Name: 생산, 결정화 및 구조 결정의 C. 남과 어울리지 않는 PPEP-1 Microseeding 및 아연 SAD를 통해 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: 배우세요 Clostridium difficile의 PPEP-1 메탈로프로테아제 결정화 방법을 마이크로시딩 기법으로 단일 격자 고품질 결정을 효율적으로 생산하여 X선 회절 분석과 구조 생물학 연구에 활용하는 기술입니다.

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우리는 싱크로트론 데이터 수집시 지원을위한 스위스 광원, 폴 Scherrer의-연구소, Villigen, 스위스의 빔라인의 X06DA에서 직원을 감사드립니다. 우리는 우수한 기술 지원 모니카 Gompert에 감사하고 있습니다. 이 프로젝트는 쾰른 대학에서 지원과 독일 연구 협의회에서 INST 216 / 682-1 FUGG을 부여했다. CP에 개발 건강과 질병의 국제 대학원에서 박사 교제는 인정된다. 이러한 결과로 이어지는 연구는 보조금 계약 번호 283570 (BioStruct-X)에서 유럽 공동체의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7 / 2007-2013)에서 자금을 받았다.

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X 선 결정학은 여전히 단백질 (28)의 입체에 가까운 해상도 원자 구조를 결정하기위한 가장 빠르고 가장 정확한 방법이다. 그러나, 잘 정렬 된 단결정의 성장을 필요로한다. 이들은 종종 얻을 수 어렵고, 결정 상태는 인공이다. 그러나, 다른 방법에 의해 결정된 것과 X 선 결정학에 의해 결정된 구조 단백질의 비교 특히 NMR, 일반적으로 매우 잘 일치 함을 나타낸다. PPEP-1의 경우에, NMR 구조는 S 루프의 이동을 포함하여, 우리의 결정 구조 (14)가 최근 29 방송 잘 일치 출판. 이 프로토콜은 구조 연구 및 태그가없는 rPPEP-1의 결정화 및 구조 결정을위한 N 말단 그의-태그 rPPEP-1 단백질의 생산 및 정제에 대해 설명합니다. 단일 결정은이 경우에 성장하기 어려운했고, 특별한 microseeding 절차를 요구했다. t에서그는 절 다음 우리는 PPEP-1의 결과를 논의하고 프로토콜이 다른 단백질의...

