액체-연질 물질 상호 작용 관찰을 위한 광 유도 현장 투과 전자 현미경

이 프로토콜은 액체 셀 TEM과 광 조명의 조합을 사용하여 광 조명시 감광제로 캡슐화 된 박테리아의 구조적 변화를 관찰하는 방법을 제시합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 단순성입니다. 이 프로토콜은 어려운 샘플 준비가 필요하지 않으며 광감작제 용액으로 박테리아를 충분히 캡슐화합니다.

시작하려면 광섬유를 대물 렌즈 상단의 현미경 기둥에 연결하여 투과 전자 현미경을 수정합니다. 대물 렌즈와 콘덴서 렌즈 사이에 몇 센티미터의 공간과 액세서리를 위한 여유 슬롯을 확보하십시오. 두 개의 교차 핀셋 사이에 비정질 탄소로 덮인 두 개의 처리되지 않은 TEM 그리드를 놓고 탄소 코팅면을 상단을 향하게 합니다.

그리드를 가장자리에 최대한 가깝게 잡습니다. 그리드 중 하나에 4 마이크로 리터의 박테리아 용액을 놓습니다. 샘플의 광학 밀도는 5에서 10 사이 여야합니다.

60 초 동안 기다렸다가 여과지를 사용하여 액체를 조심스럽게 닦아냅니다. 이 과정에서 전체 그리드 표면에 액체를 퍼뜨리십시오. 4 마이크로 리터의 감광제를 동일한 그리드에 놓습니다.

5 초 후 액체를 닦아냅니다. 기판에 매우 얇은 액체 층을 남겨 둡니다. 액체로 덮인 그리드 위에 마른 그리드를 빠르게 놓습니다.

상단 그리드를 두 번째 그리드의 가장자리로 부드럽게 이동하고 핀셋을 사용하여 가장자리에서 기판을 꽉 쥐십시오. 조심스럽게 짜기를 반복하십시오. 핀셋 사이에 액체 셀을 1 분 동안 그대로 두십시오.

준비가 완료된 직후 샘플을 TEM 홀더에 삽입하십시오. 샘플을 현미경에 삽입한 후 저배율 모드에서 관찰을 시작하여 적절한 관찰 영역을 찾습니다. 관찰하는 동안 전자 선량을 가능한 한 낮게 유지하십시오.

노출 시간을 확장합니다. 노출 시간이 길어진 적절한 배율에서 액체로 둘러싸인 세포를 찾아 즉시 첫 번째 이미지를 캡처합니다. 전자 선량을 일정하게 유지하고 30 초마다 이미지를 수집하여 변화를 관찰하십시오.

조심스럽게 이미지를 검사하고 세포의 첫 번째 가시적 변화에 해당하는 총 전자 선량을 계산하십시오. 실험을 시작하기 전에 현재 값을 조정하여 레이저 광 강도를 설정하십시오. 샘플을 현미경에 삽입하고 관찰 영역을 찾습니다.

샘플의 조명을 시작하기 전에 셀의 첫 번째 이미지를 캡처하고 빔 블랭커를 사용하여 전자 조사의 영향을 피하기 위해 전자빔을 끕니다. 레이저를 켭니다. 레이저 광의 강도가 상대적으로 높기 때문에 짧은 조명 시간으로 시작하십시오.

그 시간이 지나면 광원을 끕니다. 빔 블랭커를 끄고 즉시 이미지를 캡처하십시오. 가능하면 자동 알고리즘을 사용하여 이미지를 촬영하는 데 필요한 시간 동안만 샘플을 노출합니다.

전자 조사 시간을 주의 깊게 측정하여 이미징에 사용되는 전자 선량을 계산합니다. 1 분 후에 광감작 제의 더 가벼운 방사선에 의해 생성 된 활성 산소 종에 의해 유발 된 세포 외부 층의 현저한 분해가 관찰됩니다. 추가 조명 조명으로 변경 사항이 더 잘 보입니다.

액체가 충분한 적절한 관찰 지점은 저배율에서 쉽게 찾을 수 있습니다.이 영역은 더 어둡고 흐릿하게 보입니다. 액체로 덮인 박테리아는 건조한 박테리아보다 눈에 잘 띄지 않지만 여전히 구별 할 수 있습니다. 이미징 중에 액체 경계를 보는 것이 유용하며 움직임을 쉽게 감지 할 수 있으므로 선택한 영역이 부적절하고 불안정 할 수 있습니다.

관찰 중 또 다른 문제는 박테리아 주변 영역을 포함하여 샘플의 무작위 영역에서 발생할 수 있는 물의 증발과 용액의 침전입니다. 박테리아의 캡슐화는 그래 핀 및 질산 규소 막을 사용하여 수행 할 수도 있습니다. 샘플 준비는 더 어렵지만 액체 셀의 안정성은 더 좋습니다.

제시된 방법은 액체에 대한 광 유도 반응의 관찰에 사용될 수 있습니다. 예를 들어, 금속 재료에 대한 빛의 영향, 광 유도 촉매 및 광화학 반응.