td>ideal-tek</td><td>2ASVR.SA</td><td></td></tr><tr><td>테프론 코팅 굽은 강철 핀셋("PTFE"가 있는 EMS SA) 코팅)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>78322-7Te</td><td></td></tr><tr><td>Teflon coated broadbeak steel tweezers (EMS 2A "PTFE" Coating)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>78322-2ATe</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton syringe, 1 mL, gastight (Model 1001 TLLX SYR)</td><td>Hamilton</td><td>81323</td><td></td></tr><tr><td>Clean room tissue Sontara Micropure AP (224 x 224mm)</td><td>DuPont</td><td>Sontara MicroPure</td><td></td></tr></tbody></table>

스캔 전송 전자 현미경을 사용하여 액체에 나노 크기의 개체의 동적 프로세스를 공부

Studying Dynamic Processes of Nano-sized Objects in Liquid using Scanning Transmission Electron Microscopy

완전히 액체에 포함 된 샘플은 투과 전자 현미경 (TEM) 및 STEM에 대한 시편 홀더에 조립 된 미세 유체 챔버를 사용하여 주사 투과 전자 현미경 (STEM)와 나노 크기의 공간 해상도에서 공부 할 수 있습니다. 미세 유체 시스템은 얇은 실리콘 질화물 (SIN) 막 창을 지원하는 두 개의 실리콘 마이크로 칩으로 구성되어 있습니다. 이 문서에서는 샘플로드 및 데이터 수집의 기본 단계를 설명합니다. 무엇보다 중요한 액체 구획이 제대로 따라서 얇은 액체 층과 진공 밀봉을 제공 조립되어 있는지 확인하는 것입니다. 이 프로토콜은 또한 정확한 조립을 보장하기 위해 샘플 로딩 동안 수행하는데 필요한 테스트들을 포함한다. 샘플이 전자 현미경에 장착되면, 액정 두께를 측정 할 필요가있다. 너무 얇은 액체는 기포가 형성되면 액상의 부재를 나타낼 수있는 반면 잘못된 조립이 너무 두꺼운 액체 초래할 수있다. 마지막으로, 프로토콜공부하는 방법을 이미지를 촬영하는 방법과 동적 프로세스에 대해 설명합니다. AuNPs를 함유하는 샘플은 순수한 물과 식염수 모두 이미징된다.