클로스 트리 디움 디피는 원내 항생제 관련 설사 감염 1의 주요 원인 중 하나입니다. 이 그람 양성 혐기성 세균은 분변 - 경구 경로를 통해 그 포자 양식을 통해 전송된다. 지난 10 년, 새로운 &#39;전염병&#39; &#39;또는&#39; &#39;hypervirulent&#39; &#39;균주 (/ 027 예를 들어, BI / NAP1)는 북미와 유럽이 새로운 감염과 사망률의 급격한 증가가 발생했습니다. C. 디피 -associated 질환 (CDAD)는 높은 사망률 3 생명을 위협하는 대장 염증이다. 증상은 설사 4에서 위 막성 대장염 (5)와 종종 치명적 독성 거대 결장 (6)에 이르기까지 다양합니다. 유독 균주 다제 내성 및 재발 7 높다으로 CDAD 치료가 어렵다. 현재 치료법은 항생제 메트로니다졸, fidaxomicin 또는 반코마이신 또는 repetiti에 포함에서vely 재발하는 경우 분변 미생물 이식. 새로운 치료 전략이 시급히 8 필요하다. 일부 진보가 C. 디피 독소 B (9)을 대상으로, 치료 단클론 항체 Bezlotoxumab로 기록, 최근 성공적으로 임상 3 상을 통과하고 FDA 및 EMA에 승인을 신청했다. 또한, 새로운 항생제 임상 시험 (10)의 다른 단계에서 순간에서 시험되고있다. 새로운 치료 표적을 식별해야 효과적인 치료를 개발합니다. (; CD2830 / Zmp1, PPEP-1 EC 3.4.24.89)가 최근 C. 디피 단백질 분해 효소 프롤린 - 프롤린 엔도 펩 티다 제-1 발견 노크 아웃 변형에 PPEP-1의 부족 등 유망한 대상이되고, C의 독성을 감소 . 생체 내 11 디피. PPEP-1은 C 말단에 두 C. 디피의 adhesins를 절단 분비 메탈로 12, 13 (13), 따라서 부착 bacter를 해제인간의 장내 상피 세포에서 아이오와. 따라서, C. 디피의 정착과 운동성 표현형 사이의 균형을 유지에 관여한다. PPEP-1에 대해 선택적 저해제를 개발하고 그 기판의 입체 구조의 자세한 지식이 필요 불가결 인식하는 방식을 이해하는 것이. 우리는 기질 펩티드 14 PPEP-1 단독 컴플렉스의 제 결정 구조를 해결했다. PPEP-1은 제 1 공지 프로테아제 두 개의 프롤린 잔기 (15) 사이를 선택적으로 절단하여 펩티드 결합. 이것은 이중 꼬임 방식으로 기판에 결합하고, 프로테아제 활성 부위 (14)를 덮는 S 루프에있는 잔기 연장 된 지방족 - 방향족 네트워크를 통해 안정화. 이 기판 결합 모드는 PPEP-1에 고유하며 현재까지 인간의 단백질 분해 효소에서 찾을 수 없습니다. 이것은 유망한 약물 표적하게, 매우 가능성 억제제의 오프 대상 효과. 화면 선택 PPEP-1 INH 개발하려면ibitors은 향후 순수한 단 분산 PPEP-1 단백질의 다량이 필요하다. 또한, 결정되어야 할 것이다 PPEP-1 제 억제제, 공동 결정 구조의 결합 모드를 결정한다. 우리의 손에 PPEP-1은 지속적으로 (intergrown)의 결정을 생성합니다. 따라서 우리는 PPEP-1의 단일 회절 품질의 결정을 생성하는 최적화 과정을 개발 하였다. 이 프로토콜에서 우리는 구체적으로 PPEP-1 (14)의 생산, 정제, 결정화 및 구조 솔루션을 설명합니다. 우리는 분비 신호 서열, 정제 태그의 제거와 친 화성 크로마토 그래피 및 크기 배제 크로마토 그래피 부족한 PPEP-1 변이체의 대장균 세포 내 발현을 사용하여, 아연의 단일 파장 이상 분산을 통해 최적화 화면 구조 결정에 16 microseeding 이어 (아연 SAD) 17. 이 프로토콜은 (다른 단백질의 제조 및 구조 결정에 적용 할 수있다 예를 들어, &lt;/ EM&gt; 메탈로) 및 (intergrown)의 결정을 생산하는 단백질 관한 것이다. 요청시 구조물의 플라스미드 DNA는 (는 pET28a-는 NHIS-rPPEP-1)의 회절 데이터는 교육 목적으로 제공 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Genes / Vectors / cell strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET28a vector</td><td>Merck-Millipore</td><td>69864</td><td>Thrombin cleavable N-terminal His-tag</td></tr><tr><td>E. coli strain BL21 (DE3) Star</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C601003</td><td>RNase H</td></tr><tr><td>PPEP-1 (CD630_28300)의 결핍 코돈 최적화 유전자 (E. coli)</td><td>Geneart (Thermo Fisher Scientific)</td> <td>맞춤형</td><td>아미노산 27-220</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yeast 추출물</td><td>모든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>트립톤</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>소포제 B</td><td>: 시그마 - 알드리치</td><td>A5757</td><td>수성 실리콘 에멀젼</td></tr><tr><td>한</td><td></td><td></td><td></td></tr>천 <tr><td>:</td><td></td><td></td><td>모든</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>AppliChem</td><td>A1008</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>AppliChem</td><td>A1087</td><td>버퍼 등급</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>: 모든</td><td></td><td>버퍼 등급</td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>이미다졸</td><td>AppliChem</td><td>A1073</td><td>완충 등급</td></tr><tr><td>트롬빈</td><td>시그마-알드리치</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>인산암모늄 이염기성</td><td>시그마-알드리치</td><td>215996</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤 100%</td> <td>모든</td><td></td><td>순수 등급</td></tr><tr><td>자당</td> 시<td>그마-알드리치</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>액체 </td><td></td><td></td><td>결정의 저장 및 cryocooling을 위한</td> 