인플루엔자 중합 효소의 유전자에 대한 구조 결정 PB2 소단위를위한 멀티 타겟 병렬 처리 방식

다음 실험의 전반적인 목표는 여기에 제시된 사례에서 단 하나의 유전자 또는 유전자 서열로 시작하여 X선 결정학에 의한 표적 단백질의 구조화된 결정을 위한 다중 표적 접근 방식을 사용하는 것입니다. 표적 단백질은 바이러스 복제의 핵심 구성 요소인 인플루엔자 A의 PB 2 중합효소 소단위체입니다. 다중 표적 접근법은 먼저 단일 표적 염기서열 및 단백질에 대해 알려진 기타 정보를 기반으로 일련의 유전자 구조를 병렬로 설계하고 복제함으로써 달성됩니다.

두 번째 단계는 각 구조체에 대한 발현 수준을 테스트하고 세포 배양에서 대규모 단백질 발현에 가장 적합한 수준을 선택하는 것입니다. 다음 단계는 열린 세포를 절단하여 발현 물질에서 표적 단백질을 제거하고 각 단백질을 매우 높은 순도로 정제하는 것입니다. 그런 다음 X선 연구에 적합한 결정 형태를 얻기 위해 각 단백질에 대해 일련의 결정화 시험을 설정합니다.

그런 다음 하나 이상의 결정에서 고해상도 X선 회절 데이터를 수집하고 각 표적 단백질의 구조를 설명하는 전자 밀도 맵을 해석하고 정제하는 데 사용합니다. 이러한 결과를 통해 전자 밀도 맵을 기반으로 표적 단백질의 3차원 구조를 렌더링할 수 있습니다. 다중 표적 처리는 경로의 모든 잠재적 장애물에서 실행 가능한 대안을 제공함으로써 구조화된 결정의 성공 가능성을 크게 높입니다.

여러 표적을 동시에 연구하는 것도 매우 효율적이므로 각 단계에서 단백질당 시간과 비용을 줄일 수 있습니다. 약물 복용 가능한 표적에 대한 구조화된 결정이 완료되는 속도를 높일 수 있는 잠재력은 매년 더 많은 치료법 개발 기회를 제공할 것입니다. 이 방법은 구조 생물학에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있지만 이러한 방법을 통해 얻은 고품질 단백질은 모든 단백질 기반 연구를 지원할 수 있습니다.

프로세스의 각 단계에는 고유한 과학이 있고 고유한 전문 지식이 필요하지만, 인력, 계측 및 노하우에 대한 투자는 모든 부품이 조립되면 아름다운 결실을 맺을 수 있습니다. 연구를 위해 표적 유전자 및 유전자 산물을 선택하면, 첫 번째 단계에서는 여러 유전자 변이 또는 구조를 설계해야 합니다. 유전자 작곡가 소프트웨어는 엔지니어링된 합성 유전자 염기서열의 관련 코드와 함께 단백질 수준에서 이러한 구조를 설계하는 데 사용됩니다.

얼라인먼트 뷰어 모듈 및 구성 설계 모듈을 사용하여 단백질 염기서열 정렬을 비교하고 단백질 구조 설계 삽입 PCR 및 벡터 PCR 말단 프라이머 또는 암페어를 정의할 수 있습니다. 다음으로, 유전자 작곡가의 단백질-DNA 알고리즘을 사용하여 각 아미노산 염기서열을 엔지니어링된 핵산 염기서열의 코드로 역변환합니다. 사용 표에서 적절한 코드를 사용하여 특정 세포주에서 발현을 위한 염기서열을 최적화합니다.

이 경우 대장균 박테리아가 있습니다. 타겟 유전자 염기서열이 준비되면 유전자를 가상으로 복제하여 박테리아 발현에 적합한 벡터 플라스미드에 삽입합니다. 이 경우 변형된 PET 28 벡터입니다.

이 벡터에는 발현 및 단백질 정제에 필요한 특정 구성 요소가 포함되어 있습니다. 표적 유전자는 단백질의 N 또는 C 말단에 히스타민 태그 서열과 절단 서열을 통합하도록 변형되어 정제 중에 태그를 제거할 수 있습니다. 이 벡터는 또한 발현 검사 및 발효를 위한 항생제 내성 유전자를 가지고 있습니다.

