Name: 인플루엔자 중합 효소의 유전자에 대한 구조 결정 PB2 소단위를위한 멀티 타겟 병렬 처리 방식 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 10 s
Description: 배우세요 인플루엔자 A PB2 중합효소 소단위의 구조 결정을 위한 다중 타겟 병렬 처리 방식을 통해 단백질 결정화 및 X선 회절 분석을 수행하는 방법입니다. 이 기술은 약물 개발을 위한 고품질 단백질 생산 효율성을 높입니다.

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저자는 SSGCID 컨소시엄의 모든 구성원을 감사드립니다. SSGCID의 목표 달성은 에메랄드 바이오의 모든 팀 구성원의 엄청난 노력에 의해 가능하게된다. 이 연구는 알레르기와 감염증, 건강 및 보건 복지부의 국립 연구소의 국립 연구소에서 연방 계약 번호 HHSN272200700057C에서 후원했다.

<ol><li>Lowen, A. C., Mubareka, S., Steel, J., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+transmission+is+dependent+on+relative+humidity+and+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Influenza virus transmission is dependent on relative humidity and temperature.</a> PLoS Pathogens. 3 (10), 1470-1476 (2007).</li>
<li>Yamada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+structural+characterization+of+a+host-adapting+amino+acid+in+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Biological and structural characterization of a host-adapting amino acid in influenza virus.</a> PLoS Pathog. 6, e1001034(2010).</li>
<li>Lorimer, D., Raymond, A., Walchli, J., Mixon, M., Barrow, A., Wallace, E., Grice, R., Burgin, A., Gene Stewart, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composer%3A+database+software+for+protein+construct+design%2C+codon+engineering%2C+and+gene+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Composer: database software for protein construct design, codon engineering, and gene synthesis.</a> BMC Biotechnol. 9, 36(2009).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration%2C+scaling%2C+space-group+assignment+and+post-refinement%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst.+D%22%5BJournal%5D)">Integration, scaling, space-group assignment and post-refinement.</a> Acta Cryst. D. 66, 125-132 (2010).</li>
<li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phaser+crystallographic+software%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">Phaser crystallographic software.</a> Appl. Cryst. 40, 658-674 (2007).</li>
<li>Kuzuhara, T., Kise, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+the+influenza+A+virus+RNA+polymerase+PB2+RNA-binding+domain+containing+the+pathogenicity-determinant+lysine+627+residue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural basis of the influenza A virus RNA polymerase PB2 RNA-binding domain containing the pathogenicity-determinant lysine 627 residue.</a> J. Biol. Chem. 284, 6855-6860 (2009).</li>
<li>Murshudov, G. N., Skubàk, P., Lebedev, A. A., Pannu, N. S., Steiner, R. A., Nicholls, R. A., Winn, M. D., Long, F., Vagin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REFMAC5+for+the+refinement+of+macromolecular+crystal+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst.+D%22%5BJournal%5D)">REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures.</a> Acta Cryst. D. 67, 355-367 (2011).</li>
<li>Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+classical+density+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst.+D%22%5BJournal%5D)">Recent developments in classical density modification.</a> Acta Cryst. D. 66, 470-478 (2010).</li>
<li>Chen, V. B., Arendall, W. B., Headd, J. J., Keedy, D. A., Immormino, R. M., Kapral, G. J., Murray, L. W., Richardson, J. S., Richardson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MolProbity%3A+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst.+D%22%5BJournal%5D)">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta Cryst. D. 66, 12-21 (2010).</li>
<li>Mossessova, E., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ulp1-SUMO+crystal+structure+and+genetic+analysis+reveal+conserved+interactions+and+a+regulatory+element+essential+for+cell+growth+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast.</a> Mol. Cell. 5, 865-876 (2000).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst.+D%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta Cryst. D. 66, 486-501 (2010).</li>
<li>Raymond, A. C., Haffner, T. E., Ng, N., Lorimer, D., Staker, B. L., Stewart, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+design%2C+cloning+and+protein-expression+methods+for+high-value+targets+at+the+Seattle+Structural+Genomics+Center+for+Infectious+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst.+F%22%5BJournal%5D)">Gene design, cloning and protein-expression methods for high-value targets at the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease.</a> Acta Cryst. F. 67, 992-997 (2011).</li>
<li>Smith, E. R., Begley, D. W., Anderson, V., Raymond, A. C., Haffner, T. E., Robinson, J. I., Edwards, T. E., Duncan, N., Gerdts, C. J., Mixon, M. B., Nollert, P., Staker, B. L., Stewart, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Protein+Maker%3A+an+automated+system+for+high-throughput+parallel+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst.+F%22%5BJournal%5D)">The Protein Maker: an automated system for high-throughput parallel purification.</a> Acta Cryst. F. 67, 1015-1021 (2011).</li>
</ol>