질소</tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>Equipment(일반)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>shakeing 인큐베이터</td><td>는</td><td></td><td>20의 온도를 제공합니다. &데그; 씨 - 37 &deg; C</td></tr><tr><td>유리 제품</td>, <td>당</td><td></td><td>황한 삼각 플라스크 (50 ml - 2.8 L),</td></tr> <tr><td>큰 배양 부피를 위한 원심분리기</td>, <td>최대 12L 부피를 처리하기 위한 모든</td><td></td><td></td> 원심분리기</tr><tr><td>, 초음파 발생기, Vibra-Cell VCX500</td>, <td>Sonics</td><td>SO-VCX500</td><td>또는 기타 초음파 발생기/세포 교란기</td></tr>, <tr><td>초원심분리기</td>, <td>최대 150,000 x g</td><td></td>의 속도를 제공하는 모든 <td></td> 원심 분리기</tr><tr><td>NiNTA Superflow 수지</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>빈 유리 Econo-Column</td><td>Bio-Rad</td><td>7371007</td><td>또는 기타 빈 유리 또는 플라스틱 컬럼</td></tr><tr><td>크기 제외 크로마토그래피 컬럼 HiLoad Superdex 200 16/600</td><td>GE 헬스케어</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>크로마토그래피 시스템 및 Auml; kta 정제기</td>, <td>GE 헬스케어</td><td>28406264</td><td>또는 기타 크로마토그래피 시스템</td></tr>, <tr><td>투석 튜브, Spectra/Por 3</td><td>, Spectrum Labs</td><td>132724</td><td></td></tr><tr><td>투석 튜브 마개,</td><td>Spectrum Labs</td><td>132738</td><td></td></tr><tr><td>한외여과 장치(집광기), 10,000 NWCO</td>, <td>모든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis 분광 광도계</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>Equipment (crystallography)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Low volume pipette 0.1-10 &micro; l</td><td>모든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>양성 변위 피펫, Microman M10</td>, <td>Gilson</td><td>F148501</td><td></td></tr><tr><td>결정화 로봇</td>, <td>96</td><td></td><td></td></tr><tr><td>-웰 결정화 플레이트, TTP IQ, 세 개의 단백질 웰이 있는 TTP</td> IQ <td>TTP</td><td>4150-05810</td><td>또는 기타 96-웰 결정화 플레이트&nbsp;</td></tr><tr><td>24웰 콤비클로버 주니어 플레이트</td><td>예나 바이오사이언</td>스 <td>EB-CJR</td><td></td></tr><tr><td>크리스탈 클리어 씰링 테이프</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-511</td><td></td></tr><tr><td>실리콘화 유리 커버 슬라이드</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-225</td><td></td></tr><tr><td>상업용 결정화 스크린: SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal</td><td>Hampton Research</td><td>다양한</td><td></td></tr><tr><td>상업용 결정화 스크린: Wizard, PACT++, JCSG++</td><td>Jena Bioscience</td><td>다양한</td><td></td></tr><tr><td>JBS 비즈-for-seeds</td><td>Jena Bioscience</td><td>CO-501</td><td></td></tr><tr><td>CrystalCap SPINE HT (나일론 루프)</td><td>Hampton Research</td><td>다양한</td><td>루프 크기 0.025 mm - 0.5 mm</td></tr><tr><td>CrystalCap 바이알</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-904</td><td></td></tr><tr><td>극저온 폼 듀어 800 ml</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-673</td><td></td></tr><tr><td>극저온 폼 듀어 2 L</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-675</td><td></td></tr><tr><td>바이알 클램프, 스트레이트</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-670</td><td></td></tr><tr><td>CrystalWand 마그네틱, 스트레이트</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-729</td><td></td></tr><tr><td>CryoCane 6 바이알 홀더</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-711</td><td></td></tr><tr><td>CryoSleeve</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-708</td><td></td></tr><tr><td>CryoCane 컬러 코더 - 화이트</td><td>햄프턴 리서치</td><td>HR4-713</td><td></td></tr><tr><td>메스</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>어떤<td>직선 마이크로펜셉</td>트든지, <td>밀봉 테이프의 조작을 위한 어떤 것이든. etc.</td><td></td>침술 바늘 아무거나예: 약국에서 실체 현미경 아무거나 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>결정화판 및 결정 장착 검사용, 최대 160X 배율</td></tr></tbody></table>