그런 다음 각 표적 단백질 유전자 염기서열은 파이프 클로닝, 중합효소, 불완전한 1차 확장 클로닝을 준비하기 위해 표준 유전자 합성 방법으로 생성되며, 파이프 클로닝은 타겟 유전자가 의도한 벡터에 상보적인 프라이머로 증폭되는 PCR 기반 클로닝 전략입니다. 이 방법은 후기 단계 PCR의 불완전한 특성을 이용하여 PCR 산물에 가변 단일 가닥 말단을 남깁니다. 각 반응에 정방향 및 역방향 프라이머를 각각 5마이크로리터씩 추가하여 인서트 PCR 또는 IPCR을 준비합니다.

플레이트 맵에 따른 96 웰 플레이트에서 플레이트 맵에 따라 각 전체 길이 합성 유전자의 2마이크로리터를 적절한 웰에 추가합니다. 각각에 25마이크로리터의 PFU 마스터 믹스를 첨가한 후 다음 PCR 조건을 사용하여 반응을 25회 잘 순환합니다. 섭씨 95도에서 30초 동안 변성시킵니다.

섭씨 50도에서 45초 동안 아닐하고 섭씨 68도에서 3분 동안 연장합니다. 단편 증폭은 IPCR 산물의 AGROS 겔 분석에 의해 확인됩니다. 성공적인 IPCR 제품은 견고한 대역으로 대표됩니다.

덜 바람직한 결과는 종종 별도의 반응에서 희미하거나 번진 띠로 보입니다. 플라스미드 발현은 벡터 PCR에 의해 증폭되거나 VPCR 단편 증폭은 VPCR 산물의 AROS 겔 분석에 의해 확인됩니다. IPCR 및 VPCR 산물이 증폭되면 병합 플레이트에 첨가되고 병합 반응을 위해 열순환기에 투입됩니다.

그런 다음 성공적으로 복제된 구조체는 화학적으로 유능한 대장균 세포로 형질전환되고 글리세롤 줄기에 저장되어 발현 테스트 행진을 시작합니다. 복제된 구조체의 글리세롤 스톡에서 나온 소량의 각 샘플을 별도의 한천 플레이트에 넣습니다. 플레이트는 박테리아 영양 육수로 만들어지며 벡터에 인코딩된 항생제 마커 Kanamycin은 다음 날 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다.

갓 자란 한천 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하여 각 샘플에 대한 사전 배양을 시작합니다. 이 콜로니를 사용하여 캔 마이신과 포도당이 보충된 1.2ml의 TB 육수를 접종하여 병렬 처리합니다. 각 사전 배양은 96웰 둥근 바닥 블록에서 성장합니다.

섭씨 37도에서 하룻밤 동안 분당 220회 회전하면서 흔들며 성장합니다. 하룻밤 사이에 성장한 후. 접종을 위해 40마이크로리터의 사전 배양을 사용하여 각 샘플에 대한 소규모 유도 배양을 시작합니다.

결핵 육수 1.2ml. 밀리리터당 50밀리그램의 캔 마이신과 노바젠 오버나이트 익스프레스 시스템이 추가되었습니다. 첫째, 유도 배양액을 섭씨 20도에서 48시간 동안 성장시키고 220RPM에서 진탕하여 4, 000 GForce 단위에서 15분 동안 원심분리하여 수확 세포를 흔듭니다.

상층액을 붓고 정제 후 추가 처리 전에 펠릿을 섭씨 영하 20도에서 최소 1시간 동안 보관하십시오. 제조업체의 프로토콜에 따라 캘리퍼스 랩 CHIP 90 시스템을 사용하여 모세관 전기영동을 통해 분할 반응이 있거나 없는 단백질을 분석합니다. 인플루엔자의 경우, 34개 구성물 중 PB 2개의 단백질 소단위체(subunit, 14)가 용해성 표적 단백질을 유도하고 다음 단계인 대규모 발효에 진입했습니다.

대규모 발효를 시작하려면 밀리리터당 50밀리그램을 함유한 박테리아 세포 배양 배지 100밀리리터를 접종합니다. 글리세롤의 마이신이 섭씨 37도에서 하룻밤 사이에 자랄 수 있습니까? 다음날 220 RPM으로 흔들어 10 밀리리터를 사용하여 접종하여 사전 배양을 확대합니다.