저자는 에메랄드 바이오 주식 회사의 직원입니다

멀티 타겟 병렬 처리 구조 기반 약물 설계 약물 발견에 중요한 역할을한다. SSGCID는 NIAID 종류 AC 병원균부터 3 차원 단백질 구조와 과학 커뮤니티를 제공하기 위해 최선을 다하고 있습니다. 널리 사용되는 이러한 구조 정보를 만드는 것은 궁극적으로 구조 기반 약물 설계를 가속화하는 역할을합니다. MTPP 방식의 첫 번째 중요한 단계는 구조 디자인입니다. 각 대상 단백질의 여러 구조는 성공적인 구조 결정 및 증가 턴어라운드의 가능성을 증가시킵니다. 그것은 몇 가지 단백질 구조는 파이프 라인의 단계에서 실패 할 불가피하다. PIPE 복제 방법을 구현하는 것은 노동 집약적 인 정제 단계없이 96 - 웰 형식의 여러 구조의 생성을 허용하여 MTPP 방법을 지원합니다. 같은 96 - 웰 형식 (캘리퍼스 실험실에서 단백질 발현을 분석 할 수있는 능력 PIPE 복제 페어링칩 90) 더 전반적인 흐름을 촉진. 이러한 방법의 페어링 대규모 단백질 생산 및 정제의 성공을 보장 수용성 단백질을 생산하는 구조를 빠르게 식별 할 수 있습니다. MTPP 높은 처리량의 성공에 필수적인 측면은 단백질 메이커 (미국 특허 번호 6,818,060, 에메랄드 바이오) 악기입니다. 단백질 메이커 높은 처리량 단백질 생산 및 관련 구조 게놈 파이프 라인 연구 프로그램의 효율성을 향상하기 위해 특별히 개발 된 24 채널 병렬 액체 크로마토 그래피 시스템입니다. 단백질 메이커 앞에서 설명한 프로토콜을 사용하여 장점은 한 줄 FPLC 시스템에 비해 분명합니다. 한 사람은 8 시간 내에 병렬 48 대상을 정화 할 수 있습니다. 반면, 한 줄 FPLC 시스템을 사용하여 한 사람은 같은 시간 내에 네 개의 대상의 최대를 정화 할 수 있습니다. 각 대상에 대한 순도 높은 수준의구조 분석을위한 성장 단백질 결정의 이후 성공에 중요한 요소는 단백질 메이커로 달성했다. 제한 사항 및 문제 해결 X-선 결정학에 의해 입체 구조를 해결하는 것은 수용성 목적 단백질의 다량을 얻을 수 없다는 것입니다 중 하나는 많은 도전과 다단계 노력입니다. 용해도 문제를 극복하기 위해 구현 할 수있는 하나의 전략은 E.와 같은 다른 표현 호스트의 사용 대장균 세포는 몇 가지 중요한 진핵 번역 후 수정을 수행 할 수 없습니다. 이러한 번역 후 수정을 수행 할 수있는 각종 효모 발현, 곤충 및 포유 동물 세포 라인은 종종 적절한 대안이다. 표적 단백질은 종종 표현하지만, 표준 용해 조건에​​서 완전히 용해된다. 단백질 메이커 대체 세포 용해 상태의 신속한 테스트를위한 귀중한 자원이 될 수 있습니다로 스미스 등의 설명. 2011 13. 이 전략은 종종 목표는 파이프 라인을 통해 계속 이동해야합니다. 어떤 구조 유전체학 파이프 라인, 표준화 된 프로토콜은 파이프 라인 및 대상 개별 최적화를해야 할 수도 통해 나오는 모든 대상에 적합하지 않을 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 모든 동결 방지제에 대해 20 %의 에틸렌 글리콜을 사용하도록 선택했습니다. 이 조건이 적합하지 않습니다 경우에, 대안의 cryoprotectants 또는 농도 테스트해야 할 수도 있습니다. 각각의 단백질 대상의 고유 한 특성으로 인해, 속도 제한 및 구조를 결정하는 예측 단계는 결정됩니다. 최초의 스파 스 매트릭스 화면에서 최적화 단백질 결정화의 MTPP 파이프 라인 오프셋은 일반적으로 낮은 성공률. 상업적으로 이용 가능한 스파 스 매트릭스 화면에서 적중 각각의 초기 결정은 더욱 E-스크린 빌더 (에메랄드 바이오)에 최적화되어 있습니다. 최적화 화면이 AR 설계버퍼 염 및 첨가제의 농도 변화, 초기 크리스탈 히트의 상태를 운드. 성공적인 최적화 화면 회절 연구 및 구조 결정을위한 적합한 결정을 얻을 수 있습니다. 알레르기 및 전염병 국립 연구소 (NIAID)가 내다 구조 유전체학 프로그램은 에메랄드 바이오와 함께 SSGCID (에메랄드 바이오, SeattleBiomed, 워싱턴 대학과 퍼시픽 노스 웨스트 국립 연구소) 세 가지 다른 태평양 북서부 기관에 자금을 제공 . 컨소시엄의 각 구성원은 NIAID 구조 유전체학 프로그램의 목표를 달성에 필요한 최첨단 기술을 적용하는 전문성을 위해 선택되었다. 지금까지 SSGCID은 세계에서 일곱 번째로 큰 기여자로 PDB 순위 그것으로 461 구조를 기탁했으며, 2011 년, 가장 생산. SSGCID의 프로토콜과 방법론을 혜택의 의도와 함께 제공됩니다사회 과학 및 감염성 질환의 연구를 영속.

<table><tbody><tr><td>프라이머</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>유전자</td><td>DNA 2.0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TE 완충액</td><td>Qiagen</td><td>키트에 포함됨</td><td></td></tr><tr><td>96-웰 하프 스커트 PCR 플레이트</td><td>VWR</td><td>10011-248</td><td></td></tr><tr><td>PFU 마스터 믹스</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6X 오렌지 로딩 다이</td><td>Fermentas</td><td>R0631</td><td></td></tr><tr><td>10X TAE</td><td>Teknova</td><td>T0280</td><td></td></tr><tr><td>아가로스</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414-10G</td><td></td></tr><tr><td>pET28 벡터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-YT 배지</td><td>VWR</td><td>101446-848</td><td></td></tr><tr><td>카나마이신</td><td>Teknova</td><td>K2151</td><td></td></tr><tr><td>제한 효소</td><td>Fermentas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick 겔 추출 키트</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Top 10 화학적 수용성 세포</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-06</td><td></td></tr><tr><td>일회용 트러프 (멸균, 25 ml)</td><td>VWR</td><td>89094-662</td><td></td></tr><tr><td>에어포어 커버 (생물 배양용 레이온 필름)</td><td>VWR</td><td>60941-086</td><td></td></tr><tr><td>24-웰 블록</td><td>VWR</td><td>13503-188</td><td></td></tr><tr><td>QIAvac 96</td><td>Qiagen</td><td>19504</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) 화학적 수용성 세포 (phageR)</td><td>NEB</td><td>C2527H</td><td></td></tr><tr><td>50% 글리세롤</td><td>VWR</td><td>100217-622</td><td></td></tr><tr><td>TB 배지</td><td>Teknova</td><td>T7060</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris pH 8.0</td><td>Mediatech</td><td>46-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Teknova</td><td>S0251</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Aldrich</td><td>G7893-4L</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>JT Baker</td><td>4145-01</td><td></td></tr><tr><td>이미다졸</td><td>Sigma</td><td>56749-1KG</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Amresco</td><td>K831-10G</td><td></td></tr><tr><td>L-arginine</td><td>Amresco</td><td>0877-500G</td><td></td></tr><tr><td>벤조네이즈</td><td>EMD</td><td>70746-3</td><td></td></tr><tr><td>라이소자임</td><td>USB</td><td>1864525GM</td><td></td></tr><tr><td>10 kDa MWCO 투석 튜브</td><td>Thermo</td><td>68100</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 10 ka MWCO 농축기</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap FF 컬럼</td><td>GE</td><td>17-5255-01</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap 킬레이팅 컬럼</td><td>GE</td><td>17/0408-01</td><td></td></tr><tr><td>Compact Jr 결정화 플레이트</td><td>Emerald Bio</td><td>EBS-XJR</td><td></td></tr><tr><td>결정화 스크리닝 키트</td><td>Emerald Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>에틸렌 글리콜 100%</td><td>Emerald Bio</td><td>EBS-250-EGLY</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Wand 자성 직선형 툴</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-729</td><td></td></tr><tr><td>마운트형 크라이오루프 0.1-0.2 mm</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-955</td><td></td></tr><tr><td>ALS 스타일 퍽</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>퍽 완드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>굽은 핀셋</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>퍽 푸셔</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

