인플루엔자 중합 효소의 유전자에 대한 구조 결정 PB2 소단위를위한 멀티 타겟 병렬 처리 방식

다음 실험의 전반적인 목표는 여기 제시된 사례와 같이 단일 유전자 또는 유전자 서열만으로 시작하여, X선 결정학을 통해 표적 단백질의 구조를 체계적으로 결정하기 위한 다중 표적 접근법을 사용하는 것입니다. 표적 단백질은 바이러스 복제의 핵심 구성 요소인 인플루엔자 A의 PB2 폴리머라아제 서브유닛입니다. 다중 표적 접근법은 단일 표적 서열과 단백질에 대해 알려진 기타 정보를 바탕으로 일련의 유전적 작제물을 병렬로 설계하고 클로닝함으로써 구현됩니다.

두 번째 단계는 각 컨스트럭트(construct)의 발현 수준을 테스트하고, 세포 배양을 통한 대규모 단백질 발현에 가장 적합한 것을 선택하는 것입니다. 다음 단계에서는 세포를 파쇄하여 발현 물질로부터 표적 단백질을 분리하고, 각각을 매우 높은 순도로 정제해야 합니다. 그 후 각 단백질을 이용하여 X선 연구에 적합한 결정 형태를 얻기 위한 일련의 결정화 실험을 수행합니다.

그 후 하나 이상의 결정에서 고해상도 X선 회절 데이터를 수집하며, 이를 통해 각 표적 단백질의 구조를 나타내는 전자 밀도 지도를 풀고 정밀화합니다. 이러한 결과는 전자 밀도 지도를 기반으로 표적 단백질의 3차원 구조를 렌더링할 수 있게 합니다. 다중 표적 처리는 경로상의 모든 잠재적 장애물에 대해 실행 가능한 대안을 제공함으로써 구조 결정의 성공 가능성을 크게 높여줍니다.

여러 표적을 병렬로 처리하는 방식 또한 매우 효율적이며, 각 단계에서 단백질당 소요되는 시간과 비용을 줄여줍니다. 약물 투여 가능 표적의 구조 결정 속도를 높임으로써 연간 더 많은 치료제 개발 기회를 창출할 수 있는 잠재력이 있습니다. 이 방법은 구조 생물학에 귀중한 통찰력을 제공할 뿐만 아니라, 이러한 방식을 통해 얻은 고순도 단백질은 모든 단백질 기반 연구를 지원할 수 있습니다.

프로세스의 각 단계는 고유한 과학적 원리를 가지며 그에 맞는 전문 지식을 필요로 하지만, 인력, 장비 및 노하우에 대한 투자는 모든 요소가 조화를 이룰 때 훌륭한 성과로 이어질 수 있습니다. 조사할 표적 유전자와 유전자 산물을 선정하면, 첫 번째 단계로 여러 가지 유전적 변이체나 컨스트럭트를 설계해야 합니다. 단백질 수준에서 이러한 컨스트럭트를 설계하고, 이에 대응하는 엔지니어링된 합성 유전자 서열의 코드를 작성하기 위해 유전자 작곡 소프트웨어가 사용됩니다.

정렬 뷰어 모듈과 컨스트럭트 설계 모듈을 사용하여 단백질 서열 정렬을 비교하고, 단백질 컨스트럭트 설계를 위한 삽입 PCR 및 벡터 PCR의 말단 프라이머 또는 어댑터를 정의하십시오. 다음으로, 진 컴포저(gene composer)의 단백질-DNA 알고리즘을 사용하여 각 아미노산 서열을 설계된 핵산 서열 코드로 역번역하십시오. 특정 세포주에서의 발현을 최적화하기 위해 적절한 코돈 사용 표를 활용하십시오.

이 경우에는 E. coli 박테리아를 사용합니다. 표적 유전자 서열이 준비되면, 박테리아 발현에 적합한 벡터 플라스미드에 유전자를 가상으로 클로닝하여 삽입합니다. 여기서는 변형된 pET 28 벡터를 사용합니다.

이 벡터는 발현 및 단백질 정제에 필요한 특정 성분들을 포함하고 있습니다. 표적 유전자는 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 히스티딘 태그 서열이 삽입되고, 정제 과정 중 태그를 제거할 수 있도록 절단 서열이 포함되도록 수정되었습니다. 또한, 이 벡터는 발현 테스트 및 배양을 위한 항생제 내성 유전자를 보유하고 있습니다.