자동 유도 매체와 밀리리터당 50밀리그램을 함유한 1리터의 육수는 2리터의 당황한 플라스크에 마이신을 넣을 수 있습니다. 약 30분마다 섭씨 37도에서 팽창된 배양물을 흔듭니다. 600나노미터의 파장에서 UV 흡광도를 측정하여 배양물의 광학 밀도를 확인합니다.

광학 밀도가 0.6에 도달하면 원하는 성장 시간 후에 진탕 인큐베이터의 온도를 섭씨 20도로 변경합니다. 발현 테스트를 위해 각 구성물에서 대표적인 10 밀리리터 알리 쿼드를 제거합니다. 5, 000 GForce 단위에서 15분 동안 원심분리하여 세포를 수확합니다.

상등액을 붓고 세포 펠릿을 섭씨 영하 80도에서 동결시킵니다. 이 절차를 시작하려면 lysis buffer의 cell paste를 1 - 5 마스터 부피 비율로 해동하고 다시 현탁시킵니다. 섭씨 4도에서 30분 동안 세게 저어줍니다.

깨끗한 주걱을 사용하여 비커 측면에서 덩어리를 떼어냅니다. 프리메이슨의 초음파 처리로 얼음 위의 세포를 기계적으로 용해합니다. 18, 섭씨 4도에서 30분 동안 000 GForce 단위로 원심분리하여 조잡한 용해물을 명백하게 하십시오.

상층액을 수집하고 대규모 정제를 진행하기 전에 분석을 위해 작은 부분 표본을 보관합니다. SDS 페이지 겔 분석을 통해 각 배양액의 대규모 단백질 발현을 확인합니다. 이 대표적인 SDS 페이지 결과는 강력한 단백질 발현, 약 50%의 용해도 및 약 50%의 절단을 보여줍니다.

이 경우, 히스티딘 태그는 추가된 단백질 용해성 태그와 함께 제거되었으며, 이는 원래 구성물에서 엔지니어링되었습니다. 니켈 수지는 천연 박테리아 단백질을 포함한 다른 모든 세포 물질에서 고유한 히스타민 태그가 있는 표적 단백질을 분리하는 데 사용됩니다. 니켈 1 컬럼은 저장 버퍼를 제거하기 위해 4 컬럼 부피의 UE 물로 세척한 다음 1 컬럼 부피의 버퍼 B와 5 컬럼 부피의 완충액을 준비합니다.

A for E 평형 병렬화는 한 번에 여러 컬럼을 실행할 수 있는 단백질 메이커를 사용하여 수행됩니다. 히스타민 태그가 있는 가용화된 단백질을 포함하는 각 정화된 용해물을 분당 2밀리리터의 속도로 별도의 컬럼에 로드한 다음 버퍼 A로 여러 번의 컬럼 부피 세척을 수행하고 버퍼를 통한 흐름을 수집하고 분석을 위해 저장합니다. 완충액 A와 B를 가진 일련의 단계 구배도에 있는 결합된 단백질을 95 대 5, 60 에서 40, 그리고 마지막으로 100% 완충액 B.완충액 B에 있는 분대는 니켈 수지를 위한 히스타민과 경쟁하고 이렇게 주어진 비율로 란에서 단백질을 제거합니다.

각 용출 분획을 개별적으로 수집합니다. 니켈 1 컬럼에 대한 실행의 대표적인 크로마토그램 결과가 여기에 나와 있습니다. SDS 페이지에 의해 니켈 1이 회피된 분획, 조잡한 용해물, 정화된 용해물 및 니켈 1이 흐르는 것을 분석하고 컬럼 정제 중에 수집된 280나노미터의 UV 흡광도와 비교합니다.

이 단계는 정제가 성공적이었는지 여부를 확인합니다. 추가 처리를 위해 이월할 표적 단백질을 포함하는 분획을 선택하고 모읍니다. 단백질의 이론적 소멸 계수를 사용하여 이 단계에서 단백질의 총량을 계산하고, 280나노미터에서 UV 흡광도를 측정하고, 풀링된 분획의 총 부피를 고려합니다.