인플루엔자 중합 효소의 유전자에 대한 구조 결정 pb2 소단위를위한 멀티 타겟 병렬 처리 방식

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

높은 악성 인플루엔자 변종 유행성 독감 발생은 전 세계적으로 인간의 인구의 대폭적인 병적 상태와 사망률의 원인이 될 수 있습니다. 혼자 미국에서 41,400 사망자와 1,860,000 입원의 평균은 매년 1 인플루엔자 바이러스 감염에 의해 발생합니다. 효소의 기본적인 단백질이 소단위 (PB2)의 점 돌연변이는 인간 2 바이러스 감염의 적응에 연결되어있다. 이러한 연구의 결과는 따라서 항 바이러스 약물 표적으로서의 가능성을 강조, 독성 요인으로 PB2의 생물학적 중요성을 공개했다. 알레르기 및 전염병 국립 연구소 (NIAID)가 내다 구조 유전체학 프로그램은 에메랄드 바이오와 함께 감염증 (SSGCID)의 시애틀 구조 유전체학 센터를 구성하는 세 가지 다른 태평양 북서부 기관에 자금을 제공한다. SSGCID는 thre에 함께 과학계를 제공하기 위해 최선을 다하고 있습니다NIAID 종류 AC 병원균의 전자 차원 단백질 구조. 과학계에서 사용할 수 같은 구조 정보를 만드는 것은 구조 기반 약물 설계를 가속화하는 역할을한다. 구조 기반 약물 설계 약물 개발에 중요한 역할을한다. 병렬로 여러 대상을 추구하는 것은 크게 통로 또는 전체 단백질 가족을 대상으로 새로운 리드 발견을위한 성공의 기회를 증가합니다. 에메랄드 바이오 컨소시엄을 지원하는 유전자에 대한 구조 결정을위한 높은 처리량, 멀티 타겟 병렬 처리 파이프 라인 (MTPP)를 개발했다. 여기에서 우리는 네 가지 독감 변종에서 PB2 단위체의 구조를 결정하는 데 사용되는 프로토콜을 설명합니다.