그 후, 각 표적 단백질의 유전 서열을 표준 유전자 합성 방법으로 생성하여 파이프 클로닝(pipe cloning, 중합효소 불완전 1차 신장 클로닝)을 준비합니다. 파이프 클로닝은 표적 유전자를 의도한 벡터와 상보적인 프라이머로 증폭시키는 PCR 기반의 클로닝 전략입니다. 이 방법은 PCR 후기 단계의 불완전한 특성을 이용하여, PCR 산물이 가변적인 단일 가닥 말단을 갖도록 유도합니다. 각 반응액에 정방향 및 역방향 프라이머를 각각 5 µL씩 첨가하여 삽입물 PCR(IPCR)을 준비합니다.

플레이트 맵에 따라 96-웰 플레이트의 각 해당 웰에 2 µL의 전체 길이 합성 유전자를 각각 첨가합니다. 각 웰에 25 µL의 PFU 마스터 믹스를 첨가한 후, 다음 PCR 조건으로 반응을 25회 사이클링합니다. 95 °C에서 30초 동안 변성시킵니다.

50 °C에서 45초 동안 어닐링하고, 68 °C에서 3분 동안 연장합니다. 단편 증폭은 IPCR 산물의 AGROS 겔 분석을 통해 확인합니다. 성공적인 IPCR 산물은 뚜렷한 밴드로 나타납니다.

바람직하지 않은 결과는 종종 별도의 반응에서 희미한 밴드나 스미어(smear) 밴드로 나타납니다. 발현 플라스미드는 vector PCR로 증폭시키거나, VPCR 생성물의 AROS 겔 분석을 통해 VPCR 단편 증폭을 확인합니다. IPCR 및 VPCR 생성물이 증폭되면, 이를 머지 플레이트(merge plate)에 넣고 머지 반응을 위해 서모사이클러(thermocycler)에 배치합니다.

성공적으로 클로닝된 컨스트럭트를 화학적 컴피턴트 E. coli 세포에 형질전환 시킨 후, 발현 테스트 스트리킹을 위해 글리세롤 스톡에 저장합니다. 각 글리세롤 스톡 샘플의 소량을 별도의 한천 배지에 스트리킹합니다. 배지는 박테리아 영양 배지와 벡터에 인코딩된 항생제 마커인 Kanamycin을 사용하여 제작하며, 다음 날까지 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

새로 배양한 agar 플레이트에서 단일 콜로니를 채취하여 각 샘플의 전배양을 시작합니다. 병렬 처리를 위해 이 콜로니를 kanamycin과 glucose가 첨가된 1.2 milliliters의 TB broth에 접종합니다. 각 전배양은 96 well round bottom block에서 진행합니다.

37°C에서 분당 220회 회전으로 진탕 배양하며 하룻밤 동안 배양합니다. 하룻밤 배양 후, 각 샘플에 대해 사전 배양액 40 µL를 접종하여 소규모 유도 배양을 시작합니다.

1.2 mL의 TB broth. 50 mg/mL의 kanamycin과 Novagen overnight express system을 첨가한다. 1, 유도 배양액을 20 °C에서 48시간 동안 220 RPM으로 흔들어 배양한다. 4,000 G로 15분간 원심분리하여 세포를 수확한다.

상층액을 따라내고, 정제 후 추가 공정 전까지 펠릿을 -20°C에서 최소 1시간 동안 보관하십시오. 제조사의 프로토콜에 따라 Caliper Lab CHIP 90 시스템을 이용한 모세관 전기영동법으로 절단 반응 전후의 단백질을 분석하십시오. 인플루엔자 A PB2 단백질의 경우, 34개의 구축물 중 14개에서 수용성 표적 단백질이 생성되어 다음 단계인 대량 발효 공정으로 진행되었습니다.

대규모 배양을 시작하려면, glycerol stock으로부터 50 mg/mL의 Can mycin이 함유된 박테리아 세포 배양액 100 mL에 접종하고, 37 °C에서 220 RPM으로 진탕 배양하며 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날, 10 mL를 접종하여 전배양액을 확장하십시오.