분석을 위해 작은 샘플을 저장합니다. 표적 단백질에 대한 유전자는 ULP 1에 의해 절단 부위로 인식되는 특정 서열로 암호화되었으며, 따라서 ULP 1을 추가하면 히스티딘 태그와 관심 단백질 사이에 절단이 발생합니다. 이 절차를 시작하려면 프로테아제와 같은 유비퀴틴 1마이크로리터를 첨가하며, 이는 풀링된 분획에 존재하는 단백질 5mg당 1개입니다.

이 시점에서, 절단된 단백질은 투석 튜브를 사용하여 추가 처리를 위해 완충액 B에서 완충액 A로 전달되고, 교반과 함께 섭씨 4도에서 4시간 동안 2리터의 완충액 A에 대해 단백질을 투석합니다. 투석 후 PB 2에 대해 10 킬로달톤 분자량 컷오프를 사용합니다. ULP가 존재하거나 없는 표적 단백질의 다른 SDS 페이지 젤을 실행합니다.

이를 통해 ULP one cleavage가 성공적이었는지 확인하고 추가 처리를 위해 이월할 최상의 분획을 선택할 수 있습니다. 여기에 표시된 것은 중합효소 pb의 세 가지 구성에 대한 대표적인 SDS 페이지 결과입니다. 두 개의 소단위 분자량 마커가 1열에 있습니다.

레인 2, 6 및 10은 니켈 1 컬럼에서 풀링된 단백질입니다. 3, 7, 11번 레인은 니켈 2와 4, 8, 12번 레인의 완충액 A에 절단된 단백질의 흐름을 포함하고 있습니다. 니켈 2에서 버퍼 B의 히스타민 태그가 제거된 것을 보여줍니다.

히스타민을 제거한 후, 니켈 2에서 합동된 분획이 집중됩니다. SEC를 시작하려면 타겟의 분자량에 따라 적절한 수지를 다시 선택해야 합니다.이 경우 acere S 110 over 30 GL 컬럼을 사용하고 5ml 주사기를 사용하여 분당 0.5ml의 유속으로 200ml SEC 버퍼와 평형을 이룬 다음 샘플을 10ml 샘플 루프에 로드하고 SEC 컬럼 실행을 시작합니다. 280나노미터에서 UV 흡수 크로마토그램을 모니터링하면서 소량의 분획을 수집합니다.

SDS 페이지를 통해 모든 관련 SEC 분획을 실행합니다. 단백질 결정화 시험에 대한 표준 접근법은 증기 확산을 포함하는 좌식 낙하 방법으로 수행됩니다. 각 표적 단백질에 대해 처음부터 두 개 이상의 희소 매트릭스 스크리닝을 설정하는 것은 드문 일이 아닙니다.

이 프로세스를 시작하려면 96웰 컴팩트 주니어 결정화 플레이트의 각 저장소를 80마이크로리터로 미리 채우고, 선택한 결정화 스크린의 각 조건은 SEC 버퍼에 0.4마이크로리터의 단백질을 96개의 웰 각각에 분배합니다. 그런 다음 0.4마이크로리터의 결정화 스크린을 추가하여 각 방울의 완전한 혼합을 보장합니다. 우물은 수정처럼 맑은 천장 테이프로 전체 진부를 덮고 모든 우물을 완전히 밀봉하고 환경 진동이 없는 방해받지 않는 위치에 섭씨 16도의 접시를 보관합니다.

해부 현미경으로 향후 몇 주 동안 주기적으로 단백질 결정화를 확인합니다. 단백질 결정이 나타나지 않으면 다른 조건으로 새 플레이트를 설정하고 최종 방울의 단백질 농도를 변경하여 수확 전에 성공 가능성을 높입니다. 액체 질소로 채워진 doer에서 A LS 스타일 퍽을 식히고 뚜껑으로 덮어 수확을 시작합니다.

표적 단백질 결정으로 웰을 덮고 있는 투명 테이프를 근처의 빈 공간으로 자릅니다. 해당 결정화 조건의 1.6 마이크로 리터를 추가하고 0.4 마이크로 리터의 에틸렌 글리콜과 결합하십시오. 결정화 상태에서 20% 에틸렌 글리콜 용액은 단백질 결정을 보호합니다.