다음과 같은 결과를 설명하는 프로토콜의 예상 결과를 설명하고, PB2, 관찰 결과의 경우합니다. 인플루엔자 바이러스 중합 효소의 소단위 PB2 다섯 전체 길이 대상 아미노산 서열 (그림 2) 설계되었습니다, 유전자 작곡가를 사용하여. PB2 시퀀스는 다시 변환 많은 엔지니어링 단계 3 대상, E.의 표현에 최적화 된 코돈 조화 시퀀스의 결과되었습니다 대장균. IPCR 제품 (그림 3B), 서른 넷 구조의 총에서 성공적으로 그림 3A와 같이 파이프 복제 3를 사용하여 그의-Smt을 융합 태그 N-말단 배와 수정 pET28 벡터 시스템 (10)에 클로닝 하였다. 복제 워크 플로우의 개요는 그림 4에 표시됩니다. 성공적으로 복제 한 후 각 구조의 마이크로 스케일의 단백질 발현은 BL21 (DE3) E.에서 테스트되었습니다대장균 세포. 세포는 220 rpm에서 진탕 배양기 세트에 20 ° C에서 48 시간 동안 Novagen 사 익일 인 1 매체 (제조 업체의 프로토콜에 따라)로 보충 TB 배지에서 성장했다. 성장 후, 세포 캘리퍼스 LabChip 90 모세관 electrophoreses를 사용하여 수용성 단백질 발현을위한 수확 및 테스트되었습니다. 수용성 목적 단백질을 주도하고 서른 넷 PB2 구조의 열네 대규모 발효에 들어갔다. 각 구조의 대규모 배양 제조 업체의 프로토콜에 따라 Novagen 사의 하룻밤 익스프레스 1 매체와 보충 TB 배지에서 성장했다. 성장 후, 세포를 원심 분리를 통해 수확되었고, -80에 저장 ° C. 각 문화의 대규모 단백질 발현은 대규모 정화를 진행하기 전에 SDS-PAGE 분석 (그림 5)를 통해 확인 하였다. 단백질 메이커 열네 PB2 구조의 병렬 정제를 수행하는 데 사용되었다. 알의 명확히 해물내가 십사 구조는 니켈 - 킬레이트 칼럼을 통해 실행되었습니다. SDS-PAGE에 의해 표적 단백질을 포함하는 분획 결정한 후, 해당 분수는 각 샘플에 대한 풀링 된 각각의 농도는 280 독서에 의해 결정되었다. 배 그의-Smt 개의 태그 제거는 하룻밤 투석 두 번째 니켈 열 다음에 ULP1의 추가에 의해 실시되었다. 그의-Smt 개의 태그 제거의 확인은 SDS-PAGE (그림 6)에 의해 실시되었다, 각 샘플은 10 kDa의 Amicon 울트라 원심 분리 관에 집중되었다. Amicon 울트라 원심 분리기 튜브를 사용하여 농축 한 후, 각 샘플은 결정학 순도를 달성하기 위해 크기 조정 컬럼을 통해 실행되었습니다. 두 번째 농도는 결정화에 필요한 수준으로 단백질 농도를 높이기 위해 실시되었다. 모든 열네 구조가 성공적으로 정제 및 결정화 실험을 체결 하였다. 결정화 이전에 천을 해동에 의해 시작되었다OZEN 단백질. 결정은 16에서 기후 제어 방에서 수행되었다 ° C 앉아 드롭 증기 확산 (그림 7)를 위해 특별히 디자인 플레이트 (에메랄드 바이오)와 함께. 초기 심사 개의 스파 스 매트릭스 화면으로 실시되었다 JCSG +, 협정, 마법사 전체, 그리고 확장 뉴먼 전략에 따라 CryoFull (에메랄드 바이오). 단백질 용액 0.4 μL는 96 - 웰 컴팩트 주니어 결정 플레이트 (에메랄드 바이오)를 사용하여 해당 저장소에서 crystallant 0.4 μL (또는 저수지 용액)로 혼합 하였다. 열네 정제 시료의 그 아홉은 회절 연구 (그림 8)에 적합한 결정이 나왔고. 사내 회절 데이터 세트는 Osmic VARIMAX HF 광학 및 토성 944 + CCD 검출기가 장착 된 Rigaku SUPERBRIGHT FR-E + 회전 양극 X-선 발생기를 사용하여 구리 Kα 파장에서 결정 구 구조의 오 (그림 9에서 수집 된 ). 각 데이터 세트는 XDS / 엑스 스케일 4로 처리했다 &lt;<html> / 한모금&gt;와 최종 해상도로 확장. 분자 교체하여 구조를 해결하기 위해 시도 CCP4 스위트 7에서 페이저 5를 실시 하였다. 최종 모델은 REFMAC 7 검둥 오리 11의 수동 재 구축에 정제 한 후 하였다. 구조 평가 및 MolProbity 9 형상 및 피트니스에 대해 보정 하였다. PB2 subunit의 네 가지 구조의 총 결정 (그림 10)와 PDB로 입금되었다. 그림 11 MTPP 파이프 라인의 각 단계에서 전체 결과를 보여줍니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig1.jpg" /> 그림 1. 에메랄드 바이오시 멀티 타겟 병렬 처리를위한 SSGCID 유전자에 구조 통로의 개요. 내용 &quot;FO : 유지 - together.within 페이지 =&quot;항상 &quot;&gt; <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig2.jpg" /> 그림 2. 정렬 뷰어 및 단백질 유전자 Composer 소프트웨어의 설계 모듈을 구축합니다. 아미노산베이스 그린 (가운데 창) 및 대체 구문의 구조 유도 잘림이 금 (하단 창)에 표시됩니다에 표시되어 대상의 구성. 여러 독감 바이러스 PB2 서열 정렬이 순서와 이차 구조 요소에 비해 표시됩니다 PDBID 3CW4의 C-말단 도메인의. 도메인 구조 및 이차 구조 요소의 지식은 N-말단 잘림이 원하는 아미노산을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 유전자 작곡가 디자인 모듈 내에서 선택 할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4225/4225fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 그림 3A. 파이프 복제는 합성 유전자 삽입 (오렌지)가 앞으로 디자인 (레드 오렌지 선)와 생성 역 (오렌지 블루 라인) 프라이머는 PCR 물질을 삽입하여 증폭되는 것을 특징으로 설명되어 있습니다. 발현 벡터가 반대 (빨강 - 검정 라인 증폭 ) 앞으로 (블루 블랙 라인) 프라이머 벡터 PCR 자료를 생성합니다. 터미널 시퀀스 IPCR 제품은 vPCR 제품 (IPCR의 붉은 IPCR의 vPCR와 블루 vPCR 블루 보완 빨간 보완)의 단자 시퀀스를 보완합니다. 이 IPCR 및 vPCR 제품은 호스트 BL21 (DE3) 화학적 관할 E.으로 변화에 복제되는 플라스미드를 형성 어닐링 할 수 있습니다 대장균 세포. <img alt="그림 3B" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig3b.jpg" /> 그림 3b. IPCR 생산의 영동 분석<html> 성공적인 IPCR 제품은 강력한 밴드로 표현하는 동안 PB2 소단위에서 TS. IPCR 실패는, 희미하거나 더럽혀진 밴드로 볼 수 있습니다. IPCR 제품의 품질은 일반적으로 복제의 성공과 상관 될 수 있습니다. 분자량 마커 kiloDaltons에 있습니다. 그림은 레이몬드 외., 2011 12에서 재생됩니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig4.jpg" /> 그림 4. 대상 유전자 공학 단계 PB2 단백질이 유전자 Composer 소프트웨어를 사용하여 수행 하였다. 설계 핵산 서열이 각 대상에 대해 설립 후 6-7 다른 단백질 구조는 각 위해 설계되었습니다. 유전자 설계 및 복제의 초기 단계에있는 다중 표적 병렬 처리는 E.에 용해 단백질을 생산 가능한 대상이었다 14 어느 34 구조, 결과 대장균. <html> 다시 10 &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/4225/4225fig5.jpg &quot;/&gt; 그림 5. 강력한 단백질 발현 (25.76 kDa의의 예상 크기), (레인 7) 용출 된 단백질에서 배 그분-Smt을 (를) 태그의 분열을 약 50 %의 수용성 (레인 4)와 50 %를 보여주는 대규모 발효의 대표 SDS-PAGE 분석. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig6.jpg" /> 그림 6. 효소의 PB2 subunit의 세 가지 구조에 대한 SDS-PAGE 결과 레인 1, 분자량 마커 (kDa의의 왼쪽에 표시). 레인 2, 6, 10, 니켈 1 열에서 풀링 단백질, 레인 3, 7,과 11 니켈 2에서 버퍼에 쪼개진 단백질의 흐름을 통해, 레인 4, 8, 12, 니켈 2에서 버퍼 B에 배 그의-Smt 개의 태그를 제거. d/4225/4225fig7.jpg &quot;/&gt; 그림 7. 앉아있는 드롭 방법으로 수증기 확산의 개략도. 단백질 결정화 앉아 드롭 방법은 증기 확산의 범주에 속합니다. 이 방법은 단백질과 높은 농도에서 유사한 조건을 포함하는 큰 저수지와 평형하는 침전제의 정제 된 샘플을 수반한다. 물이 단백질 샘플 및 전송에서 저수지 증발로 침전 농도는 단백질 결정화에 대한 최적의 수준으로 증가합니다. <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig8.jpg" /> 그림 8. 인플루엔자 바이러스의 변형에서 효소의 PB2 소단위 단백질 크리스탈. <img alt="그림 9" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig9.jpg" /> 그림 9. 에서 효소의 PB2 소단위의 X-선 회절 이미지인플루엔자 바이러스의 변형. <img alt="그림 10" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig10highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig10.jpg" /> 그림 10. 4 PB2 구조 결정학 비대칭 단위 분자의 리본 다이어그램. 해당 PDB 코드에 무지개의 패턴 컬러 차 구조. () 3K2V (A/Yokohama/2017/2003/H3N2) (B) 3KHW (A / 멕시코 / InDRE4487/2009/H1N1) (C) 3KC6 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1) (D) 3L56 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1). <img alt="그림 11" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig11highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig11.jpg" /> 그림 11. 설명 된 방법에 의한 인플루엔자 PB2 대상에 대한 결과 분석. structur에이전자 측정 파이프 라인은 다섯 단계에 설명되어 있습니다 : 복제, 용해도, 정제, 결정화 및 구조 결정.

구조 기반 약물 설계 약물 개발에 중요한 역할을한다. 병렬로 여러 대상을 추구하는 것은 크게 선 발견의 성공의 기회를 증가합니다. 다음 문서는 감염성 질환 시애틀 구조 유전체학 센터 PB2 인플루엔자 단위체의 유전자에 대한 구조 결정을위한 멀티 타겟 접근 방식을 활용하는 방법 강조한다.