2L 배플 플라스크에 자동 유도 배지와 50 mg/mL 칸마이신(kanamycin)이 포함된 배지 1L를 넣습니다. 확장 배양액을 37 °C에서 약 30분 간격으로 진탕 배양합니다. 600 nm 파장에서의 UV 흡광도를 측정하여 배양액의 광학 밀도를 확인합니다.

광학 밀도가 0.6에 도달하면, 원하는 배양 시간 후에 진탕 배양기의 온도를 20 °C로 변경합니다. 발현 테스트를 위해 각 컨스트럭트에서 대표로 10 mL의 aliquot을 취합니다. 5,000 ×g에서 15분간 원심분리하여 세포를 수확합니다.

상청액을 따라내고 세포 펠릿을 -80 °C에서 냉동합니다. 이 절차를 시작하려면, 세포 페이스트를 용해 버퍼에 1:5의 최종 부피 비율로 해동 및 재현탁합니다. 4 °C에서 30분 동안 격렬하게 교반합니다.

깨끗한 스패튤라를 사용하여 비커 벽면에 붙은 덩어리를 떼어냅니다. 초음파 파쇄기를 사용하여 얼음 위에서 세포를 기계적으로 용해합니다. 4°C에서 18,000 GForce로 30분 동안 원심분리하여 조추출액을 투명하게 만듭니다.

대규모 정제를 진행하기 전에 상층액을 수집하고 분석용으로 소량의 분취액을 보관하십시오. SDS page 젤 분석을 통해 각 배양액의 대규모 단백질 발현을 확인합니다. 이 대표적인 SDS page 결과는 강력한 단백질 발현과 약 50%의 용해도 및 약 50%의 절단을 보여줍니다.

본 사례에서는 히스티딘 태그와 더불어, 원래의 컨스트럭트에 설계되어 추가되었던 단백질 용해성 태그가 함께 제거되었습니다. 니켈 레진은 고유한 히스티딘 태그가 있는 표적 단백질을 천연 박테리아 단백질을 포함한 모든 다른 세포 물질로부터 분리하는 데 사용됩니다. 니켈 컬럼 하나를 준비하여, 보관 버퍼를 제거하기 위해 4컬럼 부피의 초순수로 세척한 후, 1컬럼 부피의 버퍼 B와 5컬럼 부피의 버퍼로 순차적으로 세척합니다.

단백질 메이커를 사용하여 A 및 E 평형화 병렬화를 수행하며, 이는 여러 컬럼을 동시에 가동할 수 있습니다. 히스티딘 태그가 포함된 가용화 단백질이 들어 있는 각각의 정제된 용해물을 분당 2 mL의 속도로 개별 컬럼에 로딩한 후, 버퍼 A로 여러 컬럼 부피만큼 세척하고, 통과 액(flow through) 버퍼를 수집하여 분석을 위해 저장합니다. 결합된 단백질을 버퍼 A와 B의 비율이 95:5, 60:40, 그리고 마지막으로 100% 버퍼 B인 일련의 단계적 구배로 용출합니다. 버퍼 B의 성분은 니켈 레진에 대해 히스티딘과 경쟁하여, 주어진 비율에 따라 단백질을 컬럼에서 제거합니다.

각 용출 분획을 별도로 수집합니다. 니켈 컬럼에서 실행한 대표적인 크로마토그램 결과가 여기에 표시되어 있습니다. 니켈 컬럼에서 용출된 분획, 조용해물(crude lysate), 정제된 용해물(clarified lysate), 그리고 니켈 컬럼의 통과액(flow through)을 SDS-PAGE로 분석하고, 컬럼 정제 중에 수집된 280 nm에서의 UV 흡광도와 비교합니다.

이 단계에서는 정제가 성공적으로 이루어졌는지 확인합니다. 표적 단백질이 포함된 분획을 선택하고 이를 모아 후속 공정에 사용합니다. 280 nm에서 UV 흡광도를 측정하고 모은 분획의 총 부피를 고려하여, 단백질의 이론적 소멸 계수를 이용해 이 단계에서의 총 단백질 양을 계산합니다.