생산, 결정화 및 구조 결정의<em&gt; c. 남과 어울리지 않는</em&gt; ppep-1 microseeding 및 아연 sad를 통해

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

인간의 건강에 큰 위협이 되는 클로스트리듐 디피실 감염을 치료하기 위해서는 새로운 치료법이 필요합니다. C. 디피실 메탈로프로테아제 PPEP-1은 병원체의 독성을 감소시키기 위한 억제제의 향후 개발 목표입니다. 생물물리학적 및 구조적 특성화와 억제제 스크리닝을 수행하려면 많은 양의 순수 및 활성 단백질이 필요합니다. 당사는 E. coli를 발현 숙주로 사용하여 PPEP-1의 효율적인 생산 및 정제를 위한 프로토콜을 개발하여 결정화 및 구조 결정을 위한 충분한 양과 순도의 단백질을 산출합니다. 또한 마이크로 시딩을 사용하여 PPEP-1의 고도로 상호 성장된 결정을 X선 회절 분석에 적합한 잘 정렬된 결정으로 성장시킬 수 있습니다. 이 방법은 또한 다른 재조합 단백질을 생산하고 상호 성장된 결정을 생성하는 다른 단백질의 구조를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

rPPEP-1은 대장균 BL21 (DE3) 스타 (도 1C)에서 가장 높은 수율로 여러 대장균 균주에서 과발현된다. 제 NiNTA 친 화성 크로마토 그래피 단계 후 6xHis 태그가 성공적으로 단백질의 대부분으로부터 절단 될 수 있으며, 상기 제 NiNTA 단계에서 소화되지 않은 단백질은 완전히 트롬빈 분해 단백질 (도 1D)로부터 분리 될 수있다. 가끔 대부분의 아마 이량 종 (그림 2A)에 해당하는 잘난척와 모노머와 같은 S200 16/600 열 태그가없는 rPPEP-1를 마이그레이션합니다. 단백질은 (도 2b) 순수 수율 대장균 배양 한 L 내지 약 50 mg의 단백질이다. rPPEP -1- 종종 인산염을 포함하는 다양한 조건 (도 3)의 결정화. 결정은 매우 모든 ...

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1)은 인간 병원균 Clostridium difficile에서 분비되는 metalloprotease 및 유망한 약물 표적입니다. 여기에서는 이 단백질의 생산 및 구조 결정에 필요한 모든 방법을 설명합니다.