인플루엔자 중합 효소의 유전자에 대한 구조 결정 PB2 소단위를위한 멀티 타겟 병렬 처리 방식

고병원성 인플루엔자 바이러스주로 인한 팬데믹 발생은 전 세계 인류 집단에 광범위한 이환율과 사망률을 초래할 수 있습니다. 미국 내에서...

다음 실험의 전반적인 목표는 여기서 제시된 사례와 같이 단일 유전자 또는 유전자 서열만으로 시작하여, X선 결정학을 통해 표적 단백질의 구조를 체계적으로 결정하기 위한 다중 표적 접근법을 사용하는 것입니다. 표적 단백질은 바이러스 복제의 핵심 구성 요소인 인플루엔자 A의 PB2 중합효소 서브유닛입니다. 다중 표적 접근법은 단일 표적 서열과 단백질에 대해 알려진 기타 정보를 바탕으로 일련의 유전자 구조물을 병렬적으로 설계하고 클로닝함으로써 달성됩니다.두 번째 단계는 각 컨스트럭트의 발현 수준을 테스트하고, 세포 배양을 통한 대규모 단백질 발현에 가장 적합한 것을 선택하는 것입니다. 다음 단계에서는 세포를 파쇄하여 발현 물질로부터 표적 단백질을 분리하고, 이를 매우 높은 순도로 정제해야 합니다. 그 후, 각 단백질을 사용하여 X선 연구에 적합한 결정 형태를 얻기 위해 일련의 결정화 실험을 수행합니다.그 다음, 하나 이상의 결정에서 고해상도 X선 회절 데이터를 수집하고 이를 사용하여 각 표적 단백질의 구조를 나타내는 전자 밀도 지도를 풀고 정밀화합니다. 이러한 결과는 전자 밀도 지도를 기반으로 표적 단백질의 3차원 구조를 렌더링할 수 있게 합니다. 다중 표적 처리는 경로상의 모든 잠재적 장애물에서 실행 가능한 대안을 제공함으로써 구조 결정의 성공 가능성을 크게 높여줍니다.여러 표적을 병렬로 처리하는 방식 또한 매우 효율적이며, 각 단계에서 단백질당 소요되는 시간과 비용을 줄여줍니다. 약물 표적에 대한 구조 결정 속도를 높임으로써 연간 더 많은 치료제 개발 기회를 확보할 수 있을 것입니다. 이 방법은 구조 생물학에서 귀중한 통찰력을 제공할 뿐만 아니라, 이를 통해 얻은 고순도 단백질은 모든 단백질 기반 연구를 지원할 수 있습니다.공정의 각 단계는 고유한 과학적 원리를 기반으로 하며 그에 따른 전문 지식을 필요로 하지만, 인력, 기기 및 노하우에 대한 투자는 모든 요소가 결합되었을 때 매우 훌륭한 성과를 낼 수 있습니다. 연구 대상 유전자와 유전자 산물이 선정되면, 첫 번째 단계로 여러 가지 유전적 변이체 또는 구성물을 설계해야 합니다. 유전자 설계 소프트웨어를 사용하여 단백질 수준에서 이러한 구성물을 설계하고, 설계된 합성 유전자 서열에 연관된 코드를 함께 작성합니다.정렬 뷰어(alignment viewer) 모듈과 구조 설계(construct design) 모듈을 사용하여 단백질 서열 정렬을 비교하고, 단백질 구조 설계를 위한 삽입 PCR 및 벡터 PCR 종단 프라이머 또는 앰프(ampers)를 정의하십시오. 다음으로, 유전자 합성기(gene composer)의 단백질-DNA 알고리즘을 사용하여 각 아미노산 서열을 설계된 핵산 서열 코드로 역번역하십시오. 적절한 코돈 사용 표를 사용하여 특정 세포주에서 발현되도록 서열을 최적화하십시오.이 사례에서는 e coli 박테리아를 사용합니다. 표적 유전자 서열이 준비되면, 가상 클로닝을 통해 박테리아 발현에 적합한 벡터 플라스미드에 유전자를 삽입합니다. 여기서는 변형된 PET 28 벡터를 사용합니다.이 벡터는 발현 및 단백질 정제에 필요한 특정 성분들을 포함하고 있습니다. 표적 유전자는 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 히스티딘 태그 서열과 정제 과정 중 태그 제거를 가능하게 하는 절단 서열이 삽입되도록 수정되었습니다. 또한, 이 벡터는 발현 테스트 및 배양을 위한 항생제 내성 유전자를 보유하고 있습니다.그 후, 각 표적 단백질의 유전자 서열을 표준 유전자 합성 방법을 통해 생성하여 pipe cloning polymerase incomplete primary extension cloning(pipe cloning)을 준비합니다. pipe cloning은 표적 유전자를 의도한 벡터와 상보적인 프라이머로 증폭시키는 PCR 기반의 클로닝 전략입니다. 이 방법은 PCR 후기 단계의 불완전한 특성을 이용하여 PCR 생성물의 말단에 가변적인 단일 가닥 서열이 남게 합니다. 각 반응액에 정방향 및 역방향 프라이머를 각각 5 µL씩 첨가하여 insert PCR(IPCR)을 준비합니다.플레이트 맵에 따라 96-웰 플레이트의 각 해당 웰에 2 µL의 전장 합성 유전자를 각각 첨가합니다. 각 웰에 25 µL의 PFU 마스터 믹스를 첨가한 후, 다음 PCR 조건으로 반응을 25회 반복합니다. 95 °C에서 30초 동안 변성시킵니다.50 °C에서 45초 동안 어닐링하고 68 °C에서 3분 동안 연장합니다. 단편 증폭은 IPCR 산물의 AGROS 겔 분석을 통해 확인합니다. 성공적인 IPCR 산물은 뚜렷한 밴드로 나타납니다.바람직하지 않은 결과는 종종 별도의 반응에서 희미하거나 끌림(smear)이 있는 밴드로 나타납니다. 발현 플라스미드는 벡터 PCR(VPCR)로 증폭하거나, VPCR 산물의 AROS 겔 분석을 통해 VPCR 단편 증폭을 확인합니다. IPCR 및 VPCR 산물이 증폭되면, 이를 머지 플레이트(merge plate)에 추가하고 머지 반응을 위해 서모사이클러(thermocycler)에 넣습니다.성공적으로 클로닝된 컨스트럭트를 화학적 컴피턴스 e coli 세포에 형질전환시키고, 발현 테스트 스트리킹을 시작하기 위해 글리세롤 스톡에 보관합니다. 각 글리세롤 스톡 샘플의 소량을 별도의 아가 플레이트에 스트리킹합니다. 이 플레이트는 박테리아 영양 배지와 벡터에 인코딩된 항생제 마커 Kanamycin으로 제작되었으며, 다음 날까지 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.새로 배양한 agar 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하여 각 샘플의 전배양을 시작합니다. 병렬 처리를 위해 이 콜로니를 kanamycin과 glucose가 첨가된 1.2 milliliters의 TB broth에 접종합니다. 