액체 유통 TEM 홀더는 액체의 AuNPs의 동작을 연구하기 위해 사용되었다. AuNPs 안정적 순수 죄 막에 고정화하고, 액상 STEM (도 6)를 사용하여 나노 스케일 해상도 영상화 하였다. 우수한 콘트라스트를 강하게 산란 금을 얻었다. 이 삽입 된 액체 흐름 TEM 홀더 8 PA / cm²에 달 동안 건조 시료 측정 형광면상의 전류 밀도 20 PA / cm²이었다. 200㎚의 스페이서의 두께에 기초하여 예상 된 것보다 훨씬 더 큰 식 1, t 물 = 2.4 ± 0.5 μm의 사용. 그럼에도 불구하고, 두께는 나노 미터 공간 해상도와 AuNPs의 영상에 대한 너무 큰되지 않습니다. 액체 두께 때문에 마이크로 칩의 죄 막, 비 평탄도의 팽창, 파편이 마이크로 칩에있는에 스페이서가 설정 한 200 나노 미터보다 두꺼운했다. 16시 그 형태를 유지하지만, 반응성 방사선 분해 제품 (예 - 수성, H •, H +, • OH) 전자 빔의 상호 작용으로부터 기인 물은 AuNPs (15)의 형상의 변화를 선도하는 단일 금 원자를 산화 할 수있다. 액체 유동 시스템은 제 2 실험에 염화물 이온을 도입하는 데 사용 된 경우에는, 상기 AuNPs의 안정성 변경됨. 염화물 이온은 tetrachloroaureat의 형태로 산화 금 원자를 안정화시킬 수 있으며, AuCl 4 -. 그림 7은 결과와 유사한 천천히 STEM 이미징 시간 경과 시리즈 중에 용해 된 AuNPs가 16 이전에보고 된 것을 알 수있다. 사용 된 전자 선량률 들어, 30 nm의 크기를 용해 AuNPs ~ 300의했다. 물 공급에 AuNPs의 움직임 r은 세 번째 실험 (그림 8)에서 공부했다. 실험 전에, 액체 흐름 TEM 홀더 염의 흔적을 제거하기 위하여 세척 하였다. 첫 번째 실험과는 다른, 또 다른 샘플 준비 방법은 죄 막 (14)에 AuNPs의 약한 부착을 달성하기 위해 사용되었다. 용액을 건조시키는없이 본 실험에서 AuNP 용액 실리콘 마이크로 칩 상에 배치하고, 액체 흐름 TEM 홀더에 조립. 이러한 방식으로, AuNPs 쉽게 사용 선량률에서 촬상시의 SiN 막으로부터 분리. 나머지 AuNPs이 죄 창에 근접 시야 내에서 유지하면서 AuNPs 중 일부는 멀리 대량 솔루션에 시야에서 움직였다. 이러한 AuNPs의 이동이 관찰되었고, 결국은 응집. 잠시 후,이 덩어리는 죄 막에서 분리 및 시야에서 그리고 솔루션으로 이동했다. ntent "FO : 유지-together.within 페이지 ="1 "&gt; <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/54943/54943fig6.jpg"> 그림 6 : 순수 계층의 상단에 지름에 AuNPs 30 나노 미터의 스캐닝 투과 전자 현미경 (STEM) 현미경 사진. 도시 된 이미지는 원본 이미지의 선택된 영역이다. 이미지 크기가 화소의 지속 시간은 19 μS이었고, 1024 X 024 픽셀이고, 화소 사이즈는 0.73 nm 인이었고, 배율 400,000X이었다. 전자 선량 따라서 7.1 × 104이었다 E - / nm². 상기 액체는 2.4 μm의 두께에 상당하는 계산하도록 형광면에서 측정 된 전류 밀도, 8 PA / cm 2이었다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54943/54943fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/54943/54943fig7.jpg"> 그림 7 : 시간 경과 시리즈식염수에 AuNPs의 STEM 현미경 사진의. (AD) 이미지는 30 초 간격으로 STEM 이미지의 시간 경과 시리즈에서 추출 하였다. AuNPs 서서히 염화 이온의 존재의 결과로서 액체에 용해. 화소의 지속 시간이 2 μs의 시간 경과 일련의 프레임 시간시켰다 1.75 S이고, 화소 사이즈는 0.44 nm 인이었고, 배율 500,000X이었다. 이미지 당 전자 용량은 1.2 × 10 (4) 전자이었다 - / nm². 액체 두께는 2.4 μm의이었다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54943/54943fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/54943/54943fig8.jpg"> 그림 8 : 순수한 물에 이동 AuNPs의 현미경 사진 STEM. 여러 가지가 화살표로 선택되어있는 AuNPs와 (A)의 SiN 막. (B) 모션 트랙선택한 AuNPs의 (A 참조). 일부 AuNPs은 영상의 시간 동안 시야에서 멀리 이동합니다. 나머지 AuNPs은 죄 막 따라 옆으로 이동하고 응집 시작합니다. 프레임 시간은 0.52 S이고, 1 μS이었다 중요한 클러스터 크기에 도달하면, 그것들은 막으로부터 파견 view.The 화소 체류 시간의 분야에서 벗어나, 화소 크기가 1.8 나노 미터이고, 배율 120,000X이었다. 이미지 당 전자 용량은 3.5 × 10 (2) 전자이었다 - / nm² 액체 두께는 2.4 μm의이었다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54943/54943fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 나노 동적 프로세스의 관찰을 위해 사용 된 물 AuNPs의 투과 전자 현미경을 스캔하기위한 액체 유동 시편 홀더의 동작을 설명한다.

Samples fully embedded in liquid can be studied at a nanoscale spatial resolution with Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM) using a ...

