생산, 결정화 및 구조 결정의 C. 남과 어울리지 않는 PPEP-1 Microseeding 및 아연 SAD를 통해

이 절차의 전반적인 목표는 재조합 프롤린 프롤린 엔도펩티다아제-1 또는 rPPEP-1 단백질의 단일 격자 회절 품질 결정을 효율적으로 성장시키는 것입니다. 이 방법이 없으면 rPPEP-1은 X선 회절 분석에 적합하지 않은 고도로 상호 성장된 결정을 즉시 생성합니다. 이 기술의 주요 장점은 rPPEP-1의 구조적 측정을 위한 많은 수의 잘 정렬되고 잘 회절된 결정을 단기간에 제한된 재료 입력으로 생산할 수 있다는 것입니다.

이 절차는 마이크로시티 방법을 사용하며 rPPEP-1 및 기질 펩타이드 복합체의 모든 성공적인 초기 결정화 조건에 맞게 조정할 수 있습니다. 이 방법은 상호 성장된 결정을 생성하는 거의 모든 단백질의 잘 정렬된 결정을 생성하도록 조정할 수 있습니다. 또한 교차 파종 실험, 단백질 분산 또는 저분자를 사용한 공결정화 실험에도 사용할 수 있습니다.

결정화 방법의 취급에 대한 시각적 시연은 매우 중요한데, 그 이유는 작은 변화조차도 결정의 회절 품질에 상당한 영향을 미칠 수 있기 때문입니다. 시판되는 표준 스크린과 결정화 로봇을 사용하여 sitting drop 형식으로 결정화 시험을 수행합니다. 먼저, 원심 한외여과 장치를 사용하여 정제된 단백질을 4000배 g과 섭씨 4도에서 5분 간격으로 12mg으로 농축합니다.

침전과 악화를 방지하기 위해 각 간격 후에 단백질을 혼합하십시오. 280 나노 미터에서 단백질 농도를 25, 몰 센티미터당 900의 흡광 계수를 사용하여 측정합니다. 단백질을 섭씨 20도까지 평형을 이룬 후 16000 회 g 및 섭씨 20도에서 10 분 동안 원심 분리로 모든 입자와 먼지를 제거합니다.

결정 스크리닝을 수행하려면 미리 채워진 결정화 플레이트를 사용하여 밀봉하고 섭씨 4도에서 보관하십시오. 시험을 설정할 때 작은 볼륨이 빨리 마르므로 신속하게 작업하십시오. 또한 가능하면 로봇 도크 주변에 습도 챔버를 사용하십시오.

모든 결정화 플레이트를 섭씨 20도로 평형을 이룬 후, 단백질 ent 저장소를 2-4개의 서브웰로 피펫팅하여 스크린을 설정합니다. 300나노리터의 방울 부피를 사용하십시오. 서브웰 2의 경우 200:100, 서브웰 3의 경우 150:150, 서브웰 4의 경우 100:200의 단백질 대 저장소 비율을 사용합니다.

즉시 플레이트를 밀봉하고 섭씨 20도의 챔버에 넣으십시오. 설정 후 첫 주 동안 매일 트레이를 검사한 다음 매주 검사를 수행합니다. 기질 펩타이드 rPPEP-1 복합체의 공결정화를 위해 1:1 비율로 밀리리터당 24밀리그램의 rPPEP-1을 트리스 완충 식염수에 가용화된 동결건조 분말을 7배 몰 초과량과 혼합합니다.

섭씨 20도에서 30분 동안 배양한 후 16000배 g 및 섭씨 20도에서 10분 동안 원심분리하여 모든 입자와 먼지를 제거합니다. unbound rPPEP-1 단백질과 동일한 microseeding 절차를 사용하여 결정화를 진행합니다. rPPEP-1의 고도로 상호 성장된 결정은 2.4몰 인산암모늄 이염기성 및 0.1몰 트리삽실 pH 8.5를 포함하는 조건에서 2일 후에 나타났습니다.