생산, 결정화 및 구조 결정의<em&gt; C. 남과 어울리지 않는</em&gt; PPEP-1 Microseeding 및 아연 SAD를 통해

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

이 절차의 전반적인 목표는 재조합 프롤린 프롤린 엔도펩티다아제-1 또는 rPPEP-1 단백질의 단일 격자 회절 품질 결정을 효율적으로 성장시키는 것입니다. 이 방법이 없으면 rPPEP-1은 X선 회절 분석에 적합하지 않은 고도로 상호 성장된 결정을 즉시 생성합니다. 이 기술의 주요 장점은 rPPEP-1의 구조적 측정을 위한 많은 수의 잘 정렬되고 잘 회절된 결정을 단기간에 제한된 재료 입력으로 생산할 수 있다는 것입니다.이 절차는 마이크로시티 방법을 사용하며 rPPEP-1 및 기질 펩타이드 복합체의 모든 성공적인 초기 결정화 조건에 맞게 조정할 수 있습니다. 이 방법은 상호 성장된 결정을 생성하는 거의 모든 단백질의 잘 정렬된 결정을 생성하도록 조정할 수 있습니다. 또한 교차 파종 실험, 단백질 분산 또는 저분자를 사용한 공결정화 실험에도 사용할 수 있습니다.결정화 방법의 취급에 대한 시각적 시연은 매우 중요한데, 그 이유는 작은 변화조차도 결정의 회절 품질에 상당한 영향을 미칠 수 있기 때문입니다. 시판되는 표준 스크린과 결정화 로봇을 사용하여 sitting drop 형식으로 결정화 시험을 수행합니다. 먼저, 원심 한외여과 장치를 사용하여 정제된 단백질을 4000배 g과 섭씨 4도에서 5분 간격으로 12mg으로 농축합니다.침전과 악화를 방지하기 위해 각 간격 후에 단백질을 혼합하십시오. 280 나노 미터에서 단백질 농도를 25, 몰 센티미터당 900의 흡광 계수를 사용하여 측정합니다. 단백질을 섭씨 20도까지 평형을 이룬 후 16000 회 g 및 섭씨 20도에서 10 분 동안 원심 분리로 모든 입자와 먼지를 제거합니다.결정 스크리닝을 수행하려면 미리 채워진 결정화 플레이트를 사용하여 밀봉하고 섭씨 4도에서 보관하십시오. 시험을 설정할 때 작은 볼륨이 빨리 마르므로 신속하게 작업하십시오. 또한 가능하면 로봇 도크 주변에 습도 챔버를 사용하십시오.모든 결정화 플레이트를 섭씨 20도로 평형을 이룬 후, 단백질 ent 저장소를 2-4개의 서브웰로 피펫팅하여 스크린을 설정합니다. 300나노리터의 방울 부피를 사용하십시오. 서브웰 2의 경우 200:100, 서브웰 3의 경우 150:150, 서브웰 4의 경우 100:200의 단백질 대 저장소 비율을 사용합니다.즉시 플레이트를 밀봉하고 섭씨 20도의 챔버에 넣으십시오. 설정 후 첫 주 동안 매일 트레이를 검사한 다음 매주 검사를 수행합니다. 기질 펩타이드 rPPEP-1 복합체의 공결정화를 위해 1:1 비율로 밀리리터당 24밀리그램의 rPPEP-1을 트리스 완충 식염수에 가용화된 동결건조 분말을 7배 몰 초과량과 혼합합니다.섭씨 20도에서 30분 동안 배양한 후 16000배 g 및 섭씨 20도에서 10분 동안 원심분리하여 모든 입자와 먼지를 제거합니다. unbound rPPEP-1 단백질과 동일한 microseeding 절차를 사용하여 결정화를 진행합니다. rPPEP-1의 고도로 상호 성장된 결정은 2.4몰 인산암모늄 이염기성 및 0.1몰 트리삽실 pH 8.5를 포함하는 조건에서 2일 후에 나타났습니다.초기 조건을 최적화하려면 소프트웨어를 사용하여 부피를 계산하고 피펫팅 계획을 사용하여 10개의 최적화 스크린을 허용하는 각 조건의 2밀리리터를 얻습니다. 조건은 0.15 몰 단계에서 1.8 내지 2.55 몰 인산 암모늄 이염기성뿐만 아니라 0.5 pH 단위 단계에서 0.1 몰 trisapseal pH 7.5 내지 9.0을 포함한다. 스톡 솔루션에서 24가지 조건으로 구성된 그리드 스크린을 준비합니다.피펫팅 계획을 사용하여 개별 조건을 구성합니다. 모든 그리드 스크린 용액의 200마이크로리터를 24웰 플레이트의 웰에 피펫팅하고 플레이트를 섭씨 20도에서 평형을 이룹니다. 결정화 플레이트를 수동으로 설정합니다.3마이크로리터의 방울 부피와 2:1, 1.5:1:5 및 1:2의 단백질 대 저장소 비율을 사용합니다. 여기에서 기포 형성을 방지하기 위해 용적식 피펫을 사용합니다. 즉시 플레이트를 밀봉하십시오.그런 다음 접시를 섭씨 20도의 챔버에 놓습니다. 1-4일 후, 2.55몰 인산암모늄 이염기성 및 0.1몰 트리삽실 pH 7.5 - 9.0을 포함하는 4가지 조건에서 rPPEP-1의 고도로 상호 성장된 결정이 나타나는 반면, 나머지 20개 조건에서는 결정이 형성되지 않습니다. 이러한 조건에서 rPPEP-1의 단결정을 얻기 위해 마이크로시딩 절차를 수행합니다.미세종자 스톡을 준비하려면 먼저 성공적인 조건 중 하나에서 단일 상호 성장된 결정을 선택하십시오. 다음으로, 각 모액 50마이크로리터를 작고 광택이 높은 유리 구슬이 들어 있는 1.5밀리리터 튜브에 옮기고 모액 1마이크로리터를 유리 커버 슬라이드로 옮깁니다. 장착된 나일론 윤활유를 사용하여 크리스탈을 낚아채서 유리 커버 슬라이드의 드롭으로 옮깁니다.그런 다음 결정이 포함된 액체를 튜브로 옮기고 30초 동안 고속으로 소용돌이치면서 유리 구슬이 소용돌이치는지 확인합니다. 