각 전배양은 96 well round bottom block에서 수행합니다.37 °C에서 분당 220회 회전 속도로 진탕 배양하며 하룻밤 동안 키웁니다. 하룻밤 배양 후, 각 샘플당 40 µL의 전배양액을 접종하여 소규모 유도 배양을 시작합니다.1.2 mL의 TB broth. 50 mg/mL의 kanamycin과 Novagen overnight express system을 첨가하였다. 1, 유도 배양물을 20 °C에서 220 RPM으로 흔들어주며 48시간 동안 배양한다. 4,000 GForce로 15분간 원심분리하여 세포를 수확한다.상청액을 따라내고, 정제 후 추가 공정을 진행하기 전 최소 1시간 동안 펠릿을 -20°C에서 보관하십시오. 제조사의 프로토콜에 따라 caliper lab CHIP 90 시스템을 이용한 모세관 전기영동법으로 절단 반응 유무에 따른 단백질을 분석하십시오. influenza A PB2 단백질의 경우, 34개의 구축물 중 14개가 가용성 표적 단백질을 형성하여 다음 단계인 대규모 발효 공정으로 진입하였습니다.대규모 배양을 시작하기 위해, glycerol stock으로부터 50 mg/mL의 Can mycin이 포함된 박테리아 세포 배양액 100 mL에 접종하고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 이때 220 RPM으로 진탕 배양합니다. 다음 날, 10 mL를 사용하여 전배양액을 확장 접종합니다.2L 배플 플라스크에 자동 유도 배지와 50 mg/mL의 kanamycin이 포함된 배양액 1L를 넣습니다. 확장 배양된 배양액을 37 °C에서 약 30분 간격으로 흔들어 줍니다. 600 nm 파장에서의 UV 흡광도를 측정하여 배양액의 광학 밀도를 확인합니다.광학 밀도가 0.6에 도달하면, 원하는 배양 시간이 지난 후 진탕 배양기의 온도를 20 °C로 변경합니다. 발현 테스트를 위해 각 컨스트럭트에서 대표로 10 mL의 aliquot을 취합니다. 5,000 ×g에서 15분 동안 원심분리하여 세포를 수확합니다.상청액을 따라내고 세포 펠렛을 -80°C에서 냉동합니다. 이 절차를 시작하려면, 세포 페이스트를 1:5의 마스터 볼륨 비율로 용해 버퍼에 해동 및 재현탁합니다. 4°C에서 30분 동안 격렬하게 교반합니다.깨끗한 스파튤라를 사용하여 비커 벽면에 붙은 덩어리를 떼어냅니다. 초음파 분쇄기를 사용하여 얼음 위에서 세포를 기계적으로 용해합니다. 4°C에서 18,000 GForce units로 30분 동안 원심분리하여 조추출물을 투명하게 정제합니다.대규모 정제를 진행하기 전 상층액을 수집하고 분석을 위해 소량의 분취액을 보관하십시오. SDS page 겔 분석을 통해 각 배양액의 대규모 단백질 발현을 확인하십시오. 이 대표 SDS page 결과는 강력한 단백질 발현과 약 50%의 용해도 및 약 50%의 절단 효율을 보여줍니다.본 사례에서는 히스티딘 태그와 함께, 원래의 컨스트럭트에 설계되어 추가되었던 단백질 용해성 태그를 제거하였습니다. 니켈 레진은 고유한 히스타민 태그가 부착된 표적 단백질을 천연 박테리아 단백질을 포함한 모든 다른 세포 물질로부터 분리하는 데 사용됩니다. 니켈 컬럼 하나를 준비하여 보관 버퍼를 제거하기 위해 4 컬럼 부피의 초순수로 세척한 후, 1 컬럼 부피의 버퍼 B와 5 컬럼 부피의 버퍼로 순차적으로 세척합니다.단백질 제조기를 사용하여 A 및 E 평형화 병렬화를 수행하며, 이는 여러 컬럼을 동시에 가동할 수 있습니다. 가용화된 히스티딘 태그 단백질이 포함된 각 정제된 용해물을 분당 2 mL의 속도로 각각의 컬럼에 로딩한 후, 버퍼 A로 컬럼 부피의 수 배만큼 세척하고, 통과액 버퍼를 수집하여 분석을 위해 보관합니다. 결합된 단백질을 버퍼 A와 B의 비율이 95:5, 60:40, 그리고 최종적으로 100% 버퍼 B인 일련의 단계적 구배(step gradient)로 용출합니다. 버퍼 B의 성분들이 니켈 레진에 대해 히스티딘과 경쟁하므로, 정해진 비율에 따라 단백질을 컬럼에서 제거하게 됩니다.각 용출 분획을 별도로 수집합니다. 니켈 컬럼에서 수행한 대표적인 크로마토그램 결과가 여기에 제시되어 있습니다. SDS page를 통해 니켈 컬럼 용출 분획, 조용해물(crude lysate), 정제 용해물(clarified lysate) 및 니켈 컬럼 통과액(flow through)을 분석하고, 이를 컬럼 정제 중에 측정된 280 nm에서의 UV 흡광도와 비교하십시오.이 단계에서는 정제가 성공적으로 이루어졌는지 확인합니다. 표적 단백질이 포함된 분획을 선택하고 모아 다음 처리 단계로 진행합니다. 모은 분획의 총 부피를 고려하고 280 nm에서 UV 흡광도를 측정하여, 해당 단백질의 이론적 소쇠 계수를 이용해 이 단계에서의 총 단백질 양을 계산합니다.분석을 위해 소량의 샘플을 따로 보관하십시오. 표적 단백질의 유전자는 ULP1이 절단 부위로 인식하는 특정 서열로 인코딩되었으므로, ULP1을 첨가하면 히스티딘 태그와 목적 단백질 사이가 절단됩니다. 이 절차를 시작하려면, 통합 분획액에 포함된 단백질 5 mg당 1 µL의 ubiquitin like protease, one을 첨가하십시오.이 단계에서 절단된 단백질을 투석 튜브를 사용하여 버퍼 B에서 버퍼 A로 옮겨 추가 처리를 진행하며, 교반하며 4°C에서 4시간 동안 2L의 버퍼 A로 단백질을 투석합니다. 투석 후 PB2에 대해 10 kilodalton 분자량 컷오프를 사용하십시오. ULP1의 존재 여부에 따라 표적 단백질의 SDS-PAGE 젤을 다시 실행합니다.이를 통해 ULP1 절단이 성공적으로 이루어졌는지 확인하고, 이후 공정에 사용할 최적의 분획을 선택할 수 있습니다. 여기에 중합효소 pb의 세 가지 구축물에 대한 대표적인 SDS page 결과가 제시되어 있습니다. 레인 1에는 두 종류의 서브유닛 분자량 마커가 있습니다.2, 6, 10번 레인은 니켈 1번 컬럼에서 풀링된 단백질입니다. 3, 7, 11번 레인은 니켈 2번 컬럼에서 버퍼 A를 사용하여 절단된 단백질의 플로우스루(flow through)를 포함하며, 4, 8, 12번 레인은 니켈 2번 컬럼에서 버퍼 B를 이용해 히스티딘 태그가 제거되었음을 보여줍니다.