초기 조건을 최적화하려면 소프트웨어를 사용하여 부피를 계산하고 피펫팅 계획을 사용하여 10개의 최적화 스크린을 허용하는 각 조건의 2밀리리터를 얻습니다. 조건은 0.15 몰 단계에서 1.8 내지 2.55 몰 인산 암모늄 이염기성뿐만 아니라 0.5 pH 단위 단계에서 0.1 몰 trisapseal pH 7.5 내지 9.0을 포함한다. 스톡 솔루션에서 24가지 조건으로 구성된 그리드 스크린을 준비합니다.

피펫팅 계획을 사용하여 개별 조건을 구성합니다. 모든 그리드 스크린 용액의 200마이크로리터를 24웰 플레이트의 웰에 피펫팅하고 플레이트를 섭씨 20도에서 평형을 이룹니다. 결정화 플레이트를 수동으로 설정합니다.

3마이크로리터의 방울 부피와 2:1, 1.5:1:5 및 1:2의 단백질 대 저장소 비율을 사용합니다. 여기에서 기포 형성을 방지하기 위해 용적식 피펫을 사용합니다. 즉시 플레이트를 밀봉하십시오.

그런 다음 접시를 섭씨 20도의 챔버에 놓습니다. 1-4일 후, 2.55몰 인산암모늄 이염기성 및 0.1몰 트리삽실 pH 7.5 - 9.0을 포함하는 4가지 조건에서 rPPEP-1의 고도로 상호 성장된 결정이 나타나는 반면, 나머지 20개 조건에서는 결정이 형성되지 않습니다. 이러한 조건에서 rPPEP-1의 단결정을 얻기 위해 마이크로시딩 절차를 수행합니다.

미세종자 스톡을 준비하려면 먼저 성공적인 조건 중 하나에서 단일 상호 성장된 결정을 선택하십시오. 다음으로, 각 모액 50마이크로리터를 작고 광택이 높은 유리 구슬이 들어 있는 1.5밀리리터 튜브에 옮기고 모액 1마이크로리터를 유리 커버 슬라이드로 옮깁니다. 장착된 나일론 윤활유를 사용하여 크리스탈을 낚아채서 유리 커버 슬라이드의 드롭으로 옮깁니다.

그런 다음 결정이 포함된 액체를 튜브로 옮기고 30초 동안 고속으로 소용돌이치면서 유리 구슬이 소용돌이치는지 확인합니다. 종자를 1:1000으로 희석하여 새로 준비된 동일한 조건과 5초 동안 완전히 소용돌이가 포함된 새 1.5ml 튜브에 넣습니다. 다음으로, 투명한 방울로 20 가지 조건을 덮고있는 플레이트의 씰을 제거합니다.

종자 원료의 0.5 마이크로 리터를 우물에 피펫으로 넣습니다. 플레이트를 밀봉하고 섭씨 20도의 챔버에 넣습니다. 이 미세시딩 기법을 적용한 후, 1.8 내지 2.4 몰 인산암모늄과 0.1 몰 트리스 pH 7.5 내지 9를 포함하는 다양한 조건에서 설정 후 몇 시간에서 며칠 후에 높은 회절 품질의 단결정이 나타납니다.

결정은 가장 큰 치수에서 100-200 미크론의 크기로 성장합니다. 크리스탈 바로 위의 밀봉 테이프에 루프를 놓고 위아래로 초점을 맞춰 선택한 결정의 최대 길이에 맞는 최적의 나일론 루프 크기를 선택합니다. rPPEP-1 결정의 일반적인 가장 긴 액세스는 약 100-200미크론입니다.

또한 적절한 냉동 상태를 준비하십시오. 거품 듀스를 액체 질소로 채웁니다. 그런 다음 바이알 클램프에 바이알을 넣고 액체 질소로 채워진 800ml 폼 듀어에서 예냉각합니다.

적절한 식별자가 표시된 극저온 홀더와 냉동 슬리브를 액체 질소로 채워진 2리터 폼 이불에 놓습니다. 그런 다음 자기 봉에 올바른 크기의 장착된 나일론 루프를 로드합니다. 그런 다음 날카로운 메스로 결정판의 밀봉 테이프를 자르고 집게로 제거합니다.

1마이크로리터의 극저온 상태를 커버 슬라이드에 피펫팅합니다. 이 단계에서 빠르게 작업하는 것이 특히 중요한데, 루프에서 결정 또는 소량의 동결 용액을 건조시키면 결정 품질이 변동하거나 회절이 완전히 손실될 수 있기 때문입니다. 모든 결정 조작 단계는 실체 현미경 아래에서 수행해야 합니다.