종자를 1:1000으로 희석하여 새로 준비된 동일한 조건과 5초 동안 완전히 소용돌이가 포함된 새 1.5ml 튜브에 넣습니다. 다음으로, 투명한 방울로 20 가지 조건을 덮고있는 플레이트의 씰을 제거합니다.종자 원료의 0.5 마이크로 리터를 우물에 피펫으로 넣습니다. 플레이트를 밀봉하고 섭씨 20도의 챔버에 넣습니다. 이 미세시딩 기법을 적용한 후, 1.8 내지 2.4 몰 인산암모늄과 0.1 몰 트리스 pH 7.5 내지 9를 포함하는 다양한 조건에서 설정 후 몇 시간에서 며칠 후에 높은 회절 품질의 단결정이 나타납니다.결정은 가장 큰 치수에서 100-200 미크론의 크기로 성장합니다. 크리스탈 바로 위의 밀봉 테이프에 루프를 놓고 위아래로 초점을 맞춰 선택한 결정의 최대 길이에 맞는 최적의 나일론 루프 크기를 선택합니다. rPPEP-1 결정의 일반적인 가장 긴 액세스는 약 100-200미크론입니다.또한 적절한 냉동 상태를 준비하십시오. 거품 듀스를 액체 질소로 채웁니다. 그런 다음 바이알 클램프에 바이알을 넣고 액체 질소로 채워진 800ml 폼 듀어에서 예냉각합니다.적절한 식별자가 표시된 극저온 홀더와 냉동 슬리브를 액체 질소로 채워진 2리터 폼 이불에 놓습니다. 그런 다음 자기 봉에 올바른 크기의 장착된 나일론 루프를 로드합니다. 그런 다음 날카로운 메스로 결정판의 밀봉 테이프를 자르고 집게로 제거합니다.1마이크로리터의 극저온 상태를 커버 슬라이드에 피펫팅합니다. 이 단계에서 빠르게 작업하는 것이 특히 중요한데, 루프에서 결정 또는 소량의 동결 용액을 건조시키면 결정 품질이 변동하거나 회절이 완전히 손실될 수 있기 때문입니다. 모든 결정 조작 단계는 실체 현미경 아래에서 수행해야 합니다.크리스탈이 플라스틱 표면에 달라붙으면 침술로 주변 플라스틱을 변형시켜 바닥에서 분리하십시오. 장착된 나일론 고리로 낚아서 드롭에서 크리스탈을 제거합니다. 결정을 cryocondition의 낙하로 빠르게 옮기고 1초 동안 평형을 이루도록 합니다.그런 다음 장착된 나일론 루프를 사용하여 가능한 한 빨리 드롭에서 크리스탈을 낚습니다. 회수된 결정을 즉시 액체 질소에 급락 동결합니다. 장착된 루프 주변의 액체 질소가 끓는 것을 멈추면 루프를 바이알에 넣습니다.바이알을 극저온 홀더에 놓습니다. 홀더에 6개의 바이알이 로드되면 홀더 주위에 크라이오 슬리브를 놓습니다. 결정을 사용할 때까지 액체 질소로 채워진 탱크에 보관하십시오.데이터 수집을 수행하려면 클램프를 사용하여 극저온에서 장착된 결정을 조심스럽게 회수하고 운송을 위해 폼 듀어에 보관하십시오. 빔 스톱과 검출기를 주차 위치로 이동하고 극저온 노즐을 몇 밀리미터 위로 이동합니다. 바이알을 빠르게 제거하면서 손가락으로 베이스를 고정하여 cryocap의 베이스를 측각계 헤드에 장착합니다.그런 다음 극저온 노즐과 빔 스톱을 제자리로 다시 이동하고 결정을 중앙에 놓습니다. 항상 빔 스톱 또는 감지기를 만지지 않도록 주의하십시오. 다음과 같이 진동 각도가 0.1도인 180도 데이터 세트를 계속 수집합니다.여기에 표시된 것은 1.4 sodium citrate tribasic dihydrate, 0.1 molar hepes sodium, pH 7.5에서 상용 결정화 스크린을 사용하여 초기 스크리닝에서 얻은 고도로 상호 성장된 rPPEP-1 결정입니다. 여기에 표시된 것은 60% 부피 대 부피 tacsimate, pH 7.0, 0.1 몰 BIS-TRIS 프로판, pH 7.0으로 초기 스크리닝에서 얻은 결정입니다. 결정은 또한 2.4 몰 인산 암모늄 이염기성, 0.1 몰 트리스, pH 8.5에서도 나타났습니다.마이크로시딩 최적화 절차를 적용한 후, 단결정은 2.1몰 인산암모늄 이염기성, 0.1몰 트리스, pH 8 및 2.25몰 인산암모늄 이염기성, 0.1몰 트리스, pH 8을 포함한 여러 조건에서 포함되었습니다. 나일론 루프에 장착된 결정은 크기가 100-200미크론이며 현미경 검사에서 단일 격자가 있는 것으로 보입니다. X선 회절 분석은 이러한 결정이 실제로 단일 격자와 회절 X선을 거의 원자 분해능으로 나타낸다는 것을 보여줍니다.재조합 PPEP-1 기질 펩타이드 복합체의 결정 구조를 해결하면 PPEP-1의 기질 결합 모드에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 기질 펩티드는 그것의 열리는 확인에 있는 PPEP-1의 기질 의무적인 그룹으로 확산될 수 있었습니다. 그런 다음 루프 폐쇄가 발생하면 기질은 수소 결합 및 S-루프에 위치한 고유한 지방족-방향족 측쇄 네트워크를 통해 PPEP-1과 상호 작용합니다.기질은 지글지글 펩타이드 결합과 P2 프라임 대 P3 프라임 펩타이드 결합에서 꼬임이 있는 독특한 이중 꼬임 형태로 결합합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 구조 연구를 위해 재조합 PPEP-1의 단일 격자 웰 회절 결정을 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 유사한 접근법을 다른 단백질에도 사용할 수 있으며, 고도로 상호 성장된 결정과 더욱 다양한 배양 온도 및 C-스톡 희석을 얻을 수 있습니다.다재다능하고 사용이 간단하기 때문에 이 간단한 기술은 모든 결정 최적화 프로세스에서 시도해야 합니다.