히스타민을 제거한 후, nickel two에서 얻은 통합 분획물을 농축합니다. SEC를 시작하려면 표적 단백질의 분자량에 따라 적절한 레진을 다시 선택해야 합니다. 이 경우, acere S 110 over 30 GL 컬럼을 사용하며, 5 mL 주사기를 이용하여 0.5 mL/min의 유속으로 200 mL의 SEC 버퍼로 평형화합니다. 샘플을 10 mL 샘플 루프에 로딩하고 SEC 컬럼 런을 시작합니다. 소량의 분획물을 수집하면서 280 nm에서 UV 흡광 크로마토그램을 모니터링합니다.모든 관련 SEC 분획물을 SDS page로 분석합니다. 단백질 결정화 시험의 표준 접근법은 증기 확산법을 이용한 sitting drop 방식으로 수행됩니다. 각 표적 단백질에 대해 초기 단계에서 두 개 이상의 sparse matrix 스크리닝을 설정하는 것이 일반적입니다.이 과정을 시작하려면 96-웰 컴팩트 주니어 결정화 플레이트의 각 리저버에 선택한 결정화 스크리닝의 각 조건별로 80 µL씩 미리 채웁니다. SEC 버퍼에 희석된 단백질 0.4 µL를 96개 웰 각각에 분주합니다. 그다음 결정화 스크리닝 용액 0.4 µL를 추가하여 각 웰의 드롭이 완전히 혼합되도록 합니다. 전체 플레이트를 크리스탈 클리어 실링 테이프로 덮어 모든 웰이 완전히 밀봉되었는지 확인합니다. 플레이트는 환경 진동이 없는 안정적인 장소의 16 °C에 보관합니다.향후 몇 주 동안 해부 현미경으로 단백질 결정화 여부를 주기적으로 확인하십시오. 단백질 결정이 나타나지 않으면, 수확 전 성공 확률을 높이기 위해 최종 드롭의 단백질 농도를 변경하고 다른 조건으로 새로운 플레이트를 설정하십시오. 수확을 시작하려면 액체 질소가 채워진 듀어(dewar) 내에서 ALS 스타일 퍽(puck)을 냉각하고 뚜껑으로 덮으십시오.표적 단백질 결정이 들어있는 웰을 덮고 있는 투명 테이프를 잘라 근처의 빈 웰로 옮깁니다. 해당 결정화 조건 용액 1.6 µL를 취해 에틸렌 글리콜 0.4 µL와 혼합합니다. 결정화 조건에 20% 에틸렌 글리콜이 포함된 용액은 단백질 결정을 보호하는 역할을 합니다.급속 냉각(cryo freezing) 과정 중에 현미경으로 결정을 분석하고, 루프의 내경이 결정의 최대 너비와 일치하도록 적절한 크라이오 루프(cryo loop)를 선택하여 수확하십시오. 크라이오 루프를 자성 결정 완드(magnetic crystal wand)에 부착하고, 웰 용액에서 결정을 직접 루프로 낚아 올립니다. 수확한 결정이 담긴 크라이오 루프를 즉시 동결 보호제(cryoprotectant)에 담근 후, LS 스타일 퍽(LS style puck)에 침전시키십시오.원하는 수의 결정이 얻어질 때까지 결정을 급속 동결하십시오. 수집이 완료되면, 퍽 완드를 사용하여 급속 동결된 결정이 담긴 퍽의 굽은 텅(tongue) 부위에 자석 덮개를 덮으십시오. 다음 단계를 위해 퍽을 뒤집으십시오.퍽 푸셔를 퍽에 나사로 고정한 다음, 퍽을 KU actor doer로 옮겨 덮개를 제거합니다. 퍽 안의 결정은 J Director 이미지 획득 소프트웨어를 이용한 X선 회절 분석 준비가 될 때까지 액체 질소조에서 냉동 상태로 유지합니다. 결정 스크리닝을 위해 빔 슬릿 0.5 degree, 검출기 거리 50 millimeters, 이미지 스텝 70 degree, 노출 시간 30 seconds로 파라미터를 설정하십시오.결정을 스크리닝하는 동안 이미지 획득 소프트웨어에서 캡처한 예시 스크린샷입니다. 중앙 패널은 대표 결정에서 관찰된 x-선 회절 패턴을 보여주며, 3차원 구조 결정에 필요한 완전한 데이터 세트를 얻기 위해 고해상도 이미지를 충분히 수집하였습니다. 본 영상에서 시연한 클로닝 및 단백질 정제 전략을 통해 14개의 정제된 PB two 샘플을 얻었으며, 그중 9개에서 회절 연구에 적합한 결정이 생성되었습니다. 자체 x-선 회절 데이터 세트는 9개의 컨스트럭트 중 5개에 대해 Rigaku Super Bright FRE plus 회전 양극 x-선 발생기를 사용하여 QK alpha 방사선으로 수집하였으며, 이 장비에는 Ossec Variax HF, HF optics 및 Saturn 944 plus CCD 검출기가 장착되어 있습니다.폴리머라제 PB 두 번째 서브유닛의 X선 회절 이미지가 여기에 제시되어 있습니다. 각 데이터 세트를 처리하여 PB 두 번째 서브유닛의 총 4가지 구조를 결정했습니다. 각 구조는 동료 검토를 거쳐 공공 액세스를 위해 단백질 구조 데이터 은행(Protein Data Bank)에 업로드되었습니다.이 그림은 결정학적 비대칭 단위 내 분자들의 리본 다이어그램을 보여줍니다. 4개의 PB2 구조 중, 2차 구조는 각각의 PDB 코드와 함께 무지개 패턴으로 색칠되어 있습니다. 이 표에는 본 비디오 논문에서 설명한 방법으로 분석한 인플루엔자 PB2 타겟의 결과 분석 내용이 제시되어 있습니다.유전자부터 구조 결정까지의 다중 표적 병렬 처리 파이프라인은 클로닝, 용해도 분석, 정제, 결정화, 그리고 구조 결정의 다섯 단계로 설명됩니다. 당사의 구조 생물학 파이프라인 결과물은 구조 기반 연구의 기초를 제공할 뿐만 아니라, 단백질 기능을 확인하기 위한 기능 분석이나, 약물 개발을 위한 새로운 출발점을 찾기 위해 MAR 또는 SPR을 이용한 신규 화합물의 생물물리학적 스크리닝과 같은 추가 연구에 활용됩니다. 이 기술과 함께 개발된 도구들은 구조 기반 약물 설계 등 발견 기반의 다양한 조사들을 수행할 수 있는 길을 열어주었으며, 이는 인류의 건강과 질병 치료에 지대한 영향을 미쳤습니다.이 영상을 시청하신 후, 다중 타겟 병렬 처리가 구조 결정의 성공률을 어떻게 크게 높일 수 있는지 충분히 이해하시게 될 것입니다. 구조 생물학 실험실에서의 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 실험 활동 중에는 항상 개인 보호구(PPE) 착용과 같은 적절한 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