액상 주사 투과 전자 현미경의 전반적인 목표는 최대 수 마이크로미터 두께의 액체 층에 완전히 내장된 생물학적 샘플에서 나노 물질의 구조와 현상을 관찰하는 것입니다. 이 방법은 액체에서 나노 물질의 거동 및 자연 액체 환경에서의 생물학적 샘플 연구와 같은 재료 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 액체의 표본에 대한 나노 크기의 형태학적 정보를 제공한다는 것입니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 표본 홀더의 로딩 및 이미지 획득이 전자 현미경으로 처음 수행한 것만큼 간단하지 않기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 절차를 시작하려면 깨끗한 층류 후드에서 섬유가 없는 조직과 순수 에탄올로 광학 현미경 유리 슬라이드를 청소합니다. 뚜껑이 있는 페트리 접시에 담긴 클린룸 티슈에 슬라이드를 놓습니다.SiN 마이크로칩을 조작하려면 탄소 코팅 핀셋을 사용하여 마이크로칩을 단단하지만 조심스럽게 잡고 SiN 멤브레인이 항상 위쪽을 향하도록 유지합니다. 이 기술을 사용하여 스페이서가 없는 마이크로칩 5개와 200나노미터 스페이서가 있는 마이크로칩 5개를 유리 슬라이드에 놓습니다. 페트리 접시를 닫고 마이크로칩을 흄 후드로 가져옵니다.멤브레인 면이 위로 향하게 하여 HPLC 등급 아세톤의 비커에 마이크로칩을 놓습니다. 비커를 2분 동안 부드럽게 돌려 보호 코팅을 제거하고 마이크로칩이 뒤집히지 않도록 주의합니다. 그런 다음 마이크로칩을 순수 에탄올 비커로 빠르게 옮깁니다.비커를 알루미늄 호일로 덮습니다. 비커를 2분 동안 부드럽게 휘젓어 코팅 제거를 완료하고 밀폐된 페트리 접시에 담아 층류 후드로 가져옵니다. 마이크로칩을 새 클린룸 티슈에 놓고 핀셋에서 마이크로칩이 분리될 때 마이크로칩이 뒤집히지 않도록 주의하십시오.마이크로칩을 몇 분 동안 건조시킵니다. 그런 다음 페트리 접시의 유리 슬라이드에 마이크로칩을 놓습니다. 페트리 접시를 닫고 마이크로칩을 플라즈마 클리너로 가져옵니다.유리 슬라이드와 마이크로칩을 플라즈마 클리너에 넣고 5분 세척 프로그램을 실행하여 SiN 멤브레인에서 탄화수소를 제거합니다. 광학 현미경을 사용하여 마이크로칩에 파열된 멤브레인이나 먼지 입자가 있는지 검사합니다. 손상되거나 더러운 마이크로칩은 버리십시오.층류 후드에서 내부 표면이 끈적끈적한 깨끗한 운송 상자에 마이크로칩을 고정합니다. 3몰 구연산염 안정화 수성 금 나노입자 용액의 1마이크로리터 방울을 스페이서 없이 각 마이크로칩의 SiN 멤브레인에 적용하고 용액을 건조시킵니다. 그런 다음 1마이크로리터의 탈이온수를 멤브레인에 바르면 소금과 계면활성제가 씻겨 나옵니다.30초 후 여과지를 사용하여 조심스럽게 물을 두드리고 마이크로칩을 건조시킵니다. 액체 흐름 TEM 홀더의 끝을 쌍안 광학 현미경 아래에 놓습니다. 홀더 팁에서 티타늄 뚜껑을 제거하고 알루미늄 호일 시트에 놓습니다.0.5ml의 HPLC 등급 물이 들어있는 1ml 유리 주사기로 미세유체 주사기 펌프를 설정합니다. 주사기를 유량 시스템에 연결하고 펌프를 시동합니다. 물이 시스템을 통해 흘러내릴 때 라인에 누수나 흐름 수축이 있는지 확인하십시오.펌핑이 완료되면 액체 셀 구획에서 헹굼을 제거하고 홀더 팁을 여과지로 건조시킵니다. 광학 현미경으로 홀더 팁을 검사합니다. 클린룸 티슈로 팁을 말리고 깨끗한 PTFE 코팅 핀셋으로 먼지나 섬유를 제거합니다.홀더 팁 덮개, O-링 및 나사를 검사하고 PTFE 코팅 핀셋으로 먼지나 섬유를 제거합니다. 홀더 그룹에 O-링을 놓습니다. 첫 번째 나사를 놓고 몇 번 돌려 그대로 두도록 합니다.깨끗한 곡선형 핀셋을 사용하여 SiN 멤브레인이 위쪽을 향하도록 하여 샘플 마이크로칩을 홀더 팁의 주머니에 넣습니다. 쌍안 광학 현미경을 사용하여 마이크로칩이 올바르게 장착되었는지 확인하십시오. 0.3마이크로리터의 순수한 여과수 한 방울을 샘플 마이크로칩에 떨어뜨립니다.핀셋으로 마이크로칩을 제자리에 고정합니다. 그런 다음 구부러진 핀셋이 거꾸로 고정된 스페이서 마이크로칩을 집습니다. 마이크로칩 멤브레인이 아래를 향하도록 핀셋을 조심스럽게 회전합니다.샘플 마이크로칩에 스페이서 마이크로칩을 놓습니다. 