크리스탈이 플라스틱 표면에 달라붙으면 침술로 주변 플라스틱을 변형시켜 바닥에서 분리하십시오. 장착된 나일론 고리로 낚아서 드롭에서 크리스탈을 제거합니다. 결정을 cryocondition의 낙하로 빠르게 옮기고 1초 동안 평형을 이루도록 합니다.

그런 다음 장착된 나일론 루프를 사용하여 가능한 한 빨리 드롭에서 크리스탈을 낚습니다. 회수된 결정을 즉시 액체 질소에 급락 동결합니다. 장착된 루프 주변의 액체 질소가 끓는 것을 멈추면 루프를 바이알에 넣습니다.

바이알을 극저온 홀더에 놓습니다. 홀더에 6개의 바이알이 로드되면 홀더 주위에 크라이오 슬리브를 놓습니다. 결정을 사용할 때까지 액체 질소로 채워진 탱크에 보관하십시오.

데이터 수집을 수행하려면 클램프를 사용하여 극저온에서 장착된 결정을 조심스럽게 회수하고 운송을 위해 폼 듀어에 보관하십시오. 빔 스톱과 검출기를 주차 위치로 이동하고 극저온 노즐을 몇 밀리미터 위로 이동합니다. 바이알을 빠르게 제거하면서 손가락으로 베이스를 고정하여 cryocap의 베이스를 측각계 헤드에 장착합니다.

그런 다음 극저온 노즐과 빔 스톱을 제자리로 다시 이동하고 결정을 중앙에 놓습니다. 항상 빔 스톱 또는 감지기를 만지지 않도록 주의하십시오. 다음과 같이 진동 각도가 0.1도인 180도 데이터 세트를 계속 수집합니다.

여기에 표시된 것은 1.4 sodium citrate tribasic dihydrate, 0.1 molar hepes sodium, pH 7.5에서 상용 결정화 스크린을 사용하여 초기 스크리닝에서 얻은 고도로 상호 성장된 rPPEP-1 결정입니다. 여기에 표시된 것은 60% 부피 대 부피 tacsimate, pH 7.0, 0.1 몰 BIS-TRIS 프로판, pH 7.0으로 초기 스크리닝에서 얻은 결정입니다. 결정은 또한 2.4 몰 인산 암모늄 이염기성, 0.1 몰 트리스, pH 8.5에서도 나타났습니다.

마이크로시딩 최적화 절차를 적용한 후, 단결정은 2.1몰 인산암모늄 이염기성, 0.1몰 트리스, pH 8 및 2.25몰 인산암모늄 이염기성, 0.1몰 트리스, pH 8을 포함한 여러 조건에서 포함되었습니다. 나일론 루프에 장착된 결정은 크기가 100-200미크론이며 현미경 검사에서 단일 격자가 있는 것으로 보입니다. X선 회절 분석은 이러한 결정이 실제로 단일 격자와 회절 X선을 거의 원자 분해능으로 나타낸다는 것을 보여줍니다.

재조합 PPEP-1 기질 펩타이드 복합체의 결정 구조를 해결하면 PPEP-1의 기질 결합 모드에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 기질 펩티드는 그것의 열리는 확인에 있는 PPEP-1의 기질 의무적인 그룹으로 확산될 수 있었습니다. 그런 다음 루프 폐쇄가 발생하면 기질은 수소 결합 및 S-루프에 위치한 고유한 지방족-방향족 측쇄 네트워크를 통해 PPEP-1과 상호 작용합니다.

기질은 지글지글 펩타이드 결합과 P2 프라임 대 P3 프라임 펩타이드 결합에서 꼬임이 있는 독특한 이중 꼬임 형태로 결합합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 구조 연구를 위해 재조합 PPEP-1의 단일 격자 웰 회절 결정을 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 유사한 접근법을 다른 단백질에도 사용할 수 있으며, 고도로 상호 성장된 결정과 더욱 다양한 배양 온도 및 C-스톡 희석을 얻을 수 있습니다.

다재다능하고 사용이 간단하기 때문에 이 간단한 기술은 모든 결정 최적화 프로세스에서 시도해야 합니다.