분석을 위해 소량의 샘플을 따로 저장해 둡니다. 표적 단백질의 유전자는 ULP1이 절단 부위로 인식하는 특정 서열로 인코딩되었으므로, ULP1을 첨가하면 히스티딘 태그와 목적 단백질 사이가 절단됩니다. 이 절차를 시작하려면, 풀링된 분획물에 포함된 단백질 5 mg당 1 µL의 ubiquitin like protease 1을 첨가하십시오.

이 단계에서, 절단된 단백질은 투석 튜브를 사용하여 추가 처리를 위해 버퍼 B에서 버퍼 A로 옮겨지며, 교반하며 4°C에서 4시간 동안 2L의 버퍼 A에 대해 단백질을 투석합니다. 투석 후 PB 2에 대해 10 kilodalton 분자량 컷오프를 사용하십시오. ULP 1의 존재 여부에 따라 표적 단백질의 SDS page 젤을 다시 실행하십시오.

이를 통해 ULP 1 절단이 성공적으로 이루어졌는지 확인하고, 후속 처리를 위해 진행할 최적의 분획을 선택할 수 있습니다. 여기는 폴리머라제 pb의 세 가지 컨스트럭트에 대한 대표적인 SDS page 결과입니다. 1번 레인에는 두 가지 서브유닛 분자량 마커가 표시되어 있습니다.

2, 6, 10번 레인은 니켈 1 컬럼에서 풀링된 단백질입니다. 3, 7, 11번 레인은 니켈 2 컬럼에서 버퍼 A로 용출된 절단 단백질의 플로우스루(flow through)이며, 4, 8, 12번 레인은 니켈 2 컬럼에서 버퍼 B를 통해 히스티딘 태그가 제거되었음을 보여줍니다.

히스타민을 제거한 후, 니켈 컬럼(nickel two)에서 얻은 통합 분획물을 농축합니다. SEC를 시작하려면 표적 단백질의 분자량에 따라 적절한 레진을 다시 선택해야 합니다. 이 경우에는 Superdex 75 10/30 GL 컬럼을 사용하며, 5 mL 시린지를 이용해 0.5 mL/min의 유속으로 200 mL의 SEC 버퍼로 평형화합니다. 샘플을 10 mL 샘플 루프에 로딩하고 SEC 컬럼 런을 시작합니다. 소량의 분획물을 수집하면서 280 nm에서 UV 흡수 크로마토그램을 모니터링합니다.

모든 관련 SEC 분획을 SDS page로 분석하십시오. 단백질 결정화 시험의 표준 접근 방식은 증기 확산법을 이용한 sitting drop법으로 수행됩니다. 각 표적 단백질에 대해 시작 단계부터 두 개 이상의 sparse matrix 스크리닝을 설정하는 것이 일반적입니다.

이 과정을 시작하려면, 96-웰 컴팩트 주니어 결정화 플레이트의 각 리저버에 선택한 결정화 스크리닝의 각 조건 용액을 80 µL씩 미리 채웁니다. SEC 버퍼에 희석된 단백질 0.4 µL를 96개의 각 웰에 분주합니다. 그 다음, 결정화 스크리닝 용액 0.4 µL를 추가하여 각 웰의 드롭이 완전히 혼합되도록 합니다. 플레이트 전체를 크리스털 클리어 씰링 테이프로 덮어 모든 웰이 완전히 밀봉되었는지 확인합니다. 플레이트를 환경적 진동이 없는 정지된 장소의 16 °C에서 보관하십시오.

향후 몇 주 동안 해부 현미경을 사용하여 주기적으로 단백질 결정화 여부를 확인하십시오. 단백질 결정이 나타나지 않으면, 수확 전 성공 확률을 높이기 위해 최종 드롭의 단백질 농도를 변경하고 서로 다른 조건으로 새로운 플레이트를 설정하십시오. 수확을 시작하려면 액체 질소로 채워진 듀어(dewar) 내에서 ALS 스타일 퍽(puck)을 냉각시킨 후 뚜껑으로 덮으십시오.

표적 단백질 결정이 포함된 웰을 덮고 있는 투명 테이프를 잘라 근처의 빈 웰로 옮깁니다. 해당 결정화 조건 용액 1.6 µL를 넣고 0.4 µL의 에틸렌 글리콜과 혼합합니다. 결정화 조건 내의 20% 에틸렌 글리콜 용액은 단백질 결정을 보호합니다.