홀더 팁 아래에 광 반사 재료를 놓고 쌍안 광학 현미경 아래에서 마이크로칩 정렬을 확인합니다. 핀셋을 사용하여 SiN 창이 정렬되지 않은 경우 마이크로칩을 조심스럽게 조정합니다.그런 다음 핀셋으로 표본 챔버 뚜껑을 들어 올립니다. 뚜껑을 거꾸로 뒤집고 마이크로칩을 건드리지 말고 뚜껑 뒷면을 홀더 팁에 올려놓습니다. 핀셋을 사용하여 나머지 나사를 놓고 두 나사를 반복적으로 조입니다.저항을 만날 때까지 조심스럽게 조입니다. 조임이 너무 강하면 창문이 쉽게 깨질 수 있습니다. 시스템을 통해 분당 4마이크로리터의 액체 흐름을 시작하고 홀더 팁에 누출이 있는지 확인합니다.그런 다음 홀더를 진공 펌프 스테이션으로 가져와 누출 점검을 수행합니다. 압력이 5분 이내에 최소 10에서 음의 5mbar에 도달하도록 합니다. 홀더를 인클로저에 넣습니다.그리고 홀더를 전자 현미경으로 가져옵니다. STEM 모드에서 현미경을 설정합니다. 물 없이 금 나노 입자로 코팅된 얇은 탄소 필름을 기준 샘플로 사용하여 전자빔의 전류 밀도를 측정합니다.분당 2마이크로리터 이하의 속도로 순수한 물의 흐름을 시작하십시오. 액체 흐름 TEM 홀더를 진공 부하 잠금 장치에 삽입하고 대피를 시작합니다. 압력이 정상적으로 감소하는지 확인하십시오.그런 다음 TEM 홀더를 현미경에 완전히 삽입합니다. 압력이 충분히 낮아지면 빔 밸브를 열고 ADF 감지기를 삽입합니다. 현미경을 연속 수집 모드로 설정하고 샘플 스테이지를 X 및 Y 방향으로 변환하여 SiN window를 찾습니다.창의 가장자리가 명확하게 보이도록 대비와 밝기를 조정합니다. 스테이지를 X 및 Y 방향으로 변환하여 창의 모서리가 시야의 중심에 오도록 합니다. 그런 다음 대물 렌즈를 재설정합니다.샘플 스테이지의 수직 위치를 조정하여 모서리의 초점을 거칠게 맞춥니다. 스테이지를 앞뒤로 5도 기울여 샘플이 유센트릭 높이에 있는지 확인합니다. 창 모서리를 시야의 중앙에 배치한 다음 소프트웨어에 스테이지 위치를 저장합니다.금 나노 입자가 보일 때까지 스테이지를 X 및 Y 방향으로 이동합니다. 그런 다음 대물 렌즈의 초점을 맞춥니다. 전류 밀도를 기록하고 액체 셀 두께를 계산합니다.스테이지를 X 및 Y 방향으로 변환하여 최소 20개의 금 나노 입자가 있는 영역을 찾습니다. 매개변수를 설정하고 이미지를 획득합니다. 금 나노 입자는 질화규소 멤브레인에 고정되고 액상 STEM으로 이미지화됩니다.순수한 물에서 금 나노 입자는 이미징 전반에 걸쳐 모양을 유지했습니다. 물에서 나오는 방사선 분해 생성물은 개별 금 원자를 산화시켜 결국 나노 입자의 모양을 바꿀 수 있습니다. 또 다른 실험에서는 염화물 이온이 액체 상태로 유입됩니다.금 나노 입자는 산화 된 금 원자가 용해성 테트라 클로로 aureat를 형성함에 따라 실험을 통해 천천히 용해되었습니다. 물 속에서 금 나노 입자의 움직임을 조사하기 위해 후속 실험에서 나노 입자는 샘플 멤브레인에서 완전히 고정되지 않았습니다. 금 나노 입자는 응집되어 임계 클러스터 크기에 도달했을 때 시야 밖으로 이동했습니다.이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 두 시간 안에 완료할 수 있습니다. 몇 주간의 교육이 필요합니다. 이 절차를 시도하는 동안 침착하게 작업하고 진공 기밀성과 액체 두께를 확인하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.개발 후 이 기술은 재료 과학, 화학 및 생물학 분야의 연구원들이 액체의 나노 입자 성장 및 이동, 액체 환경에서 나노 크기의 물질 구조, 포유류 세포에서 단백질의 기능을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 표본 홀더의 올바른 로딩 및 현미경 조정을 포함하여 물층에 내장된 금 나노 입자의 주사 투과 전자 현미경을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 전자 현미경에서 액체로 작업하면 표본 홀더가 올바르게 로드되지 않으면 손상이 발생할 수 있음을 잊지 마십시오.따라서 적재하기 전에 진공 누출을 확인하는 것이 중요합니다.

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