multi-target-parallel-processing-approach-for-gene-to-structure

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

사전 mRNA의 과도 특성으로 인해, 그것은 분리하고 공부하기에 어려울 수...

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인플루엔자 바이러스는 호스트 세포 염색질과 협회들의 RNA 게놈을 복제. 여기서는 감염된 세포의 염색질에서 그대로 바이러스성 ribonucleoprotein 컴플렉스를 정화하는 방법을 제시한다. 바이러스 단지 투석을하는 것은 각각 서양 얼룩 및 단백질과 RNA 내용의 프라이머 확장명을 모두에 의해 분석할 수 있습니다.

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3DNA 소프트웨어 패키지, 분석 구축, 3 차원 핵산 구조를 시각화하는 기능을 갖춘 인기있는 다양한 생물 정보학 도구입니다. 이 문서에서는 각각의 구조 및 관련 구조의 앙상블에 모두 적용 3DNA에서 사용할 수있는 새로운 대중적인 기능의 하위 집합에 대한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

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이 비디오는 웰을 따라 그래디언트 어닐링 온도를 설정하는 프라이머의 어닐링 온도 최적화를 위한 그래디언트 중합효소 연쇄 반응을 보여줍니다. 다양한 어닐링 온도의 효과는 반응 조건을 최적화하는 데 도움이 되는 증폭된 산물의 수율에 의해 결정됩니다.

최적의 어닐링 온도를 결정하기 위한 그래디언트 중합효소 연쇄 반응

방법은 (연쇄상 구균 - Tactin) 수지가 공유 비스 (술포 숙신 이미 딜) 수베 (BS3)와 가교 수정 스트렙 타비 딘에 트윈 패 혈성 태그가 융합 단백질 및 특정 단지의 효율적인 정제에 설명되어 있습니다. 방법은 빠른 속도, 좋은 표적 단백질의 회수 및 고순도의 이점을 갖고, 질량 분석법에 의한 후속 분석과 호환된다.

한 단계 연쇄상-Tactin 수지 비스 (술포 숙신 이미 딜)로 가교 수베 (BS3)에 트윈 연쇄상 구균 - 태그 단백질과 그들의 단지의 정화

구 균 에서 탄수화물 기질 의무적인 단백질의 광범위 한 생 화 학적 및 구조 특성화를 수행 하기 위한 효율적인된 프로토콜 제공 됩니다.

탄수화물 전송 기질 바인딩 단백질 SP0092의 생 화 학적 및 구조적 특성

이 프로토콜에는 중요 한 단계 및 패치 클램프 후 단일 셀 다중 반전 녹음 방송 연쇄 반응 하는 데 필요한 조치 설명 합니다. 이 기술은 패치 클램프 기록 특징 하나의 세포에서 유전자의 미리 결정 된 집합 식 프로 파일을 분석 하는 간단 하 고 효과적인 방법입니다.

패치 클램프 후 단일 셀 다중 반전 녹음 방송 연쇄 반응

여기서, 우리는 짧은 합성 DNA 및 RNA 올리고뉴클레오티드 및 정제된 Pol II를 필요로 하는 RNA 폴리머라제 II(Pol II) 신장 복합체의 조립을 기술한다. 이들 복합체는 Pol II 신장 복합체와 관련된 전사체의 기본 공동 전사 처리를 연구하는 데 유용하다.

인공 RNA 폴리머라제 II 연신복합체 해부 공동 전사 RNA 처리 이벤트

생화학 분석과 결합된 단백질 결합 마이크로어레이(PBM) 실험은 DNA 프리마제의 결합 및 촉매 특성을 연결하며, 이는 템플릿 DNA에 RNA 프라이머를 합성하는 효소입니다. 고처리량 프리마제 프로파일링(HTPP)으로 지정된 이 방법은 다양한 효소의 DNA 결합 패턴을 밝히는 데 사용될 수 있다.

고처리량 프리마제 프로파일링을 사용하여 DNA 프리마제에 의한 DNA 서열 인식

현재 프로토콜은 표적을 검출하기 위해 빠른 3단계 압타머 기반 지수 증폭 분석의 사용을 보여줍니다. 샘플 준비, 신호 증폭 및 색상 현상은 카페인보다 테오필린의 존재를 인식하기 위해 이 시스템을 구현하기 위해 다룹니다.

3단계 G-Quadruplex 등온 지수 증폭 반응에 의해 촉진되는 Aptamer 기반 표적 검출

이 기사에서는 극저온 전자 단층 촬영을 사용하여 이미징된 인플루엔자 바이러스의 데이터 처리 및 혈구응집소 당단백질의 후속 서브 단층 촬영 평균화를 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 이미지 전처리부터 최종 모델 개선까지 단계별 데이터 처리를 다룹니다.

인플루엔자 바이러스의 극저온 전자 단층 촬영에서 혈구응집소의 서브나노미터 분해능 구조 결정

배우세요 인플루엔자 A PB2 중합효소 소단위의 구조 결정을 위한 다중 타겟 병렬 처리 방식을 통해 단백질 결정화 및 X선 회절 분석을 수행하는 방법입니다. 이 기술은 약물 개발을 위한 고품질 단백질 생산 효율성을 높입니다.

인플루엔자 중합 효소의 유전자에 대한 구조 결정 PB2 소단위를위한 멀티 타겟 병렬 처리 방식

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