극저온 동결 중에는 현미경으로 결정을 분석하고 루프의 내경을 결정의 최대 너비와 일치시켜 수확에 적합한 극저온 루프를 선택합니다. cryo loop를 자성 결정 막대에 부착하고 웰 용액에서 직접 결정을 고리로 만듭니다. 즉시 수확된 결정이 있는 극저온 루프를 동결 보호제에 담근 다음 LS 스타일 퍽에 담그십시오.

플래시하려면 원하는 수의 크리스탈에 대해 크리스탈 반복을 동결하십시오. 수확이 완료되면 퍽 지팡이를 사용하여 혀가 구부러진 플래시 동결 결정이 들어 있는 퍽에 자석 뚜껑을 놓습니다. 다음 단계를 위해 퍽을 거꾸로 뒤집습니다.

퍽 푸셔를 퍽에 나사로 고정한 다음 퍽을 KU 배우에게 옮기고 뚜껑을 펀칭하는 데 사용합니다. 퍽의 결정은 J Director 이미지 획득 소프트웨어를 사용하여 X선 회절 연구를 준비할 때까지 액체 질소 수조에서 얼어붙은 상태로 유지됩니다. 크리스털 스크리닝 빔 슬릿 0.5도, 검출기 거리 50mm, 이미지 단계 70도, 노출 길이 30초에 대해 다음 매개변수를 설정합니다.

다음은 결정이 스크리닝되는 동안 이미지 획득 소프트웨어의 스크린샷의 예이며, 중앙 패널은 대표 결정에서 관찰된 X선 회절이 3차원 구조 결정에 필요한 완전한 데이터 세트를 위해 고해상도로 충분한 이미지를 수집하는 것을 보여줍니다. 이 비디오에서 시연된 클로닝 및 단백질 정제 전략은 14개의 정제된 PB, 2개의 샘플로 이어졌으며 이 중 9개는 회절 연구에 적합한 결정을 생성했습니다. 사내 X선 회절 데이터 세트는 ossec variax hf, HF 광학 장치 및 Saturn 944 plus CCD 검출기가 장착된 rigaku super bright FRE plus 회전 양극 X선 발생기를 사용하여 QK 알파 방사선이 있는 9개 구조물 중 5개에서 수집되었습니다.

중합효소 PB 2 subunit의 X선 회절 이미지가 여기에 나와 있습니다. 각 데이터 세트를 처리하고 PB 2 subunit의 총 4 개의 구조를 결정했습니다. 각 구조는 동료 검토를 거쳐 일반 대중이 액세스할 수 있도록 단백질 데이터 뱅크에 업로드되었습니다.

이 그림은 결정학적 비대칭 단위에 있는 분자의 리본 다이어그램을 보여줍니다. 4개의 PB 2 구조체 중 2차 구조체는 해당 PDB 코드와 함께 무지개 패턴으로 착색됩니다. 이 표에는 이 비디오 기사에 설명된 방법에 의한 인플루엔자 PB 2 표적에 대한 결과 분석이 나와 있습니다.

유전자 대 구조 결정을 위한 다중 타겟 병렬 처리 파이프라인은 클로닝, 용해도, 정제, 결정화 및 구조 결정의 5단계로 설명되어 있습니다. 당사의 구조 생물학 파이프라인의 결과물은 구조 기반 연구의 기초를 제공할 뿐만 아니라 단백질 기능을 확인하기 위한 기능 분석 또는 MAR 또는 SPR에 의한 새로운 화합물의 생물물리학적 스크리닝과 같은 추가 연구를 제공하여 약물 개발의 새로운 시작점을 식별합니다. 이 기술과 함께 발명된 도구는 구조 생물학자들이 인간의 건강과 질병에 큰 영향을 미친 구조 기반 약물 설계를 포함하여 다양한 종류의 발견 기반 연구를 탐지할 수 있는 길을 닦는 데 도움이 되었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 다중 대상 병렬 처리가 어떻게 구조화된 결정의 성공률을 크게 높일 수 있는지 잘 이해하게 될 것입니다. 구조 생물학 실험실에서 일하는 것은 매우 위험할 수 있으며 실험실 활동에 참여하는 동안 항상 PPE 사용과 같은 적절한 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.