production-crystallization-structure-determination-c-difficile-ppep-1

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

본는 lipidic mesophases 수동으로 막 단백질의 결정화 실험을 설정 캐퍼리 막 구조 및 기능 생물학 그룹의 구현 절차를 설명합니다.

Lipidic Mesophases를 사용하여 구조 결정을위한 막 단백질 Crystallizing

구조 기반 약물 설계 약물 개발에 중요한 역할을한다. 병렬로 여러 대상을 추구하는 것은 크게 선 발견의 성공의 기회를 증가합니다. 다음 문서는 감염성 질환 시애틀 구조 유전체학 센터 PB2 인플루엔자 단위체의 유전자에 대한 구조 결정을위한 멀티 타겟 접근 방식을 활용하는 방법 강조한다.

인플루엔자 중합 효소의 유전자에 대한 구조 결정 PB2 소단위를위한 멀티 타겟 병렬 처리 방식

출처: Figueroa, DM, et.al. 항균 펩타이드 국소화를 특성화하기 위한 박테리아 스페로플라스트 및 프로토플라스트의 생산 및 시각화. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 먼저 세포 분열을 억제하여 필라멘트화를 유도한 다음 세포벽의 효소 소화를 통해 대 장균 스페로플라스트를 생산하는 방법을 보여줍니다. 이 공정에는 현미경 관찰을 위한 적절한 구형 형성 및 안정성을 보장하기 위해 킬레이트제, DNase 및 삼투압 안정제의 제어된 첨가가 포함됩니다.