냉동 동결 과정 동안, 현미경으로 결정을 분석하고 수확에 적합한 크라이오 루프를 선택하며, 루프의 내경을 결정의 최대 너비에 맞춥니다. 크라이오 루프를 마그네틱 결정 완드에 부착하고 웰 용액에서 결정을 직접 루프로 낚아 올립니다. 수확된 결정이 담긴 크라이오 루프를 즉시 동결 방지제에 담근 후, LS 스타일 퍽에 침지합니다.

원하는 수의 결정을 얻기 위해 결정 반복물을 급속 냉동하십시오. 수집이 완료되면, 퍽 완드를 사용하여 굽은 텅(tongue)과 함께 급속 냉동된 결정이 들어 있는 퍽에 자석 덮개를 덮으십시오. 다음 단계를 위해 퍽을 거꾸로 뒤집으십시오.

퍽 푸셔를 퍽에 나사로 고정한 다음, 퍽을 KU actor doer로 옮겨 뚜껑을 뚫어 제거합니다. 퍽 안의 결정은 J Director 이미지 획득 소프트웨어를 이용한 X선 회절 연구 준비가 될 때까지 액체 질소 배스에서 냉동 상태로 유지됩니다. 결정 스크리닝을 위해 빔 슬릿 0.5 degrees, 검출기 거리 50 millimeters, 이미지 스텝 70 degrees, 노출 시간 30 seconds로 매개변수를 설정합니다.

결정을 스크리닝하는 동안 이미지 획득 소프트웨어에서 나타나는 예시 스크린샷입니다. 중앙 패널은 대표적인 결정에서 관찰된 x-선 회절 패턴을 보여주며, 3차원 구조 결정을 위해 필요한 전체 데이터 세트를 구축하기 위해 고해상도에서 충분한 이미지를 수집합니다. 본 비디오에서 시연한 클로닝 및 단백질 정제 전략을 통해 14개의 정제된 PB two 샘플을 얻었으며, 그중 9개에서 회절 연구에 적합한 결정이 생성되었습니다. 자체 x-선 회절 데이터 세트는 9개의 컨스트럭트 중 5개에 대해 Rigaku super bright FRE plus 회전 양극 x-선 발생기를 사용하여 QK alpha 방사선으로 수집되었으며, 해당 장비에는 ossec variax hf, HF optics 및 Saturn 944 plus CCD 검출기가 장착되어 있습니다.

폴리머라제 PB2 서브유닛의 X선 회절 이미지가 여기에 제시되어 있습니다. 각 데이터 세트를 처리하여 총 4개의 PB2 서브유닛 구조를 결정했습니다. 각 구조는 동료 검토를 거쳤으며, 공개 액세스를 위해 단백질 구조 데이터은행(Protein Data Bank)에 업로드되었습니다.

이 그림은 결정학적 비대칭 단위 내 분자들의 리본 다이어그램을 보여줍니다. 4개의 PB2 구조 중 이차 구조는 해당 PDB 코드와 함께 무지개 패턴으로 색칠되어 있습니다. 이 표에는 본 비디오 논문에서 설명한 방법에 따른 인플루엔자 PB2 표적의 결과 분석 내용이 제시되어 있습니다.

유전자로부터 구조 결정까지의 다중 표적 병렬 처리 파이프라인은 클로닝, 용해도 확인, 정제, 결정화, 그리고 구조 결정의 5단계로 도식화됩니다. 본 구조 생물학 파이프라인의 결과물은 구조 기반 연구의 기초를 제공할 뿐만 아니라, 단백질 기능을 확인하기 위한 기능 분석이나 약물 개발의 새로운 출발점을 찾기 위해 MAR 또는 SPR을 이용한 신규 화합물의 생물리학적 스크리닝과 같은 추가 연구의 토대가 됩니다. 이러한 기술과 함께 개발된 도구들은 구조 기반 약물 설계 등 발견 기반의 다양한 조사를 수행하는 구조 생물학자들에게 길을 열어주었으며, 이는 인류의 건강과 질병 치료에 지대한 영향을 미쳤습니다.

이 영상을 시청한 후에는 다중 타겟 병렬 프로세싱이 구조 결정의 성공률을 어떻게 크게 높일 수 있는지에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 구조 생물학 실험실에서의 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 실험 활동 중에 항상 개인 보호구(PPE) 착용과 같은 적절한 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.