대장균 스페로플라스의 준비

막 임베디드 단백질 도메인 간 상호 작용의 Biophysical 및 생화학 연구는 적절한 학습 자료를 얻는 첫 번째있는 많은 기술적 도전을 직면하고 있습니다. 이 문서는 솔루션을 핵 자기 공명 (NMR) 및 기타 분석 응용 프로그램의 구조 분석에 적합 이황화 - 안정화의 transmembrane의 펩타이드 복합체를 생산하고 정화를위한 프로토콜을 설명합니다.

구조 연구 생산 이황화 - 안정화 Transmembrane의 펩타이드 단지

β-barrel 외막 단백질(OMP)은 그람 음성 박테리아, 미토콘드리아 및 엽록체의 외막 내에서 많은 기능을 수행합니다. 여기에서 우리는 X선 결정학 또는 NMR 분광법에 의한 구조 결정을 위해 충분한 양의 β배럴 OMP를 생산하기 위한 프로토콜을 제시하여 구조 연구에서 알려진 병목 현상을 완화하기를 희망합니다.

β-배럴 외부 막 단백질의 구조 결정을 향해 - 구축해에서 결정에

구 균 에서 탄수화물 기질 의무적인 단백질의 광범위 한 생 화 학적 및 구조 특성화를 수행 하기 위한 효율적인된 프로토콜 제공 됩니다.

탄수화물 전송 기질 바인딩 단백질 SP0092의 생 화 학적 및 구조적 특성

여기에 우리가 그람 음성의 대장균 (대장균)를 생산 하는 프로토콜을 현재 spheroplasts 및 그람 양성 간 균 megaterium (B. megaterium) 명확 하 게 시각화 하 고 빠르게 특성 protoplasts 펩 티 드-박테리아의 상호 막 지역화 및 펩 티 드 translocating를 정의 하는 체계적인 방법을 제공 합니다.

생산 및 항균 성 펩 티 드 지역화 특성 세균 Spheroplasts Protoplasts의 시각화

우리는 X 선 결정학에 의하여 NEMO의 IKK 결합 도메인의 구조 결정에 대한 프로토콜을 기술합니다. 이 방법은 단백질 발현, 정제 및 특성화뿐만 아니라 단백질의 성공적인 결정 최적화 및 단백질의 구조 측정을 위한 전략을 포함합니다.

NEMO의 IKK 결합 도메인의 생산, 결정화 및 구조 결정

이 프로토콜은 구조 수준에서 M42 아미노펩티다아제인 TmPep1050의 디머-도데카메르 전환을 연구하기 위해 개발되었다. 단백질 정제에서 X선 데이터 처리에 이르기까지 간단한 파이프라인입니다. 결정발생, 데이터 세트 인덱싱 및 분자 교체는 연구의 경우, TmPep1050H60A H307A 변이체를 통해 강조되었다.

열토가 마리티마 M42 아미노펩티다제 TmPep1050의 올리고메릭 상태 전환을 연구하는 엑스레이 결정학

다목적 미세유체 장치는 반확산 방법을 이용하여 효소의 결정화를 가능하게 하고, 침을 구함으로써 결정에 기판의 도입, 효소:기판 복합체의 3D 구조 측정을 실온에서 칩 내부의 결정의 직렬 분석에 의한 것으로 설명된다.

다목적 미세 유체 칩의 직렬 결정학에 의한 효소의 결정화 및 구조적 결정: 기질 복합체

극저온을 이용한 거대 분자 복합체의 구조 결정은 단백질과 복합체의 특정 클래스에 대한 일상이되었습니다. 여기서이 파이프 라인은 요약 (샘플 준비, 스크리닝, 데이터 수집 및 처리) 독자는 더 어려운 표본의 경우 변경 될 수있는 추가 상세한 자원과 변수를 향해 지시된다.

단일 입자 저온 전자 현미경 검사법: 샘플에서 구조로

배우세요 Clostridium difficile의 PPEP-1 메탈로프로테아제 결정화 방법을 마이크로시딩 기법으로 단일 격자 고품질 결정을 효율적으로 생산하여 X선 회절 분석과 구조 생물학 연구에 활용하는 기술입니다.

생산, 결정화 및 구조 결정의

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